Name: culture and co-culture of mouse ovaries and ovarian follicles
Uploaded: 2015-03-17T14:00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles at JoVE.com

Work was funded by MRC grant G1002118.

<ol>
	<li>Brien, M. J., Pendola, F. L., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+protocol+for+in+vitro+development+of+mouse+oocytes+from+primordial+follicles+dramatically+improves+their+developmental+competence.">A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental competence.</a> Biol. Reprod. 68 (5), 1682-1686 (2003).</li><li>Fortune, J. E., Yang, M. Y., Muruvi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+earliest+stages+of+follicle+development:+follicle+formation+and+activation.">The earliest stages of follicle development: follicle formation and activation.</a> Soc. Reprod. Fertil. Suppl. 67, 203-216 (2010).</li><li>McLaughlin, M., Kinnell, H. L., Anderson, R. A., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+phosphatase+and+tensin+homologue+(PTEN)+in+human+ovary+in+vitro+results+in+increased+activation+of+primordial+follicles+but+compromises+development+of+growing+follicles.">Inhibition of phosphatase and tensin homologue (PTEN) in human ovary in vitro results in increased activation of primordial follicles but compromises development of growing follicles.</a> Mol. Hum. Reprod. 20 (8), 736-744 (2014).</li><li>Morgan, S., Lopes, F., Gourley, C., Anderson, R. A., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin+and+doxorubicin+induce+distinct+mechanisms+of+ovarian+follicle+loss;+imatinib+provides+selective+protection+only+against+cisplatin.">Cisplatin and doxorubicin induce distinct mechanisms of ovarian follicle loss; imatinib provides selective protection only against cisplatin.</a> PLoS One. 8 (7), e70117 (2013).</li><li>Murray, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+growth+and+oocyte+competence+in+the+in+vitro+cultured+mouse+follicle:+effects+of+gonadotrophins+and+steroids.">Follicular growth and oocyte competence in the in vitro cultured mouse follicle: effects of gonadotrophins and steroids.</a> Mol Hum Reprod. 14 (2), 75-83 (2008).</li><li>Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effect+of+follicle-follicle+interactions+and+declining+follicle-stimulating+hormone+on+murine+follicle+health+in+vitro.">Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro.</a> Biol. Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).</li><li>Campbell, L., Trendell, J., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cells+migrating+from+the+thecal+layer+of+ovarian+follicles.">Identification of cells migrating from the thecal layer of ovarian follicles.</a> Cell Tissue Res. 353 (1), 189-194 (2013).</li><li>Pratt, T., Sharp, L., Nichols, J., Price, D. J., Mason, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+and+transgenic+mice+ubiquitously+expressing+a+tau-tagged+green+fluorescent+protein.">Embryonic stem cells and transgenic mice ubiquitously expressing a tau-tagged green fluorescent protein.</a> Dev. Biol. 228 (1), 19-28 (2000).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Maiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reply+to:+cisplatin-induced+primordial+follicle+oocyte+killing+and+loss+of+fertility+are+not+prevented+by+imatinib.">Reply to: cisplatin-induced primordial follicle oocyte killing and loss of fertility are not prevented by imatinib.</a> Nat. Med. 18 (8), 1172-1174 (2012).</li><li>Spears, N., Bruin, d. r., Gosden, J. P., G, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+follicular+dominance+in+co-cultured+mouse+ovarian+follicles.">The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles.</a> J. Reprod. Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).</li><li>Desmeules, P., Devine, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+ovotoxicity+of+cyclophosphamide+metabolites+on+cultured+mouse+ovaries.">Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries.</a> Toxicol. Sc. 90 (2), 500-509 (2006).</li><li>Tagler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+extracellular+matrix+remodelling+via+ascorbic+acid+enhances+the+survival+of+primary+ovarian+follicles+encapsulated+in+alginate+hydrogels.">Promoting extracellular matrix remodelling via ascorbic acid enhances the survival of primary ovarian follicles encapsulated in alginate hydrogels.</a> Biotechnol. Bioeng. 111 (7), 1417-1429 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

نحن هنا وصف نظم الاستزراع المختلفة التي يمكن استخدامها لدعم تطوير الماوس حويصلات المبيض في المختبر، وذلك باستخدام المبايض حديثي الولادة كلها تحتوي فقط على المراحل الأولى المسام، الفردية حويصلات المبيض preantral وأيضا الثقافات مشاركين للأنسجة اثنين. ثقافة الأطفال حديثي الولادة المبايض الماوس تدعم تطوير المبيض في وقت مبكر، بدء نمو بصيلات ولا سيما ما يصل إلى المرحلة الثانوية جراب. وهناك مجموعة من أعمار الفئران حديثي الولادة يمكن استخدامها لهذه الثقافات، وهذا يتوقف على مراحل تطور المصالح. إذا ويتم الحصول على المبايض من الفئران حديثي الولادة، سيكون تشكيل بصيلات جارية ولكن لم يكتمل بعد: سوف ثقافة تدعم جزئيا على الأقل تشكيل بصيلات استمرار يليه نمو بصيلات. بدلا من ذلك، استخدام المبايض من الفئران حوالي أربعة إلى خمسة أيام من العمر (التي تشكل المسام هو الوقت كاملة بالفعل) النتائج في ثقافة عدد أكبر من FOLLI البدائية ومتناميةجسيمات 12. وتشمل الجوانب المفيدة للتقنية محددة الموصوفة هنا استخدام العائمة الأغشية البولي، والتي تسمح بمزيد من الأوكسجين في الأنسجة، والثقافة في وسيلة أساسية جدا تتألف فقط αMEM وBSA، وتجنب استخدام المواد المضافة غير محددة مثل المصل. لا يبدو ثقافة المبايض كله لدعم التنمية ما بعد مرحلة جريب الثانوية، مع تطور لاحق تتطلب تغييرا في الأسلوب، مثل تشريح المجمعات خلية جريب-المحببة من المبيض حديثي الولادة مثقف 1. ويمكن تطوير مراحل لاحقة من تطوير المسام في المختبر عن طريق تشريح خارج الفرد، سليمة بصيلات قبل الغارية في وقت متأخر، والتي يمكن زراعتها إلى مرحلة سابق للإباضة في الثقافة مع الحفاظ على هيكلها ثلاثي الأبعاد. استخدام بصيلات سليمة لهذه التقنية الثقافة يحافظ على العلاقة بين مكونات مسامي مختلفة كما يحدث في الجسم الحي. ثيالصورة نظام الثقافة يمكن استخدامها للحصول على البويضات التي يمكن أن تدعم الإخصاب وتطور الجنين اللاحقة. كما يمكن الحصول على البويضات Fertilizable من الماوس المبايض حديثي الولادة باستخدام بروتوكول ثقافة الأولي الكثير كما هو موضح هنا، تليها مرحلة ثانية يتم خلالها نمت المجمعات خلية بويضة-المحببة في المختبر 1. وتشمل الأنظمة الأخرى المستخدمة في كثير من الأحيان إلى حد ما اليوم ثقافة بصيلات أو أنسجة المبيض الذي تم مغلفة في مواد مثل هيدروجيل الجينات، لتقديم الدعم (انظر، على سبيل المثال، Tagler وآخرون 13). الكثير من التركيز على التنمية الطريقة الآن هو تحسين تقنيات الثقافة لالمبيض وبصيلات من الثدييات الكبيرة، مع الهدف الطويل الأجل للحصول على البويضات fertilisable من بصيلات البدائية من مجموعة من الأنواع، بما في ذلك البشر. في وقت واحد، المبايض الثدييات تحتوي على بصيلات في مجموعة من المراحل التنموية، مع interactioنانوثانية بين بصيلات تؤثر على تنظيمها. ويفهم من هذا الجانب وظيفة المبيض سيئة وصعبة لفحص في الجسم الحي. طريقة النهائي الموصوفة هنا يستخدم أنظمة الثقافة تشارك في دعم تطوير مراحل مختلفة من بصيلات في المختبر. إذا لزم الأمر، واحد أو كلا الأنسجة يمكن قبل المعاملة في الجسم الحي أو في المختبر للمشاركة في الثقافة السابقة. أنظمة شارك في ثقافة مثل هذه توفر وسيلة مثالية التي لدراسة التفاعلات جريب-المسام، على سبيل المثال كيف المتنامية، الجريبات الغارية تؤثر على بركة بصيلات البدائية، والجوانب البيولوجيا المبيض التي أثبتت صعوبة في دراسة حتى الآن. تقنيات زراعة المبيض كلها هي واضحة إلى حد ما، على الرغم من تشريح دقيق هو مطلوب لتجنب تلف الأنسجة عرضيا. تشريح من بصيلات الفردية هي تقنية متخصصة، والتي تتطلب الممارسة المتكررة قبل أن يتم تشريح بصيلات في المرحلة المناسبة للخروج من المبيض سليمة ودون ضرر. ومن الأهمية بمكانلتشريح من بصيلات الفردية بعناية، أو أضرار لحقت به خلال بروتوكول تشريح يمكن أن يسفر عن وفاة بصيلات خلال الفترة الثقافة اللاحقة. حيث يتم وضع بصيلات مباشرة في البئر لوحات عيار مكروي، فمن المهم استخدام البلاستيك ثقافة غير الأنسجة المعالجة الوحيدة، للحد من الطلاء أسفل الخلايا قرابي على البلاستيك: إذا تم استخدام زراعة الأنسجة بلستيكور المعالجة، سوف بصيلات نعلق على قاعدة من البئر وتمزق عندما يكبرون. للجميع العمل المشترك والثقافة، ويجب أن توضع الأنسجة مباشرة على اتصال مع بعضها البعض. المتوسط ​​المفصلة أعلاه لاستخدامها في تقنية زراعة بصيلات يتضمن إضافة مصل الفأر. فمن الممكن أن تحل محل مصل الفأر مع المصل البقري الجنين، ولكن فقط دفعات من حين لآخر من هذا القبيل الأمصال الدعم الكامل تطوير المسام إلى مرحلة سابق للإباضة، مع دفعة الاختبار المطلوب لتحديد المصادر المناسبة. دفعة اختبار FSH هو المستحسن أيضا، حيث أن يوني الدوليةTS التي يتم من خلالها تقييم FSH القرين بصورة فجة فقط لنمو بصيلات في المختبر. إذا جراب تمزق يحدث بشكل روتيني خلال الفترة الثقافة، والتفكير في استبدال حمض الاسكوربيك الأسهم مع دفعة جديدة. تقنيات لا تتطلب معدات متخصصة لا سيما أخرى من تشريح المجاهر وحاضنات زراعة الأنسجة، على الرغم من استخدام غطاء تدفق الصفحي وتقنية معقمة جيدة تسمح للحويصلات المبيض إلى أن تربيتها في غياب المضادات الحيوية، كما هو الحال في الطرق الموضحة هنا. هذا يمكن أن يكون مفيدا، لتجنب أي تأثير ضار محتمل من المضادات الحيوية على البويضات، لا سيما إذا أريد لها أن تكون المخصبة التالية الثقافة. حيث أنه من غير الممكن للعمل في بيئة معقمة، فإنه من المستحسن أن إضافة المضادات الحيوية لتشريح والثقافة وسائل الإعلام.

ويتكون المبيض الثدييات العرض العمر الأنثى من البويضات، كل الواردة ضمن جراب المبيض. يتم تشكيل بصيلات قبل الولادة في يستريح، مرحلة البدائية: بعد أن يتم تأسيس تجمع المسام، هناك حركة مستمرة وتدريجية من بصيلات من بدائية في بركة جريب المتنامية. كما بصيلات تبدأ في النمو، ويطورون من خلال المراحل الابتدائية والثانوية، preantral ثم الغارية، حتى يصلوا إلى سابق للإباضة، أو غراف، المرحلة. فقط البويضات من الحويصلات سابق للإباضة لهم الولاية التنموي الكامل، وقادرة على دعم التطور الجنيني إلى المدى، إذا المخصبة. المعروف منذ وقت طويل المبيض لتطوير بطريقة الفسيولوجية للغاية في المختبر. هذا ومن المرجح أن يكون راجعا إلى كل جريب المبيض تحتوي في داخلها الخلايا اللازمة لدعم بويضة من مرحلة غير ناضجة (وعند هذه النقطة يصبح غير قادر على إكمال الميتوزي به) من خلال لرانه مرحلة المختصة تنمويا (وعند هذه النقطة يمكن أن تدعم بشكل كامل الانتهاء من الانقسام المنصف والتسميد وتطور الجنين مما يؤدي إلى المدى). وقد أدى الطبيعة الفسيولوجية للتنمية المبيض في المختبر إلى الاستخدام الواسع للتقنيات زراعة المبيض. ونتيجة لذلك، وقد استخدمت في المختبر وسائل للتحقيق في التنظيم للتنمية المبيض، أمراض المبيض (على سبيل المثال أن من متلازمة تكيس المبيض، متلازمة تكيس المبايض)، والفحص عن كيفية المبايض / البويضات تتأثر التعرض للمواد الكيميائية، وأيضا بهدف العملي ل الحصول على البويضات fertilizable من الحويصلات المبيضية البدائية. حتى الآن، وقد تحقق هذا الأخير فقط باستخدام الماوس المبيض الأنسجة 1، على الرغم من أن تقنيات زراعة باستخدام بصيلات من الثدييات الكبيرة، بما في ذلك البشر، قد تحسنت بشكل كبير في السنوات الأخيرة 2،3. وصفنا هنا عدة طرق الثقافة باستخدام الماوس أنسجة المبيض. وmetho الأوليستخدم د كلها المبايض الماوس حديثي الولادة، ويدعم تشكيل والتنمية في وقت مبكر من بصيلات البدائية 4. يدعم النظام الثاني نمو الفردية، جراب المبيض سليمة من preantral في وقت متأخر إلى مرحلة سابق للإباضة. باستخدام هذه التقنية، المسام يمكن تربيتها بشكل فردي، أو في أزواج 5،6. وأخيرا، نحن تصف نظام المشاركة في الثقافة، والجمع بين تقنيات الأولين في طريقة تسمح التحقيق في التفاعلات بين النمو والحويصلات المبيضية البدائية 7. ثقافة الفردية حويصلات المبيض سليمة تتيح نمو بصيلات يتم تحديدها من القياسات بصيلات اليومية خلال الفترة الثقافة، في حين أن التحليل المتوسط ​​يسمح التحقيق في بصيلات / إنتاج هرمون المبيض. ويمكن تحقيق المزيد من التحليلات الأنسجة من قبل مجموعة من بصيلات أو أنسجة المبيض في نهاية الثقافة، لتحليل النسيجي / immunohistological أو للتجهيز لاحق على سبيل المثال للحصول علىمرنا أو البروتينات.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:159px;">Company</td>
			<td style="width:151px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:265px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Leibowitz L15</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">11415049</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">&#945;MEM</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">22571020</td>
			<td style="width:265px;">Supplied as sodium bicarbonate buffered (2200 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A9418</td>
			<td style="width:265px;">For dissection medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A3311</td>
			<td style="width:265px;">For culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A2153</td>
			<td style="width:265px;">For coating glass pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Mouse serum</td>
			<td style="width:159px;">-</td>
			<td style="width:151px;">-</td>
			<td style="width:265px;">Collected from cardiac puncture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">FSH</td>
			<td style="width:159px;">Merck Serono</td>
			<td style="width:151px;">Gonal F</td>
			<td style="width:265px;">Batch testing is often necessary. Make up stock solution of 1IU/10&#181;l in &#945;MEM and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A4034</td>
			<td style="width:265px;">Make up stock of 5mg/ml in &#945;MEM and store at -20&#176;C.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Silicon oil</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:151px;">630064V</td>
			<td style="width:265px;">Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Syringe filters (25mm, 0.2&#181;m)</td>
			<td style="width:159px;">Greiner</td>
			<td style="width:151px;">16532K</td>
			<td style="width:265px;">Cellulose acetate filter: for filtering larger (&#62; 5mls) volumes of medium.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Syringe filters (13mm, 0.2&#181;m)</td>
			<td style="width:159px;">Iwaki</td>
			<td style="width:151px;">3032-013</td>
			<td style="width:265px;">Cellulose acetate filter: for filtering smaller (&#60; 5mls) volumes of medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Syringe filters (25mm, 0.45&#181;m)</td>
			<td style="width:159px;">Iwaki</td>
			<td style="width:151px;">2053-025</td>
			<td style="width:265px;">Cellulose acetate filter: for filtering oil.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Sterile tubes</td>
			<td style="width:159px;">Greiner</td>
			<td style="width:151px;">187261</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">24 well plate</td>
			<td style="width:159px;">Greiner</td>
			<td style="width:151px;">662160</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">96 well round bottom plate</td>
			<td style="width:159px;">Iwaki</td>
			<td style="width:151px;">3875-096</td>
			<td style="width:265px;">Use only non-tissue culture treated plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">96 well flat bottomed well</td>
			<td style="width:159px;">Iwaki</td>
			<td style="width:151px;">3860-096</td>
			<td style="width:265px;">Use only non-tissue culture treated plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Whatman nucleopore membranes</td>
			<td style="width:159px;">Camlab</td>
			<td style="width:151px;">WN/110414</td>
			<td style="width:265px;">Use shiny surface up, polycarbonate, 13mm diameter, 8.0&#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Insulin needles</td>
			<td style="width:159px;">BD medical supplies</td>
			<td style="width:151px;">037-7606</td>
			<td style="width:265px;">0.33mm (29G) +1ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Glass embryo dishes</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:151px;">720-0579</td>
			<td style="width:265px;">Sterilise then warm before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Glass pipettes</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">10209381</td>
			<td style="width:265px;">BSA coated before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Gel tips</td>
			<td style="width:159px;">AlphaLabs</td>
			<td style="width:151px;">LW1103</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Acupuncture needles</td>
			<td style="width:159px;">Acumedic LTD</td>
			<td style="width:151px;">30mmx0.25 Type C</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bouin&#8217;s fixative&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">HT10132-1L</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>HT5014-120ml</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">1.5 ml polypropylene tubes</td>
			<td style="width:159px;">Greiner BioOne</td>
			<td align="right">616201</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and co-culture of mouse ovaries and ovarian follicles

ويتكون المبيض الثدييات من الحويصلات المبيضية، كل المسام التي تتكون من بويضة واحدة تحيط بها الخلايا المحببة الجسدية، والمغلقة معا داخل الغشاء القاعدي. وضعت بركة محدود من بصيلات أسفل أثناء التطور الجنيني، عندما البويضات في اعتقال الانتصافي تشكل ارتباط وثيق مع الخلايا المحببة بالارض، وتشكيل بصيلات البدائية. قبل أو بعد الولادة مباشرة، المبايض الثدييات تحتوي على إمدادات حياتهم من بصيلات البدائية، من هذه النقطة فصاعدا هناك إصدار ثابت من بصيلات في بركة الجريبي المتنامية. المبيض هو الانقياد وخاصة في التنمية في المختبر، مع بصيلات تنمو بطريقة الفسيولوجية للغاية في الثقافة. يصف هذا العمل ثقافة المبايض حديثي الولادة كلها تحتوي على بصيلات البدائية، وثقافة حويصلات المبيض الفردية، والطريقة التي يمكن أن تدعم تطوير المسام من غير ناضجة من خلال لpreovuمرحلة latory، وبعد ذلك البويضات التي هي قادرة على الخضوع الإخصاب في المختبر. العمل المذكورة هنا يستخدم نظم الاستزراع لتحديد كيفية تأثر المبيض عن التعرض لمركبات الخارجية. أيضا نحن تصف نظام المشاركة في الثقافة، والذي يسمح التحقيق في التفاعلات التي تحدث بين تزايد بصيلات والتجمع غير نموا من بصيلات البدائية.

ويبين الشكل 1 صور من المبيض وبصيلات في بداية وأثناء، والإجراءات الثقافة. ويبين الشكل 2 نتائج ممثلة من المبايض حديثي الولادة (هنا والمبيض من الجراء حديثي الولادة) تتعرض لالسامة الإنجابية خلال الثقافة. كان المثقف المبايض حديثي الولادة لمدة 6 أيام، ويتعرض لدواء العلاج الكيميائي، إما سيسبلاتين أو دوكسوروبيسين، في يوم 2 من الثقافة. في نهاية الثقافة، تم إصلاحها المبايض، ومعالجتها للالأنسجة، ومن ثم فحص المبايض لتحديد عدد الحويصلات المبيضية صحية وغير صحية 4. بدلا من ذلك، يمكن الحصول على تقييم أكثر سرعة من بصيلات متزايد في وقت مبكر من ثقافة شظايا المبيض، وذلك باستخدام المبايض من ماوس إبداء علامة بويضة محددة الفلورسنت 10. خلال ثقافة بصيلات الفردية، ونمو بصيلات يمكن التأكد بسهولة عن طريق القياسات اليومية خلال طريق مسدودفترة تلح. الشكل 3 يبين نتائج ممثلة لنمو بصيلات مثقف في وجود أو عدم وجود هرمونات موجهة للغدد التناسلية للجريب تحفيز هرمون (FSH) والهرمون (LH) 5. جراب-جراب أو جريب المبيض شارك في الثقافة يمكن استخدامها لتحقيق التفاعل بين بصيلات. اعتمادا على النسيج والتجهيز والصور يمكن الحصول عليها باستخدام مشرق الميدان، مضان أو المجاهر مبائر. ويبين الشكل 4 نتائج ممثلة من الصور من هذا القبيل المشترك الثقافات، ودراسة مختلف أنواع الخلايا المشاركة في الاتصالات جراب-المسام، بما في ذلك البطانية والخلايا العصبية 7. <img alt="الشكل (1)" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig1highres.jpg" width="650" /> الشكل (1): (A) صورة مجهرية من المبيض حديثي الولادة تم الحصول عليها من الماوس على يوم الولادة، وضعت<html> على غشاء البولي. (ب) صورة مجهرية من الطازج تشريح بصيلات المبيض صحي، مع معظم الأنسجة اللحمية المحيطة تشريح بعيدا. (C) Photomicrographs من شارك في ثقافة اثنين من الحويصلات المبيضية خلال الأيام الثلاثة الأولى من الثقافة، والتي تبين اتصال وثيق التي تطور بين بصيلات اثنين كما عائدات الثقافة (تسى: اليوم الأول من الثقافة، CII: اليوم الثاني من الثقافة، CIII : اليوم الثالث للثقافة). مستنسخة من سبيرز وآخرون. 11 (D) صورة مجهرية من المشارك مثقف بصيلات preantral والمبيض حديثي الولادة بعد يومين من الثقافة. وتظهر صورة المسام تصبح مغلفة من قبل المبيض. يظهر السهم بصيلات preantral. صورة من الدكتور فيديريكا لوبيز. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52458/52458fig1highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> جوري 2 &quot;SRC =&quot; / الملفات / ftp_upload / 52458 / 52458fig2.jpg &quot;/&gt; الشكل 2: تأثير للأدوية العلاج الكيميائي سيسبلاتين ودوكسوروبيسين على المبايض مثقف حديثي الولادة سيسبلاتين ودوكسوروبيسين كلا تؤدي إلى فقدان الصحة المسام وتقليل أعداد المسام. (A) سيسبلاتين. (B) دوكسوروبيسين: (ط) النسبة المئوية من بصيلات غير صحية (واضح)؛ و (ثانيا) إجمالي عدد بصيلات (مظللة) في كل المبيض. الحانات دلالة يعني + ووزارة شؤون المرأة. ن = 5 لجميع الفئات، والنجوم للدلالة فروق ذات دلالة بالنسبة إلى السيطرة (* P &lt;0.05، ** p &lt;0.01، *** P &lt;0.001). مستنسخة من مورغان وآخرون. 4 <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig3.jpg" width="400" /> الشكل 3: النمو معدلات بصيلات تتعرض لبيئات مختلفة الاقناد المصلية القيم يعني ± SEM (ن ≥16 لكل مجموعة). السهم يشير إلى بداية غيرانتشكيل لتر في جميع الفئات موجهة للغدد التناسلية. مستنسخة من موراي وآخرون. 5 <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig4highres.jpg" width="650" /> الشكل 4: صور من المسام، المسام والمبيض، جريب المشترك الثقافات، والتي تبين التفاعلات جريب-جريب (A) صورة مجهرية متحد البؤر من البروتين الفلوري الأخضر (GFP) المسام والبرية من نوع (WT) بصيلات بعد شارك في ثقافة (. GFP التعبير هو موضح هنا في أبيض)، مع العمليات من بصيلات GFP أظهرت يمتد على بصيلات WT. (B) عبر قسم من خلال / WT مجمع جراب GFP التالية شارك في الثقافة، وتبين أن عمليات GFP (الأخضر) من المجاورة للجريب كذبة المتاخمة للالصفيحة القاعدية من المسام WT. (C) حديثي الولادة WT المبيض التالية الثقافة مع ما قبل غاري فقد هاجر المسام، والتي تبين أن الخلايا GFP والعمليات الخلوية (الأخضر)، معربا عن GFPمن خلال interstitum المبيض المبيض حديثي الولادة. (D) GFP / WT مجمع جراب التي تحتوي على الخلايا البطانية، كما هو موضح من قبل التعبير عن البطانية CD31 علامة الخلية (الحمراء). (E) GFP / WT مجمع جراب التي تحتوي على الخلايا العصبية، كما هو موضح من قبل التعبير عن علامة العصبية تويولين بيتا III (انظر هنا بالحمرة، أو الأصفر إذا المزدوج المسمى مع GFP، والأخضر). مجمع جراب (F) YFP / WT، حيث يشير YFP إلى بصيلات من ماوس Thy1-YFP التي لديها التعبير عرضية من البروتين الفلوري أصفر (YFP: الأصفر) في مجموعة فرعية من الخلايا العصبية 9، وتبين أن الخلايا العصبية تمتد من بصيلات YFP. الحانات 50 ميكرون (A، B، D)، و 100 ميكرون (C، E، F)، و 100 ميكرون (أقحم في A)، 10 ميكرون (أقحم في C)، و 15 ميكرون (أقحم في D). مستنسخة من كامبل وآخرون. 7 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52458/52458fig4highres.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذه فاي</a>جوري.

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles at JoVE.com

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

يصف هذا البروتوكول الثقافة الابتدائية / ثقافة مشتركة من الماوس أنسجة المبيض، وذلك باستخدام المبايض من الفئران حديثي الولادة وحويصلات المبيض الفردية من الفئران سابق للبلوغ. تقنيات ثقافة تدعم التنمية بطريقة الفسيولوجية للغاية، مما يسمح للتحقيق في تأثير العوامل الخارجية على المبيض، والتفاعلات بين الحويصلات المبيضية.

الثقافة والمشارك ثقافة ماوس المبايض وحويصلات المبيض

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

culture-and-co-culture-of-mouse-ovaries-and-ovarian-follicles

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are reprogrammed from human fibroblasts using episomal vectors. Colonies of iPSCs can be observed 30 days after initiation of fibroblast reprogramming. Pluripotent colonies are manually picked and grown in neural induction medium to permit differentiation into neural progenitor cells (NPCs). iPSCs rapidly convert into neuroepithelial cells within 1 week and retain the capability to self-renew when maintained at a high culture density. Primary mouse NPCs are differentiated into astrocytes by exposure to a serum-containing medium for 7 days and form a monolayer upon which embryonic day 18 (E18) rat cortical neurons (transfected with channelrhodopsin-2 (ChR2)) are added. Human NPCs tagged with the fluorescent protein, tandem dimer Tomato (tdTomato), are then seeded onto the astrocyte/cortical neuron culture the following day and allowed to differentiate for 28 to 35 days. We demonstrate that this system forms synaptic connections between iPSC-derived neurons and cortical neurons, evident from an increase in the frequency of synaptic currents upon photostimulation of the cortical neurons. This co-culture system provides a novel platform for evaluating the ability of iPSC-derived neurons to create synaptic connections with other neuronal populations.

A protocol to generate a co-culture system consisting of neurons derived from induced pluripotent stem cells (iPSCs), primary cortical neurons and astrocytes is described. This co-culture system allows detection of the formation of synaptic contacts and circuits between new, iPSC-derived neurons and pre-existing cortical neurons expressing channelrhodopsin-2.

مقاربة Optogenetic لتقييم تشكيل الوصلات العصبية في نظام المشارك الثقافة

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse this scaffold in a highly coordinated temporal and spatial order while sequentially passing obligatory check points, i.e., T cell lineage commitment, followed by T cell receptor repertoire generation and selection prior to their export into the periphery. The two major resident cell types forming this scaffold are cortical (cTECs) and medullary thymic epithelial cells (mTECs). A key feature of mTECs is the so-called promiscuous expression of numerous tissue-restricted antigens. These tissue-restricted antigens are presented to immature thymocytes directly or indirectly by mTECs or thymic dendritic cells, respectively resulting in self-tolerance.
Suitable in vitro models emulating the developmental pathways and functions of cTECs and mTECs are currently lacking. This lack of adequate experimental models has for instance hampered the analysis of promiscuous gene expression, which is still poorly understood at the cellular and molecular level. We adapted a 3D organotypic co-culture model to culture ex vivo isolated mTECs. This model was originally devised to cultivate keratinocytes in such a way as to generate a skin equivalent in vitro. The 3D model preserved key functional features of mTEC biology: (i) proliferation and terminal differentiation of CD80lo, Aire-negative into CD80hi, Aire-positive mTECs, (ii) responsiveness to RANKL, and (iii) sustained expression of FoxN1, Aire and tissue-restricted genes in CD80hi mTECs.

Studying medullary thymic epithelial cells in vitro has been largely unsuccessful, as current 2D culture systems do not mimic the in vivo scenario. The 3D culture system described herein - a modified skin organotypic culture model - has proven superior in recapitulating mTEC proliferation, differentiation and maintenance of promiscuous gene expression.

3D عضوي النمط المشارك الثقافة نموذج دعم النخاع التوتة الظهارية تكاثر الخلايا، التمايز ومختلط التعبير الجيني

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We quantitatively assessed follicle survival, measured follicle and oocyte diameters, and examined ultrastructure of the oocytes produced from the system. We observed decreased follicle survival, downregulation of expressions of proliferating cell nuclear antigen and growth differentiation factor 9, as indicators for the development of granulosa cells and oocytes, respectively, and oocyte ultrastructural abnormalities under the simulated microgravity condition. The simulated microgravity experimental setup needs to be optimized to provide a model for investigation of the mechanisms involved in the oocyte/follicle in vitro development.

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

A highly promising technique to generate tissue constructs without using matrix is to culture cells in a simulated microgravity condition. Using a rotary culture system, we examined ovarian follicle growth and oocyte maturation in terms of follicle survival, morphology, growth, and oocyte function under the simulated microgravity condition.

في المختبر نمو بصيلات بريانترال الماوس تحت ظروف محاكاة الجاذبية الصغرية

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney development, the two progenitor tissues, the ureteric bud and the metanephric mesenchyme, communicate and reciprocally induce cellular mechanisms to eventually form the collecting system and the nephrons of the kidney. As mammalian embryos grow intrauterine and therefore are inaccessible to the observer, an organ culture has been developed. With this method, it is possible to study epithelial-mesenchymal interactions and cellular behavior during kidney organogenesis. Furthermore, the origin of congenital kidney and urogenital tract malformations can be investigated. After careful dissection, the metanephric rudiments are transferred onto a filter that floats on culture medium and can be kept in a cell culture incubator for several days. However, one must be aware that the conditions are artificial and could influence the metabolism in the tissue. Also, the penetration of test substances could be limited due to the extracellular matrix and basal membrane present in the explant.
One main advantage of organ culture is that the experimenter can gain direct access to the organ. This technology is cheap, simple, and allows a large number of modifications, such as the addition of biologically active substances, the study of genetic variants, and the application of advanced imaging techniques.

This protocol describes a method for isolating and culturing metanephric rudiments from mouse embryos.

تشريح وثقافة ماوس الجنينية الكلى

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature maintenance and pathological malformations can result in severe ischemic diseases, while overly abundant vascular development is associated with cancer and inflammatory disorders. A promising form of pro-angiogenic therapy is the use of angiogenic cell sources, which can provide regulatory factors as well as physical support for newly developing vasculature.
Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) are extensively investigated candidates for vascular regeneration due to their paracrine effects and their ability to detect and home to ischemic or inflamed tissues. In particular, first trimester human umbilical cord perivascular cells (FTM HUCPVCs) are a highly promising candidate due to their pericyte-like properties, high proliferative and multilineage potential, immune-privileged properties, and robust paracrine profile. To effectively evaluate potentially angiogenic regenerative cells, it is a requisite to test them in reliable and &#34;translatable&#34; pre-clinical assays. The aortic ring assay is an ex vivo angiogenesis model that allows for easy quantification of tubular endothelial structures, provides accessory supportive cells and extracellular matrix (ECM) from the host, excludes inflammatory components, and is fast and inexpensive to set up. This is advantageous when compared to in vivo models (e.g., corneal assay, Matrigel plug assay); the aortic ring assay can track the administered cells and observe intercellular interactions while avoiding xeno-immune rejection.
We present a protocol for a novel application of the aortic ring assay, which includes human MSCs in co-cultures with developing rat aortic endothelial networks. This assay allows for the analysis of the MSC contribution to tube formation and development through physical pericyte-like interactions and of their potency for actively migrating to sites of angiogenesis, and for evaluating their ability to perform and mediate ECM processing. This protocol provides further information on changes in MSC phenotype and gene expression following co-culture.

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Here, we present a novel application of the aortic ring assay where prelabelled mesenchymal cells are co-cultured with rat aorta-derived endothelial networks. This novel method allows visualization of Mesenchymal Stromal Cells (MSCs) homing and integration with endothelial networks, quantification of network properties, and evaluation of MSC immunophenotypes and gene expression.

والرزن ثقافة المشارك خاتم الابهري: أداة ملائمة تقييم إمكانات الأوعية الوسيطة Stromal الخلايا في المختبر

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a pupal case. The challenge of dissecting pupal ovaries also lies in their physical location within the pupa: the ovaries are surrounded by fat body cells inside the pupal abdomen, and these fat cells must be removed to allow for proper antibody staining. To overcome these challenges, this protocol utilizes customized Pasteur pipets to extract fat body cells from the pupal abdomen. Moreover, a chambered coverglass is used in place of a microcentrifuge tube during the staining process to improve visibility of the pupae. However, despite these and other advantages of the tools used in this protocol, successful execution of these techniques may still involve several days of practice due to the small size of pupal ovaries. The techniques outlined in this protocol could be applied to time course experiments in which ovaries are analyzed at various stages of pupal development.

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

The Drosophila ovary is an excellent model system for studying stem cell niche development. Though methods for dissecting larval and adult ovaries have been published, pupal ovary dissections require different techniques that have not been published in detail. Here we outline a protocol for dissecting, staining, and mounting pupal ovaries.

تشريح وتلطيخ المبايض المورفولوجية الخوادر

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

تحليل الاستنساخ من سلائف الخلايا الجذعية الجنينية المكونة للدم باستخدام مؤشر وحيد الخلية الفرز جنبا إلى جنب مع الخلية البطانية مكانة ثقافة المشارك

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ovarian fitness is often assessed by visualizing and quantifying follicles and oocytes. Because the ovary is an opaque three-dimensional tissue, traditional approaches require laboriously slicing the tissue into numerous serial sections in order to visualize cells throughout the entire organ. Furthermore, because quantification by this method typically entails scoring only a subset of the sections separated by the approximate diameter of an oocyte, it is prone to inaccuracy. Here, a protocol is described that instead utilizes whole organ tissue clearing and immunofluorescence staining of mouse ovaries to visualize follicles and oocytes. Compared to more traditional approaches, this protocol is advantageous for visualizing cells within the ovary for numerous reasons: 1) the ovary remains intact throughout sample preparation and processing; 2) small ovaries, which are difficult to section, can be examined with ease; 3) cellular quantification is more readily and accurately achieved; and 4) the whole organ imaged.

Here, we present a protocol to quantify follicles in cultured ovaries of young mice without serial sectioning. Using whole organ immunofluorescence and tissue clearing, physical sectioning is replaced with optical sectioning. This method of sample preparation and visualization maintains organ integrity and facilitates automated quantification of specific cells.

كله جبل الفلورة وتقدير جريب المبايض الماوس مثقف

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

زراعة أنسجة المبيض تصور الظواهر في المبيض الماوس

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Derivation and Differentiation of Canine Ovarian Mesenchymal Stem Cells

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies have demonstrated the wide differentiation capacity that these cells possess. The ovary represents a promising candidate for cell-based therapies due to the fact that it is rich in MSCs and that it is frequently discarded after ovariectomy surgeries as biological waste. This article describes procedures for the isolation, expansion, and differentiation of MSCs derived from the canine ovary, without the necessity of cell-sorting techniques. This protocol represents an important tool for regenerative medicine because of the broad applicability of these highly differentiable cells in clinical trials and therapeutic uses.

Herein, we describe a method for the isolation, expansion, and differentiation of mesenchymal stem cells from canine ovarian tissue.

الاشتقاق وتمايز الخلايا الجذعية الوسيطة المبيض الكلاب

Interest in mesenchymal stem cells (MSCs) has increased over the past decade due to their ease of isolation, expansion, and culture. Recently, studies ...