Name: development of inhibitors of protein-protein interactions through replace: application to the design and development non-atp competitive cdk inhibitors
Uploaded: 2015-10-26T14:00:00
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We thank Dr&#8217;s. Douglas Pittman and Michael Wyatt for their assistance with cell culture and Dr Wyatt and Ms. Erin Anderson for help in development of the binding assays. We acknowledge Mike Walla and Bill Cotham in the Department of Chemistry and Biochemistry at the University of South Carolina for assistance with Mass Spectrometry, Helga Cohen and Dr. Perry Pellechia for NMR spectrometry. This work was funded by the National Institutes of Health through the research project grant, 5R01CA131368.

1. Identificação Computacional de Moléculas Pequenas Potencial Capping Grupos Nota: Em princípio, uma variedade de acoplamento ou farmacofóricos métodos de pesquisa podem ser utilizados para prever potenciais grupos de protecção. O principal objectivo dos estudos de substituição é computacionais para identificar pequenas moléculas que retêm as características e as interacções dos aminoácidos que são substituídos. <ol><li> Validação do protocolo LigandFit encaixe 1...

<ol>
	<li>Andrews, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REPLACE:+a+strategy+for+iterative+design+of+cyclin-binding+groove+inhibitors.">REPLACE: a strategy for iterative design of cyclin-binding groove inhibitors.</a> Chembiochem. 7, 1909-1915 (2006).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+Non-ATP+Competitive+CDK/Cyclin+Groove+Inhibitors+through+REPLACE-Mediated+Fragment+Assembly.">Optimization of Non-ATP Competitive CDK/Cyclin Groove Inhibitors through REPLACE-Mediated Fragment Assembly.</a> J Med Chem. 56, 1573-1582 (2013).</li><li>McInnes, C., Bernstein, M., Desai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+29.">Chapter 29.</a> Annual Reports in Medicinal Chemistry. 47, 459-474 (2012).</li><li>Bower, J. F., Pannifer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+fragment-based+technologies+to+target+protein-protein+interactions.">Using fragment-based technologies to target protein-protein interactions.</a> Curr Pharm Des. 18, 4685-4696 (2012).</li><li>Makley, L. N., Gestwicki, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+number+of+'druggable'+targets:+non-enzymes+and+protein-protein+interactions.">Expanding the number of 'druggable' targets: non-enzymes and protein-protein interactions.</a> Chemical biology, and drug design. 81, 22-32 (2013).</li><li>Walensky, L. D., Bird, G. 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M., Jiang, X., Oldfield, T., Waldman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LigandFit:+a+novel+method+for+the+shape-directed+rapid+docking+of+ligands+to+protein+active+sites.">LigandFit: a novel method for the shape-directed rapid docking of ligands to protein active sites.</a> J Mol Graph Model. 21, 289-307 (2003).</li><li>Mendoza, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+cyclin-dependent+kinase+2/cyclin+A+antagonists+that+differ+from+ATP+site+inhibitors+block+tumor+growth.">Selective cyclin-dependent kinase 2/cyclin A antagonists that differ from ATP site inhibitors block tumor growth.</a> Cancer Res. 63, 1020-1024 (2003).</li><li>Denizot, F., Lang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+colorimetric+assay+for+cell+growth+and+survival.+Modifications+to+the+tetrazolium+dye+procedure+giving+improved+sensitivity+and+reliability.">Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability.</a> J Immunol Methods. 89, 271-277 (1986).</li><li>Zheleva, D. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highly+potent+p21(WAF1)-derived+peptide+inhibitors+of+CDK-mediated+pRb+phosphorylation:+delineation+and+structural+insight+into+their+interactions+with+cyclin+A.">Highly potent p21(WAF1)-derived peptide inhibitors of CDK-mediated pRb phosphorylation: delineation and structural insight into their interactions with cyclin A.</a> The journal of peptide research : official journal of the American Peptide Society. 60, 257-270 (2002).</li><li>Ivanov, A. A., Khuri, K. F. 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P., Winter, A., Blundell, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+biology+and+drug+discovery+for+protein-protein+interactions.">Structural biology and drug discovery for protein-protein interactions.</a> Trends Pharmacol Sci. 33, 241-248 (2012).</li><li>Cannon, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pharmaceutics+and+drug+delivery+aspects+of+heme+and+porphyrin+therapy.">Pharmaceutics and drug delivery aspects of heme and porphyrin therapy.</a> J Pharm Sci. 82, 435-446 (1993).</li></ol>

Targeting protein-protein interactions (PPI) in drug discovery is highly challenging as these typically involve a large shallow contact interface comprised of numerous and diffuse contacts19. Furthermore, peptidic compounds which inhibit PPI&#8217;s that are amenable to drug discovery are problematic due to their higher molecular mass, metabolic instability and poor bioavailability20. Current strategies that have been applied for the development of PPI inhibitors include design of proteomimetics and...

Neste artigo, um estudo de caso de aplicação do REPLACE (substituição por alternativas ligando parciais utilizando computacional enriquecimento) estratégia para converter inibidores peptídicos de interações proteína-proteína em mais moléculas farmacologicamente relevantes é descrito 1-3. Enquanto IBP representam uma fonte rica, mas ainda não devidamente explorado de alvos potenciais da droga, metodologias existentes são largamente insuficientes para fazer estes amplamente acessível. As estratégias atuais, incluindo fragmento baseado projeto 4, de alto throughput screening 5 e 6 peptídeos grampeados ter fornecido avanços, porém estes são, em muitos casos ineficaz. Como resultado, mais progresso e abordagens mais eficazes são necessárias. SUBSTITUIR foi completamente validado no desenvolvimento de inibidores de cinase que têm propriedades semelhantes a fármacos melhoradas e têm potencial para o desenvolvimento como agentes terapêuticos anti-tumorais. Esta estratégia é exemplificada para o desenvolvimento de inibidores não-ATP das célulasCDKs ciclo e envolve os seguintes: 1) a obtenção de informações estruturais 3D sobre as interações de HAKRRLIF / RRLIF com sulco de ligação da ciclina; 2) determinar os determinantes de ligação importantes para a interacção péptido; 3) truncamento do péptido N-terminal contendo um ou mais determinantes de ligação; 4) identificação computacional de alternativas potenciais de pequenas moléculas (ligandos alternativas parciais, Plas) para a parte truncada do péptido e que retêm as interacções chave do peptideo de origem; 5) síntese ou de fonte comercial de Plas previsto para se ligar avidamente com o sub local previamente ocupado pelo resíduo (s) péptido suprimido; 6) síntese de lança através de ligadura dos melhores PLAs ao péptido truncado utilizando síntese de fase sólida; 7) Os testes de flips em uma ligação in vitro ou ensaios funcionais (polarização de fluorescência no contexto / ciclina CDK) seguido por posterior caracterização de um ensaio de viabilidade celular. Uma representação esquemática de REPLACE strategY é mostrado na Figura 1. Neste artigo, iterações da estratégia de substituição são discutidos e a aplicação de CDK2 / ciclina A descrito em detalhe. CDKs são acreditados para ser directa ou indirectamente desreguladas na maioria dos tumores e, portanto, são consideradas alvos de drogas cancerosas apropriado 7. CDKs requerem associação com cyclins para ativação completa e posteriormente fosforilam proteínas-chave envolvidas na regulação do ciclo celular 8. Os dois grandes grupos de CDKs são os isotipos que controlam os pontos de verificação do ciclo celular [G1 / S (CDK4 / ciclina D, CDK6 / ciclina D e CDK4 / ciclina E), fase S (CDK2 / ciclina A) e G2 / M (CDK1 / ciclina B)] e os reguladores de RNA polimerase através de fosforilação (CDK7 / ciclina H, CDK8 / ciclina C, CDK9 / ciclina T). Um passo fundamental na progressão da fase S ocorre quando o factor de transcrição E2F1 forma um complexo com a proteína DP, que, em seguida, liga-se ao ADN e inicia a transcrição do gene. CDK2 / ciclina A é necessária para neutralizar E2F1 transcricionalactividade através da fosforilação conduzindo assim à libertação do complexo de E2F1-DP e sua subsequente degradação. A inibição de CDK2 / ciclina A é acreditado para manter E2F1 no seu estado ligado ADN conduzindo à activação persistente. O nível resultante de E2F-1 atividade irá superar o limiar necessário para induzir a apoptose independente de p53, portanto, sugerindo uma estratégia terapêutica. Devido à p53 desregulado e vias pRb, níveis elevados de E2F-1 que ocorrem frequentemente em células de cancro e inibição de CDK2 / ciclina A deve conduzir à apoptose selectiva em tumores e pode ser considerada como um alvo cancro validado 7. Clinicamente inibidores de CDK investigados alvo o sítio de ligação ATP altamente conservada levando a atravessar reatividade entre os mais de 500 proteínas cinases na kinome humano e potencialmente dar origem a efeitos colaterais e toxicidade 9. Uma abordagem alternativa é-ATP não inibição competitiva, visando o recrutamento de substrato através da CBGpresente na subunidade reguladora positiva ciclina e que é, portanto, distinta e distante da ATP site de 10,11 vinculativo. O CBG é principalmente uma ranhura hidrófobo presente na ciclina A, ciclina D e ciclina E e foi mostrado para reconhecer uma sequência de consenso encontradas em substratos e supressores tumorais. Como um péptido isolado, a ligação da ciclina motivo (CBM) se liga ao CBG e tem sido demonstrado que inibem a actividade da cinase das CDKs do ciclo celular. O CBM foi optimizado para um octapéptido (HAKRRLIF, CDK2 / ciclina A IC50 de 0,07 ± 0,02 ^ M, CDK4 / ciclina D, IC50 0,88 ± 0,34 uM) e, além disso, truncada para um pentapéptido que representa um bom compromisso entre o peso molecular para a droga semelhança e a potência (RRLIF, CDK2 / ciclina A IC 50 1,01 ± 0,17 ^ M, CDK4 / ciclina D, IC 50 25,12 ± 2,97 uM) 12,13. Os CBGS consistem em um grande primária e secundária bolsa hidrofóbica menores que são colmatadas por um ACIDIc região (inclui Glu220, Glu224 e Asp283). Os principais determinantes de ligação de HAKRRLIF incluem a interacção de Ala2 com bolsa hidrofóbica secundário, de emparelhamento de iões de hidrogénio e ligações de Lys3, Arg Arg5 4 e com a região acídica e um elevado grau de complementaridade das Leu6 e Phe8 com o local primário lipofílico. Além disso, numerosas ligações de hidrogénio são contribuídos a partir do esqueleto do péptido enquanto Ile7 actua como um resíduo espaçador que permite um contacto óptimo com o bolso primário. O modo de ligação e interacções de HAKRRLIF com CBG é mostrado na Figura 2. A segmentação da interacção proteína-proteína CBM / CBG irá inibir a actividade da quinase de CDK2 / ciclina A, a CDK2 / ciclina E e CDK4 / ciclina D e esta deve desencadear apoptose mediada E2F1 de células cancerosas enquanto as células normais que não afectam 7. Embora CBM péptidos derivados são inibidores eficazes de CDKs do ciclo celular, é improvável que sejam úteis como fármacos, devido à sua metabólicainstabilidade e falta geral de permeabilidade celular. Para este fim, temos aplicado a estratégia REPLACE, a fim de converter esses inibidores peptídicos potentes em mais compostos droga-como para a prossecução do desenvolvimento de terapias anti-tumorais que exploram E2F1 desregulamentado por meio de CDK2 / ciclina A inibição. O protocolo a seguir resume o trabalho que foi concluído na aplicação do REPLACE para a ranhura de ciclina. No primeiro exemplo, foram identificados grupo terminal substituições semelhantes a fármacos para o tetrapéptido N-terminal de HAKRRLIF. Além disso melhorias nestes grupos foram investigados em um estudo de validação adicional para REPLACE. Também são apresentados os resultados obtidos nestes estudos representativos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Computational Chemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accelyrs Discovery studio 3.0</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dell Optiplex Workstations</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Synthetic Organic Chemistry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silica gel (GF-254 plates) for TLC, Biotage (Uppsala, Sweden) for flash chromatography, Waters Alliance 2695 HPLC with a 2996 diode-array detector and equipped with a C18 (2) 100 A, 250 x 4.6mm, 5&#956;m column (Phenomenox Luna) for purity determination, 1H NMR and 13C NMR spectra were recorded with a Varian Mercury 300 and 400 Spectrometer, respectively. Mass spectra were measured with a Micromass QTOF (Tandem quadruple-1 time of flight mass spectrometer), electrospray ionization (ESI) and VG 70S (Double-focusing magnetic sector mass spectrometer, EI).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flourescence Polarization Assay</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384 micro well plates, ,&#160; Micro pipets,&#160;</td>
			<td>Grenier Bio-one</td>
			<td>110256602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CDK4D1 and CDK2CA (well purified recombinant human kinase complex)</td>
			<td>BPS Bio Sciences</td>
			<td>40094(CDK4/Cyclin D), 41101(CDK2/Cyclin A)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>assay buffer (25 nM HEPES pH 7, 10 mM NaCl, 0.01% Nonidet P-40, 1mM dithiothretiol (DTT),</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 nM HEPES</td>
			<td>CALBIOCHEM</td>
			<td>375368</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>127838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nonidet P-40</td>
			<td>US Biological</td>
			<td>N3500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Aldrich</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-70c freezer</td>
			<td>Revco (Ultima II)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTX880 multimode detector&#160; fitted with 485 nm/535 nm excitation/emission filters and a dichroic mirror suitable for fluorescein</td>
			<td>Beckman Coulter, Brea, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>96 well plates, &#160;&#160;</td>
			<td>Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Frozen stocks of U2OS (osteosarcoma) and DU145 (prostate cancer) cell lines</td>
			<td>ATCC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NU serum, DMEM media, trypsin, PEN/STRIP,&#160; MTT reagent,</td>
			<td colspan="2">Fisher, Life technology, Alfa Aesar</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#160;Heamocytometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>-70c freezer</td>
			<td>Revco (Ultima II)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo electron corporation</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf&#160;</td>
			<td>5804 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refrigerator 4-8C</td>
			<td>Isotemp Fisher</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTX880 multimode detector fitted with 595nm filter.</td>
			<td>Beckman Coulter, Brea, CA</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

development of inhibitors of protein-protein interactions through replace: application to the design and development non-atp competitive cdk inhibitors

SUBSTITUIR é uma estratégia única desenvolvidos para atingir mais eficazmente interacções proteína-proteína (IBP). Ele tem como objetivo ampliar o espaço disponível alvo da droga, proporcionando uma melhor metodologia para a identificação de inibidores de tais sítios de ligação e que representam a maioria dos alvos potenciais da droga. O principal objetivo deste artigo é fornecer uma visão metodológica do uso e aplicação da estratégia REPLACE que envolve abordagens de química computacional e sintéticas. Substituição é exemplificado através da sua aplicação para o desenvolvimento de quinases dependentes de ciclina competitivo não-ATP (CDK) inibidores como agentes terapêuticos anti-tumorais. CDKs são frequentemente desregulado no câncer e, portanto, são considerados como alvos importantes para o desenvolvimento de drogas. A inibição de CDK2 / ciclina A em fase S foi reportado para promover a apoptose selectiva de células cancerosas de uma maneira independente de p53 por meio da via E2F1. A segmentação da interacção proteína-proteína no bindin ciclinag ranhura (CBG) é uma abordagem que permita que a inibição específica do ciclo celular CDK através de transcrição. O CBG é reconhecido por uma sequência de consenso derivada a partir de substratos de CDK e proteínas supressoras de tumor denominado o motivo de ligação (CBM) ciclina. O CBM foi previamente optimizado para um octapéptido de p21WAF (HAKRRIF) e, em seguida, ainda mais truncada para um pentapéptido reter actividade suficiente (RRLIF). Peptídeos em geral não são célula permeável, são metabolicamente instável e, portanto, o REPLACE (substituição parcial com Ligand Alternativas através Computacional Enriquecimento) estratégia tem sido aplicada de forma a gerar mais inibidores de drogas-like. A estratégia começa com o desenho do fragmento ligado péptidos inibitórios (vira) que inibem selectivamente a ciclo celular complexos de CDK / ciclina. Inverte foram gerados por substituição de resíduos de iterativamente HAKRRLIF / RRLIF com fragmento como moléculas pequenas (capping), grupos a partir da extremidade N-terminal (Ncaps), seguido por substituição como C-terminal. Estes compostos são pontos de partida para a geração de inibidores de CDK não-competitivos do ATP como agentes terapêuticos anti-tumorais.

As interacções de HAKRRLIF com a ranhura de ciclina são mostrados na Figura 2. Os resíduos peptídicos, que representam os principais determinantes de ligação incluem Ala2, Arg4, Leu6 e Phe8 com outros resíduos proporcionando menores contribuições 12,13,18. Neste caso, o estudo SUBSTITUIR estratégia tem sido utilizado a fim de encontrar alternativas de fragmentos para os resíduos do tetrapéptido N-terminal de HAKRRLIF, mimetizando principalmente as interacções d...

Watch this Scientific Journal Video about Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors at JoV

Development of Inhibitors of Protein-protein Interactions through REPLACE: Application to the Design and Development Non-ATP Competitive CDK Inhibitors

We describe implementation of the REPLACE strategy for targeting protein-protein interactions. REPLACE is an iterative strategy involving synthetic and computational approaches for the conversion of optimized peptidic inhibitors into drug like molecules.

Desenvolvimento de inibidores de interacções proteína-proteína através REPLACE: Aplicação para a concepção e desenvolvimento não-ATP inibidores de CDK Competitiva

REPLACE is a unique strategy developed to more effectively target protein-protein interactions (PPIs). It aims to expand available drug target space by ...

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Study of Protein-protein Interactions in Autophagy Research

Estudo das interações proteína-proteína em pesquisa de autofagia

Protein-protein interactions are important for understanding cellular signaling cascades and identifying novel pathway components and protein dynamics. ...

Advanced Confocal Microscopy Techniques to Study Protein-protein Interactions and Kinetics at DNA Lesions

Avançadas técnicas de microscopia Confocal para estudar interações da proteína-proteína e cinética de lesões do ADN

Local microirradiation with lasers represents a useful tool for studies of DNA-repair-related processes in live cells. Here, we describe a methodological ...

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Mediated Genetic Transformation, Transgenic Production, and Its Application for the Study of Male Reproductive Development in Rice

Agrobacterium-Transformação Genética Mediada, Produção Transgênica e Sua Aplicação para o Estudo do Desenvolvimento Reprodutivo Masculino no Arroz