Name: functional reconstitution and channel activity measurements of purified wildtype and mutant cftr protein
Uploaded: 2015-03-09T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein at JoVE.com

تعلن المؤلفين أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

1. تنقية CFTR ملاحظة: يرجى الاطلاع على جدول المواد والمعدات اللازمة لقائمة بالمعدات والمواد المستخدمة في هذا البروتوكول. ويوجد بروتوكول مفصلة لoverexpression من الإنسان WT-CFTR والمسوخ في S و نظام التعبير 9-الفيروسة العصوية 17،28. بإف?...

<ol>
	<li>Kim Chiaw, P., Eckford, P. D., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+into+the+mechanisms+underlying+CFTR+channel+activity,+the+molecular+basis+for+cystic+fibrosis+and+strategies+for+therapy.">Insights into the mechanisms underlying CFTR channel activity, the molecular basis for cystic fibrosis and strategies for therapy.</a> Essays Biochem. 50 (1), 233-248 (2011).</li><li>Bear, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+functional+reconstitution+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR).">Purification and functional reconstitution of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Cell. 68 (4), 809-818 (1992).</li><li>Cai, Z., Sohma, Y., Bompadre, S. G., Sheppard, D. N., Hwang, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+high-resolution+single-channel+recording+to+functional+studies+of+cystic+fibrosis+mutants.">Application of high-resolution single-channel recording to functional studies of cystic fibrosis mutants.</a> Methods Mol Biol. 741, 419-441 (2011).</li><li>Kerem, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+the+cystic+fibrosis+gene:+genetic+analysis.">Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis.</a> Science. 245 (4922), 1073-1080 (1989).</li><li>Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+defective+anion+transport+in+L+cells+expressing+recombinant+forms+of+CFTR.">Molecular basis of defective anion transport in L cells expressing recombinant forms of CFTR.</a> Hum Mol Genet. 2 (8), 1253-1261 (1993).</li><li>Mendoza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirements+for+efficient+correction+of+DeltaF508+CFTR+revealed+by+analyses+of+evolved+sequences.">Requirements for efficient correction of DeltaF508 CFTR revealed by analyses of evolved sequences.</a> Cell. 148 (1-2), 164-274 (2012).</li><li>Rabeh, W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correction+of+both+NBD1+energetics+and+domain+interface+is+required+to+restore+DeltaF508+CFTR+folding+and+function.">Correction of both NBD1 energetics and domain interface is required to restore DeltaF508 CFTR folding and function.</a> Cell. 148 (1-2), 150-163 (2012).</li><li>Aleksandrov, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Allosteric+modulation+balances+thermodynamic+stability+and+restores+function+of+DeltaF508.">Allosteric modulation balances thermodynamic stability and restores function of DeltaF508.</a> CFTR. J Mol Biol. 419 (1-2), 41-60 (2012).</li><li>Ramsey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+CFTR+potentiator+in+patients+with+cystic+fibrosis+and+the+G551D+mutation.">A CFTR potentiator in patients with cystic fibrosis and the G551D mutation.</a> N Engl J Med. 365 (18), 1663-1672 (2011).</li><li>Riordan, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+characterization+of+recombinant+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+from+Chinese+hamster+ovary+and+insect+cells.">Purification and characterization of recombinant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator from Chinese hamster ovary and insect cells.</a> J. Biol. Chem. 270 (28), 17033-17043 (1995).</li><li>Ryan, L., Rimington, T., Cant, N., Ford, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+protein+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Expression and purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator protein in Saccharomyces cerevisiae.</a> JoVE. (61), (2012).</li><li>Ostedgaard, L. S., Welsh, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Partial purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Biol Chem. 267 (36), 26142-26149 (1992).</li><li>Peng, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One-step+affinity+isolation+of+recombinant+protein+using+the+baculovirus/insect+cell+expression+system.">One-step affinity isolation of recombinant protein using the baculovirus/insect cell expression system.</a> Protein Expr Purif. 4 (2), 95-100 (1993).</li><li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+procedure+for+the+efficient+purification+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR).">A novel procedure for the efficient purification of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> Biochem J. 327 (1), 17-21 (1997).</li><li>Rosenberg, M. F., Kamis, A. B., Aleksandrov, L. A., Ford, R. C., Riordan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+crystallization+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR).">Purification and crystallization of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR).</a> J Biol Chem. 279 (37), 39051-39057 (2004).</li><li>Ramjeesingh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+reconstitution+of+epithelial+chloride+channel+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Purification and reconstitution of epithelial chloride channel cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> Methods Enzymol. 294, 227-246 (1999).</li><li>Sorscher, E. J., Sommerfelt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+recombinant+protein+derived+from+the+baculovirus+expression+system+using+glutathione+affinity+agarose.">Purification of recombinant protein derived from the baculovirus expression system using glutathione affinity agarose.</a> Methods Mol Biol. 3, 337-348 (1995).</li><li>Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+(CFTR)+potentiator+VX-770+(ivacaftor)+opens+the+defective+channel+gate+of+mutant+CFTR+in+a+phosphorylation-dependent+but+ATP-independent+manner.">Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner.</a> J Biol Chem. 287 (44), 36639-36649 (2012).</li><li>Alkhouri, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+and+properties+of+molecular+probes+for+the+rescue+site+on+mutant+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">Synthesis and properties of molecular probes for the rescue site on mutant cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Med Chem. 54 (24), 8693-8701 (2011).</li><li>Eckford, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VX-809+and+Related+Corrector+Compounds+Exhibit+Secondary+Activity+Stabilizing+Active+F508del-CFTR+after+Its+Partial+Rescue+to+the+Cell+Surface.">VX-809 and Related Corrector Compounds Exhibit Secondary Activity Stabilizing Active F508del-CFTR after Its Partial Rescue to the Cell Surface.</a> Chem Biol. 21 (5), 666-678 (2014).</li><li>Kim Chiaw, P., Wellhauser, L., Huan, L. J., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+chemical+corrector+modifies+the+channel+function+of+F508del-CFTR.">A chemical corrector modifies the channel function of F508del-CFTR.</a> Mol.Pharmacol. 78 (3), 411-418 (2010).</li><li>Verkman, A. S., Galietta, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chloride+channels+as+drug+targets.">Chloride channels as drug targets.</a> Nat Rev Drug Discov. 8 (2), 153-171 (2009).</li><li>Pasyk, S., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+interaction+of+a+small-molecule+modulator+with+G551D-CFTR,+a+cystic+fibrosis-causing+mutation+associated+with+severe+disease.">Direct interaction of a small-molecule modulator with G551D-CFTR, a cystic fibrosis-causing mutation associated with severe disease.</a> Biochem J. 418 (1), 185-190 (2009).</li><li>Norez, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determination+of+CFTR+chloride+channel+activity+and+pharmacology+using+radiotracer+flux+methods.">Determination of CFTR chloride channel activity and pharmacology using radiotracer flux methods.</a> J Cyst Fibros. 3 (2), 119-121 (2004).</li><li>Whitney, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+alginate+secretion+across+the+bacterial+outer+membrane.">Structural basis for alginate secretion across the bacterial outer membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (32), 13083-13088 (2011).</li><li>Islam, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proton-dependent+gating+and+proton+uptake+by+Wzx+support+O-antigen-subunit+antiport+across+the+bacterial+inner+membrane.">Proton-dependent gating and proton uptake by Wzx support O-antigen-subunit antiport across the bacterial inner membrane.</a> mBio. 4 (5), e00678-e00613 (2013).</li><li>Ramjeesingh, M., Conn, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+16.">Ch. 16.</a> Reliable Lab Solutions: Essential Ion Channel MethodsReliable Lab Solutions. , 337-357 (2010).</li><li>Wellhauser, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+small-molecule+modulator+interacts+directly+with+deltaPhe508-CFTR+to+modify+its+ATPase+activity+and+conformational+stability.">A small-molecule modulator interacts directly with deltaPhe508-CFTR to modify its ATPase activity and conformational stability.</a> Mol Pharmacol. 75 (6), 1430-1438 (2009).</li><li>Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+reconstitution+of+purified+human+Hv1+H++channels.">Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels.</a> J Mol Biol. 387 (5), 1055-1060 (2009).</li><li>Chang, X. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+kinase+A+(PKA)+still+activates+CFTR+chloride+channel+after+mutagenesis+of+all+10+PKA+consensus+phosphorylation+sites.">Protein kinase A (PKA) still activates CFTR chloride channel after mutagenesis of all 10 PKA consensus phosphorylation sites.</a> J. Biol. Chem. 268 (15), 11304-11311 (1993).</li><li>Gadsby, D. C., Nairn, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+CFTR+Cl-+ion+channels+by+phosphorylation+and+dephosphorylation.">Regulation of CFTR Cl- ion channels by phosphorylation and dephosphorylation.</a> Adv.Second Messenger Phosphoprotein Res. 33, 79-106 (1999).</li><li>Li, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATPase+activity+of+the+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator.">ATPase activity of the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator.</a> J Biol Chem. 271 (45), 28463-28468 (1996).</li><li>Ma, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thiazolidinone+CFTR+inhibitor+identified+by+high-throughput+screening+blocks+cholera+toxin-induced+intestinal+fluid+secretion.">Thiazolidinone CFTR inhibitor identified by high-throughput screening blocks cholera toxin-induced intestinal fluid secretion.</a> J Clin Invest. 110 (11), 1651-1658 (2002).</li><li>Kopeikin, Z., Sohma, Y., Li, M., Hwang, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=On+the+mechanism+of+CFTR+inhibition+by+a+thiazolidinone+derivative.">On the mechanism of CFTR inhibition by a thiazolidinone derivative.</a> J Gen Physiol. 136 (6), 659-671 (2010).</li><li>Wang, X. F., Reddy, M. M., Quinton, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+a+new+cystic+fibrosis+transmembrane+conductance+regulator+inhibitor+on+Cl-+conductance+in+human+sweat+ducts.">Effects of a new cystic fibrosis transmembrane conductance regulator inhibitor on Cl- conductance in human sweat ducts.</a> Exp Physiol. 89 (4), 417-425 (2004).</li></ol>

كان هناك عدد محدود من بروتوكولات تنقية لكامل طول والوظيفية العزلة CFTR، من مجموعة متنوعة من أنظمة overexpression الخلوية. الطريقة الموصوفة هنا هو مفيد لأنه يسمح تنقية السريع لWT-CFTR أو تخصيب عال من F508del- وG551D-CFTR بكميات معتدلة غير وظيفية للغاية في المقايسات بما في ذلك أتباز والقي?...

وبوساطة وسائل النقل كلوريد عبر الأغشية قمية من الخلايا الظهارية في مثل هذه الأنسجة كما الغدد الرئة والأمعاء والبنكرياس والعرق في المقام الأول من قبل التليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم (CFTR)، وهو ATP- وعضو التنظيم الفسفرة من ABC (ATP- ملزمة كاسيت) C فصيلة من البروتينات الغشاء (مراجعة في 1). مثل أعضاء آخرين من فصيلة ABCC، CFTR هو كبير ومتعددة تمتد من البروتين الغشاء لا يتجزأ التي تربط ATP في موقعين ملزمة النوكليوتيدات شكلت في واجهة من المجالات ملزم النوكليوتيدات لها (NBDs)، حيث أنها تمتلك النشاط أتباز متواضع في واحد الموقع. ومع ذلك، على عكس أعضاء آخرين فصيلة ABCC، تطورت CFTR كقناة الكلور المنظمة فريدة بدلا من أن يكون نقل المذاب النشط. الطفرات في CFTR سبب التليف الكيسي، وهو مرض يصيب أجهزة متعددة بما في ذلك الرئتين والجهاز الهضمي والبنكرياس والجهاز التناسلي، مما يؤدي إلى مرضيdity والوفيات في البالغين الصغار. حسابات أمراض الرئة عادة لالوفاة المبكرة في التليف الكيسي وفي معظم الحالات الناجمة عن فقدان وظيفة CFTR على ظهارة سطح الشعب الهوائية إجراء. عدم وجود CFTR نشاط قناة كلوريد يسبب انخفاضا في كل من الكلور - وحركة المياه عبر البشرة السطحية لتعديل طبقة السائل على سطح قمية من ظهارة مهدبة الجهاز التنفسي. وهذا يؤدي في سائل لزج سطح مجرى الهواء أن يضعف من قدرة الخلايا الظهارية في الجهاز التنفسي مهدبة لمسببات الأمراض واضحة على نحو فعال من الشعب الهوائية. ونتيجة لذلك، فإن معظم المرضى الذين يعانون من نوبات CF المتكررة من التهاب في الرئتين وتلف الرئتين بسبب التهاب. كما هو متوقع، ركزت دراسات لآلية عمل البروتين CFTR العادي في المقام الأول على دراسات مفصلة الكهربية من النشاط قناة النابضة به. وقد أظهرت الدراسات قناة واحدة مباشرة أن وظائف CFTR باعتباره PKA التي تعتمد على الكلور- القناة التي تمتلك بوابة للتنظيم ATP 2. وتوفر دراسات الكهربية مفصلة على قدر كبير من المعلومات عن قنوات CFTR واحدة 1،3، ولكن قد يكون هناك قلق حول ما إذا كانت الخصائص في أي قناة واحدة خاصة أن تمت دراستها هي انعكاس للسكان قنوات CFTR وبالتالي فإن قناة واحدة ينبغي النظر دائما النتائج جنبا إلى جنب مع أساليب لدراسة السكان العيانية. الفحص المباشر للنشاط قناة سكان CFTR تنقيته لديه القدرة على توفير نظرة ثاقبة على عيب الجزيئية المرتبطة الطفرات المسببة للأمراض ودفع اكتشاف جهري الكيميائية التي إصلاح البروتينات CFTR متحولة. حتى الآن، هناك ما يزيد على 1،900 طفرات مختلفة في CFTR يعتقد أن تسبب التليف الكيسي 4. الطفرة الكبرى، F508del-CFTR، وجدت على أليل واحد على الأقل في ما يقرب من 90٪ من المرضى في أمريكا الشمالية وأوروبا يؤدي إلى بروتين misfolding لالاحتفاظ الثانية في الشبكة الإندوبلازمية 5. لديها F508del-CFTR أيضا عواقب أخرى، بما في ذلك النشاط المعيبة قناة 6-9. ويرتبط غياب الناتجة من CFTR من سطح الخلية مع المرض الشديد. G551D-CFTR، طفرة أقل شيوعا، ويعتقد أن تكون مطوية بعد غير مختلة كقناة كلوريد على سطح الخلية 6 بشكل صحيح. تطوير المصححين جزيء صغير وpotentiators لديه هدف تصحيح قابلة للطي و / أو الاتجار المسوخ مثل F508del-CFTR إلى سطح الخلية، وبالتالي يؤدي إلى زيادة نشاط أو قناة من الطفرات مثل G551D عندما موجودة على سطح الخلية، على التوالي . في حين أن المصححين VX-809 وVX-661 (لا يتم بعد الموافقة عليها لاستخدامها في المرضى، وpotentiator Kalydeco (ivacaftor، VX-770) يتم استخدامه عند 150 ملغ كل 12 ساعة في المرضى الذين CF&gt; 6 سنوات مع واحد على الأقل G551D طفرة -CFTR، ومؤخرا للمرضى مع واحدة من G178R، S549N، S549R، G551S، G1244E، S1251N، S1255PوG1349D. Kalydeco على حد سواء آمنة والنتائج في تحسين التدابير السريرية للمرض CF 10، إلا أن آلية عمل هذا الجزيء الصغير وغير مفهومة في وقت موافقة ادارة الاغذية والعقاقير للاستخدام في المرضى. وقد وصفت حفنة من طرق تنقية CFTR سابقا 2،11-18، وكثير منها يتطلب فترة طويلة من الوقت لإكمال. في منشور صدر مؤخرا 19، وقد وصفت لتنقية وإعادة السريع طريقة فريدة لCFTR overexpressed في 9 خلايا S و نظام التعبير، وكان يستخدم هذا البروتين النقي في أنظمة الدهون محددة لتطوير CFTR هاليد النشاط قناة فحص لعدد سكانها CFTR الجزيئات. الفحص يلخص آثار معروفة من الفسفرة، النيوكليوتيدات ومثبطات على وظيفة CFTR. تم استخدام نظام لاستجواب آثار potentiator VX-770 / Kalydeco على Wt- (البرية من نوع)، وقد تبين F508del- وG551D-CFTR وذلك لأولالوقت أن الدواء يتفاعل مباشرة مع البروتين CFTR لتحفيز النشاط قناتها بطريقة ATP-مستقلة، مما يدل على المرافق العامة وتطبيق هذه الأساليب لدراسة تفاعل CFTR والمسوخ مع النيوكليوتيدات والجزيئات الصغيرة من منظور السكان ل الإجابة على الأسئلة ذات الصلة سريريا عن البروتين. كما تم استخدام أساليب لدراسة الجزيئات الأخرى potentiator ومشتقاتها 20، فضلا عن الآثار المترتبة على مصحح جزيء صغير على نشاط البروتين 21. وقد استخدمت المقايسات هروب رأس المال في العديد من الدراسات سابقا للتحقيق في نشاط المسوخ CFTR وآثار المركبات CFTR-تغييري على نشاطها، بما في ذلك المقايسات خلية كاملة باستخدام الأقطاب، استشفاف المشعة وfluorophores 22،23، الحويصلات الغشاء مع أيون أقطاب انتقائية 24 وتنقيته CFTR تشكيلها مع استشفاف المشعة 25. ومع ذلك ثوذكر استخدام (ه) من أيون أقطاب انتقائية لدراسة تنقية CFTR تشكيلها مؤخرا لأول مرة 19. وقد استخدم للتكيف من الطريقة الحالية لإعادة تشكيل وتوصيف وظيفي لاثنين من البروتينات الغشاء في الزائفة الزنجارية، الممرض CF المشترك. واستخدمت إعادة تشكيل تنقية AlgE بروتين الغشاء الخارجي إلى جانب قياسات هروب رأس المال يوديد لدعم نموذجا لإفراز الجينات أنيوني من خلال هذا نقل 26. طبقت إعادة والقياسات هروب رأس المال يوديد للبروتين Wzx النقي، والذي سمح نموذجا لأن اقترح أن يشير إلى وجود H + آلية تنادل متعاكس معتمد على لالمرتبطة الدهون قليل السكاريد النبات عبر الغشاء الداخلي للبكتيريا عن طريق هذا البروتين 27. في كلتا الحالتين كان يستخدم يوديد كبديل للالركيزة أنيوني، وإن كان أقل سرعة مما قد يتوقع المرء لالركيزة الأم. طريقة قد تكون مناسبة للتكيف مع بروتينات أخرى مع جالنقل أو التوصيل مسارات ationic لركائز الأيونية. هنا يوصف إجراء تنقية السريع للبروتين CFTR وإعادة حيز proteoliposomes من الدهون محددة. يمكن بسهولة إجراء إعادة السريع تكون مصممة للاستخدام مع CFTR تنقيته بواسطة طرق أخرى، شريطة أن يكون نوع من المنظفات المستخدمة في تنقية هو قابل للإزالة من قبل الأساليب المستخدمة هنا أو يمكن تبادل لالمنظفات مناسب قبل إجراء إعادة. يتم وصف طريقة هروب رأس المال يوديد لقياس النشاط قناة النقي وإعادة تشكيل البروتين CFTR بالتفصيل ويتم عرض بعض النتائج النموذجية التي يمكن الحصول عليها من هذا الأسلوب.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1269">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:403px;">fos-choline 14 detergent</td>
			<td style="width:515px;">Anatrace Affymetrix (www.anatrace.affymetrix.com)</td>
			<td style="width:145px;">F312</td>
			<td style="width:207px;">Affymetrix: Anatrace Products; CAS#&#160;:77733-28-9</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cOmplete EDTA-free protease inhibitor cocktail tablets</td>
			<td>Roche (www.roche-applied-science.com)</td>
			<td>04 693 132 001</td>
			<td>EDTA-free Protease inhibitor cocktail tablets (1 in 50 ml or mini:1 in 10 mL) (Roche Diagnostics GmbH; Ref: 11873 580 001</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cOmplete ULTRA Tablets, Mini, EDTA-free, EASYpack&#160;</td>
			<td>Roche (www.roche-applied-science.com)</td>
			<td>05 892 791 001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ni-NTA Agarose</td>
			<td>Qaigen GmbH</td>
			<td align="right">1018240</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Fisherbrand Screening columns</td>
			<td>Fisher Healthcare</td>
			<td>11-387-50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amicon Ultra Centrifugal filters, Ultracel-100K</td>
			<td>Millipore (www.millipore.com)</td>
			<td>UFC910008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">cAMP-Dependent Protein Kinase A (PKA), Catalytic Subunit</td>
			<td colspan="2">New England Biolabs (www.neb.com/products/p6000-camp-dependent-protein-kinase-pka-catalytic-subunit)</td>
			<td>Peirce PKA is also suitable</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PC, Chicken Egg</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td>
			<td>840051C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">POPC</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td>
			<td>850457C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PS, Porcine Brain</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td>
			<td>840032C</td>
			<td>(CFTR has been successfully reconstituted into Egg PC, POPC, 2:1 (w/w) Egg PC:POPC, or a mixture of PE:PS:PC:ergosterol, 5:2:2:1 (w/w))</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PE, Chicken Egg</td>
			<td>Avanti Polar Lipids (www.avantilipids.com)</td>
			<td>841118C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ergosterol</td>
			<td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td align="right">45480</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Pierce Detergent removal spin column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td align="right">87779</td>
			<td>1 ml capacity columns</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">valinomycin</td>
			<td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td>
			<td>V-0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">VX-770 (ivacaftor)</td>
			<td>Selleck Chemicals</td>
			<td>S1144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">iodide selective microelectrode</td>
			<td>Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/microionn.tam)</td>
			<td>LIS-146ICM</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Clampex 8.1 software</td>
			<td>Axon Instruments (www.axon.com)</td>
			<td></td>
			<td>we use components of the ClampX system with a home made filter to monitor and record the response to our electrode</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Alternate Software: ArrowLabb System&#160;</td>
			<td>Lazar Research Laboratories (www.shelfscientific.com/cgi-bin/tame/newlaz/ionsystems.tam)</td>
			<td>LIS-146LICM-XS</td>
			<td>Lazar Research sells a meter that can interface with a computer and software to record the probe response.&#160; This software should serve a similar function to our setup</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">small stir bars</td>
			<td>Big Science Inc (www.stirbars.com)</td>
			<td>SBM-0502-CMB</td>
			<td>choose a stir bar small enough to easily fit into a well of a 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sephadex G50, fine</td>
			<td>GE Health Care (www.gelifesciences.com)</td>
			<td>17-0042-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Sonicator</td>
			<td>Laboratory Supplies Co, Inc.</td>
			<td>G112SP1G</td>
			<td>Bath sonicators from other manufacturers should also be suitable</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

functional reconstitution and channel activity measurements of purified wildtype and mutant cftr protein

والتليف الكيسي عبر الغشاء المواصلة منظم (CFTR) هو عضو لتشكيل قناة فريد من ATP ملزم كاسيت (ABC) الفصيلة من الناقلين. وقد النشاط قناة الفسفرة والنوكليوتيدات كلوريد يعتمد في كثير من الأحيان من CFTR درس في نظم خلية كاملة وكقنوات واحدة في بقع غشاء استئصاله. وقد تبين أن العديد من الطفرات المسببة للالتليف الكيسي لتغيير هذا النشاط. في حين تم نشر عدد قليل من بروتوكولات تنقية، وهي طريقة إعادة سريع أن يحتفظ النشاط القناة وطريقة مناسبة لدراسة النشاط قناة السكان في نظام تنقية تم متوفرة. يتم وصف طرق السريعة هنا لتنقية وإعادة الوظيفية للبروتين CFTR طول كامل في proteoliposomes من يعرف تركيبة الدهون التي تحتفظ النشاط كقناة هاليد المنظمة. هذه الطريقة إعادة جنبا إلى جنب مع مقايسة على أساس تدفق رواية النشاط قناة هو نظام مناسب لدراسة خصائص قناة السكان من النوع البري CFTR والمسببة للأمراض المسوخ F508del- وG551D-CFTR. على وجه التحديد، والطريقة لها فائدة في دراسة الآثار المباشرة للالفسفرة، النيوكليوتيدات والجزيئات الصغيرة مثل potentiators ومثبطات على النشاط قناة CFTR. الطرق هي أيضا قابلة للدراسة أخرى قنوات غشاء / نواقل للركائز الأيونية.

الموضحة في هذا الكتاب مكتوبة هي وسائل لتنقية، إعادة تشكيل وقياس النشاط قناة المنظم من البروتين CFTR الشكل يظهر 1A سير العمل لتنقية، وإجراءات إعادة هروب رأس المال يوديد. وتظهر أساليب لإعادة النشاط وقناة القياسات بواسطة تدفق يوديد أيضا بمزيد من التفصي?...

Watch this Scientific Journal Video about Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein at JoVE.com

Functional Reconstitution and Channel Activity Measurements of Purified Wildtype and Mutant CFTR Protein

الموصوفة هنا هو إجراء سريع وفعال لإعادة الوظيفية للتنقية من النوع البري والبروتين CFTR الطافرة التي تحافظ على نشاط لهذه القناة كلوريد، وهو عيب في التليف الكيسي. هروب رأس المال من يوديد proteoliposomes تشكيلها بوساطة CFTR يسمح دراسات النشاط قناة وآثار جزيئات صغيرة.

إعادة إعماره الوظيفية وآخر قناة قياسات تنقية Wildtype والمسخ CFTR البروتين

The Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator (CFTR) is a unique channel-forming member of the ATP Binding Cassette (ABC) superfamily of ...

Research

JoVE Journal

Biology

Staining of Proteins in Gels with Coomassie G-250 without Organic Solvent and Acetic Acid

تلطيخ من البروتينات في الهلام مع Coomassie G - 250 دون عضوي حمض الخليك والمذيبات

In classical protein staining protocols using Coomassie Brilliant Blue (CBB), solutions with high contents of toxic and flammable organic solvents ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Biochemical Reconstitution of Steroid Receptor&#x2022;Hsp90 Protein  Complexes and Reactivation of Ligand Binding

إعادة إعماره البيوكيميائية من مستقبلات البروتين الستيرويد • المجمعات Hsp90 وإعادة تنشيط يجند تجليد

Hsp90 is an essential and highly abundant molecular chaperone protein that has been found to regulate more than 150 eukaryotic signaling proteins, ...

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron (dgn)-destabilized Green Fluorescent Protein (GFP)-based Reporter Protein

Monitoring of Ubiquitin-proteasome Activity in Living Cells Using a Degron dgn-destabilized Green Fluorescent Protein GFP-based Reporter Protein

رصد اليوبيكويتين-proteasome نشاط في الخلايا الحية باستخدام Degron (DGN)-زعزعة استقرار الأخضر نيون البروتين البروتين مراسل (GFP) على أساس

Proteasome is the main intracellular organelle involved in the proteolytic degradation of abnormal, misfolded, damaged or oxidized proteins 1, 2. ...

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

تطبيق MassSQUIRM لقياسات كمية من نشاط Demethylase ليسين

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein (GST-RhoA(G17A)) from Epithelial Cell Lysates

Affinity Precipitation of Active Rho-GEFs Using a GST-tagged Mutant Rho Protein GST-RhoAG17A from Epithelial Cell Lysates

تقارب الأمطار من GEFs-رو بالموقع باستخدام ضريبة السلع والخدمات الموسومة البروتين رو المسخ (GST-RhoA (G17A)) من Lysates الخلايا الظهارية

Proteins of the Rho family of small GTPases are central regulators of the cytoskeleton, and control a large variety of cellular processes, including cell ...

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

In Vitro Analysis of PDZ-dependent CFTR Macromolecular Signaling Complexes

في تحليل المختبر من PDZ التي تعتمد على المجمعات ضخم الجزيئات CFTR اشارة

Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR), a chloride channel located primarily at the apical membranes of epithelial cells, plays a ...

Reconstitution of a Kv Channel into Lipid Membranes for Structural and Functional Studies

إعادة تشكيل قناة كيلو فولت في الأغشية الدهنية للدراسات الهيكلية والوظيفية

To study the lipid-protein interaction in a reductionistic fashion, it is necessary to incorporate the membrane proteins into membranes of well-defined ...

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

In Vitro Reconstitution of Light-harvesting Complexes of Plants and Green Algae

في المختبر إعادة تشكيل مجمعات خفيفة حصاد النباتات والطحالب الخضراء

In plants and green algae, light is captured by the light-harvesting complexes (LHCs), a family of integral membrane proteins that coordinate chlorophylls ...

Probing High-density Functional Protein Microarrays to Detect Protein-protein Interactions

التحقيق عالية الكثافة ميكروأرس البروتين وظيفية لكشف البروتين البروتين التفاعلات

High-density functional protein microarrays containing ~4,200 recombinant yeast proteins are examined for kinase protein-protein interactions using an ...