Name: culture and co-culture of mouse ovaries and ovarian follicles
Uploaded: 2015-03-17T14:00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles at JoVE.com

Work was funded by MRC grant G1002118.

<ol>
	<li>Brien, M. J., Pendola, F. L., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+protocol+for+in+vitro+development+of+mouse+oocytes+from+primordial+follicles+dramatically+improves+their+developmental+competence.">A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental competence.</a> Biol. Reprod. 68 (5), 1682-1686 (2003).</li><li>Fortune, J. E., Yang, M. Y., Muruvi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+earliest+stages+of+follicle+development:+follicle+formation+and+activation.">The earliest stages of follicle development: follicle formation and activation.</a> Soc. Reprod. Fertil. Suppl. 67, 203-216 (2010).</li><li>McLaughlin, M., Kinnell, H. L., Anderson, R. A., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+phosphatase+and+tensin+homologue+(PTEN)+in+human+ovary+in+vitro+results+in+increased+activation+of+primordial+follicles+but+compromises+development+of+growing+follicles.">Inhibition of phosphatase and tensin homologue (PTEN) in human ovary in vitro results in increased activation of primordial follicles but compromises development of growing follicles.</a> Mol. Hum. Reprod. 20 (8), 736-744 (2014).</li><li>Morgan, S., Lopes, F., Gourley, C., Anderson, R. A., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin+and+doxorubicin+induce+distinct+mechanisms+of+ovarian+follicle+loss;+imatinib+provides+selective+protection+only+against+cisplatin.">Cisplatin and doxorubicin induce distinct mechanisms of ovarian follicle loss; imatinib provides selective protection only against cisplatin.</a> PLoS One. 8 (7), e70117 (2013).</li><li>Murray, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+growth+and+oocyte+competence+in+the+in+vitro+cultured+mouse+follicle:+effects+of+gonadotrophins+and+steroids.">Follicular growth and oocyte competence in the in vitro cultured mouse follicle: effects of gonadotrophins and steroids.</a> Mol Hum Reprod. 14 (2), 75-83 (2008).</li><li>Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effect+of+follicle-follicle+interactions+and+declining+follicle-stimulating+hormone+on+murine+follicle+health+in+vitro.">Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro.</a> Biol. Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).</li><li>Campbell, L., Trendell, J., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cells+migrating+from+the+thecal+layer+of+ovarian+follicles.">Identification of cells migrating from the thecal layer of ovarian follicles.</a> Cell Tissue Res. 353 (1), 189-194 (2013).</li><li>Pratt, T., Sharp, L., Nichols, J., Price, D. J., Mason, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+and+transgenic+mice+ubiquitously+expressing+a+tau-tagged+green+fluorescent+protein.">Embryonic stem cells and transgenic mice ubiquitously expressing a tau-tagged green fluorescent protein.</a> Dev. Biol. 228 (1), 19-28 (2000).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Maiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reply+to:+cisplatin-induced+primordial+follicle+oocyte+killing+and+loss+of+fertility+are+not+prevented+by+imatinib.">Reply to: cisplatin-induced primordial follicle oocyte killing and loss of fertility are not prevented by imatinib.</a> Nat. Med. 18 (8), 1172-1174 (2012).</li><li>Spears, N., Bruin, d. r., Gosden, J. P., G, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+follicular+dominance+in+co-cultured+mouse+ovarian+follicles.">The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles.</a> J. Reprod. Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).</li><li>Desmeules, P., Devine, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+ovotoxicity+of+cyclophosphamide+metabolites+on+cultured+mouse+ovaries.">Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries.</a> Toxicol. Sc. 90 (2), 500-509 (2006).</li><li>Tagler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+extracellular+matrix+remodelling+via+ascorbic+acid+enhances+the+survival+of+primary+ovarian+follicles+encapsulated+in+alginate+hydrogels.">Promoting extracellular matrix remodelling via ascorbic acid enhances the survival of primary ovarian follicles encapsulated in alginate hydrogels.</a> Biotechnol. Bioeng. 111 (7), 1417-1429 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

אנו מתארים כאן מערכות תרבות שונות שיכול להיות מנוצלת כדי לתמוך בפיתוח של זקיקים בשחלות עכבר במבחנה, באמצעות השחלות יילודים כל המכילות רק את השלבים הראשונים זקיק, זקיקים בשחלות preantral פרט וגם שיתוף תרבויות של שתי רקמות. תרבות של השחלות עכבר בילוד תומכת בפיתוח שחלות בשלב מוקדם, ייזום צמיחה במיוחד זקיק עד שלב הזקיק המשני. טווח גילים של עכברים בילוד יכול לשמש לתרבויות אלה, בהתאם לשלבי ההתפתחות של עניין. אם השחלות מתקבלות מעכברים שזה עתה נולד, היווצרות זקיק תהיה בעיצומו, אך עדיין לא שלם: התרבות לפחות באופן חלקי תתמוך היווצרות זקיק המשך אחרי צמיחת זקיק. לחלופין, שימוש בשחלות מעכברים סביב ימים ארבעה עד חמש של גיל (שבו היווצרות זקיק הזמן היא מלאים כבר) תוצאות בתרבות של מספר רב יותר של Folli הקדמוני וגדלcles 12. היבטים חיוביים של הטכניקה הספציפית המתוארת כאן כוללים שימוש בממברנות פוליקרבונט צפים, המאפשרות חמצון גדול יותר של הרקמה, ותרבות במדיום מאוד בסיסי ובו רק αMEM וBSA, הימנעות משימוש בתוספים לא מוגדרים כגון סרום. תרבות של כל השחלות לא נראית לתמוך בהתפתחות מעבר לשלב הזקיק המשני, עם התפתחות מאוחרת יותר הדורשת שינוי בטכניקה, כגון הנתיחה של מתחמי תא הזקיק-granulosa מהשחלה בילוד התרבותית 1. בשלבים מאוחר יותר של התפתחות זקיק ניתן לפתח במבחנה על ידי לנתח את פרט, זקיקים מראש Antral מאוחר שלמים, שניתן לגדל בשלב preovulatory בתרבות, תוך שמירה על המבנה התל-ממדי שלהם. השימוש בזקיקים שלמים לטכניקת תרבות זו שומר על מערכת היחסים בין המרכיבים השונים זקיקים כפי שמתרחש בגוף חי. תימערכת התרבות שלהם ניתן להשתמש כדי להשיג ביציות שיכולות לתמוך הפריה והתפתחות עובר שלאחר מכן. ניתן גם להשיג ביציות Fertilizable משחלות בילוד עכבר באמצעות פרוטוקול ראשוני תרבות הרבה כפי שתואר כאן, ואחריו שלב שני שבמהלכו מתחמי תא הביצית-granulosa גדלים במבחנה 1. מערכות אחרות המשמשות לעתים קרובות למדי היום כוללות תרבות של זקיקים או רקמה שחלה שכבר הגלום בחומר כגון הידרוג&#39;ל אלגינט, כדי לספק תמיכה (ראה, למשל, Tagler et al. 13). חלק גדול מהמוקד של פיתוח שיטה עכשיו הוא לשפר טכניקות תרבות לשחלות וזקיקים של יונקים גדולים, במטרה לטווח הארוך של קבלת ביציות fertilisable מזקיקים ראשוניים מתוך מגוון רחב של מינים, כולל בני אדם. בכל זמן נתון, השחלות יונקים מכילות זקיקים בטווח של שלבי התפתחות, עם interactions בין זקיקים המשפיעים על הוויסות שלהם. היבט זה של תפקוד השחלות הוא הבין היטב וקשה לבחון in vivo. השיטה הסופית המתוארת כאן משתמשת במערכות שיתוף תרבות לתמיכה בפיתוח של שלבים שונים של זקיקים במבחנה. במידת הצורך, ניתן מראש טופלו רקמות אחד או שניהם in vivo או במבחנה לתרבות המשותפת לפני. מערכות שיתוף התרבות כגון זו מספקות דרך אידיאלית שבי לבחון אינטראקציות זקיק זקיק, למשל איך גדל, זקיקי Antral להשפיע על בריכת הזקיק הקדמונית, היבטים של ביולוגיה השחלות שהוכיחו קשה לבחון עד עכשיו. טכניקות תרבות השחלה כולם פשוטות למדי, אם כי נדרשת נתיחה זהירה, כדי למנוע נזק לרקמות מקריות. Dissection של זקיקים בודדים הוא טכניקה מיוחדת, הדורשת תרגול חוזר ונשנה לפני יכולים להיות גזורים מזקיקים בשלב הנכון משחלת שלמות וללא ניזק. זה קריטילנתח את זקיקים בודדים בזהירות, או נזק שנגרם במהלך פרוטוקול הנתיחה יכול לגרום למות זקיק בתקופת התרבות שלאחר מכן. איפה זקיקים ממוקמים ישירות לתוך הבאר של צלחות microtiter, חשוב להשתמש פלסטיק התרבות הלא-רקמה שטופל רק, כדי למזער את ציפוי של תאי thecal על הפלסטיק: אם נעשה שימוש בplasticware טופל בתרבית רקמה, הזקיקים יצרפו ל בסיס של הבאר וקרע ככל שהם גדלים. לכל עבודת שיתוף התרבות, רקמות חייבות להיות ממוקמות ישירות בקשר אחד עם השני. הבינוני שפורט לעיל לשימוש בטכניקת תרבות הזקיק כולל תוספת של סרום עכבר. אפשר להחליף את סרום העכבר עם סרום שור עוברי, אבל רק מדי פעם קבוצות של סרה כזה יתמכו באופן מלא התפתחות זקיק לבמה preovulatory, עם סדרת בדיקות הנדרשות לזהות מקורות מתאימים. אצווה-בדיקה של FSH כן, מומלצת, כUni הבינלאומיts שבו FSH מוערך לתאם רק בגסות לצמיחת זקיק במבחנה. אם קרע הזקיק מתרחש באופן שגרתי במהלך תקופת התרבות, תשקול להחליף את חומצה אסקורבית מניות עם קבוצה חדשה. הטכניקות אינן דורשות ציוד מיוחד במיוחד אחר מאשר מיקרוסקופים לנתח וחממות תרבית רקמה, למרות ששימוש בזרימה למינרית וטכניקה סטרילית טובה לאפשר לזקיקים בשחלות ללהיות מתורבת בהיעדר האנטיביוטיקה, כמו בשיטות שתוארו כאן. זה יכול להיות מועיל, כדי למנוע כל השפעה מזיקה פוטנציאל של אנטיביוטיקה בביציות, במיוחד אם הם להפריה הבאה תרבות. שבו לא ניתן לעבוד בסביבת סטרילית, רצוי להוסיף אנטיביוטיקה לתקשורת לנתיחה והתרבות.

השחלה היונקים מורכבת מהאספקה ​​של נקבת חיים של ביציות, כל כלול בתוך זקיק בשחלה. הזקיקים נוצרים לפני הלידה במנוחה, שלב ראשוני: פעם אחת בריכת הזקיק הוקמה, יש תנועה מתמדת והדרגתית של זקיקים מהקדמוניים לתוך בריכת הזקיק גדלה. כאשר זקיקים מתחילים לגדול, הם מפתחים בשלבים הראשוניים, שניוניים, preantral ולאחר מכן Antral, עד שהם מגיעים preovulatory, או Graafian, שלב. יש רק ביציות מזקיקי preovulatory יכולת התפתחותית מלאה, מסוגל לתמוך בהתפתחות עוברית לטווח, אם מופרה. השחלה כבר זמן רב ידוע לפתח באופן פיסיולוגי מאוד במבחנה. זה עשוי להיות בגלל כל זקיק בשחלה המכיל בתוכו את התאים דרושים כדי לתמוך בביצית מהבמה בשלה (ובשלב זה הוא לא הצליח להשלים את חלוקת meiotic) ועד לtהוא שלב בחינה התפתחותית מוסמך (ובשלב זה יכול לתמוך בהשלמת מיוזה, הפריה וההתפתחות של עובר וכתוצאה מכך לטווח מלא). הטבע הפיזיולוגי של התפתחות השחלה במבחנה הוביל לשימוש הנרחב בטכניקות תרבות השחלה. כתוצאה מכך, במבחנה השיטות נעשו שימוש כדי לחקור הרגולציה של פיתוח השחלה, פתולוגיה השחלות (למשל זה של תסמונת שחלות פוליציסטיות, PCOS), בדיקה של כמה השחלות / ביציות מושפעות מחשיפה לכימיקלים, וגם במטרה המעשית של קבלת ביציות fertilizable מזקיקים בשחלות בראשיתי. עד כה, האחרון הושג רק באמצעות רקמת השחלה עכבר 1, למרות שטכניקות תרבות באמצעות זקיקים מיונקים גדולים, כולל בני אדם, השתפרו מאוד בשנים האחרונות 2,3. אנו מתארים כאן כמה שיטות תרבות באמצעות רקמת השחלה עכבר. Metho הראשוןד משתמש השחלות עכבר בילוד כל, ותומך בהיווצרות וההתפתחות המוקדמת של זקיקים בראשיתי 4. מערכת השנייה תומכת בצמיחה של זקיקים בודדים, ללא פגע משחלות preantral מאוחר לבמה preovulatory; שימוש בטכניקה זו, יכול להיות מתורבת זקיקים בנפרד, או בזוגות 5,6. לבסוף, אנו מתארים מערכת שיתוף תרבות, המשלבים את שתי הטכניקות הראשונות בשיטה המאפשרת חקירה של האינטראקציות בין גובר וזקיקים בשחלות קדמוניים 7. תרבות של זקיקים בשחלות בשלמות פרט מאפשרת צמיחת זקיק שתיקבע ממדידות זקיק יומיות בתקופת התרבות, תוך ניתוח בינוני מאפשר חקירה של זקיק / ייצור הורמון השחלה. ניתן להשיג ניתוחי רקמות נוספים על ידי אוסף של זקיקים או רקמת השחלה בסוף התרבות, לניתוחי immunohistological / היסטולוגית או לעיבוד שלאחר מכן למשל להשיגmRNA או חלבונים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:159px;">Company</td>
			<td style="width:151px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:265px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Leibowitz L15</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">11415049</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">&#945;MEM</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">22571020</td>
			<td style="width:265px;">Supplied as sodium bicarbonate buffered (2200 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A9418</td>
			<td style="width:265px;">For dissection medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A3311</td>
			<td style="width:265px;">For culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A2153</td>
			<td style="width:265px;">For coating glass pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Mouse serum</td>
			<td style="width:159px;">-</td>
			<td style="width:151px;">-</td>
			<td style="width:265px;">Collected from cardiac puncture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">FSH</td>
			<td style="width:159px;">Merck Serono</td>
			<td style="width:151px;">Gonal F</td>
			<td style="width:265px;">Batch testing is often necessary. Make up stock solution of 1IU/10&#181;l in &#945;MEM and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A4034</td>
			<td style="width:265px;">Make up stock of 5mg/ml in &#945;MEM and store at -20&#176;C.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Silicon oil</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:151px;">630064V</td>
			<td style="width:265px;">Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Syringe filters (25mm, 0.2&#181;m)</td>
			<td style="width:159px;">Greiner</td>
			<td style="width:151px;">16532K</td>
			<td style="width:265px;">Cellulose acetate filter: for filtering larger (&#62; 5mls) volumes of medium.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Syringe filters (13mm, 0.2&#181;m)</td>
			<td style="width:159px;">Iwaki</td>
			<td style="width:151px;">3032-013</td>
			<td style="width:265px;">Cellulose acetate filter: for filtering smaller (&#60; 5mls) volumes of medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Syringe filters (25mm, 0.45&#181;m)</td>
			<td style="width:159px;">Iwaki</td>
			<td style="width:151px;">2053-025</td>
			<td style="width:265px;">Cellulose acetate filter: for filtering oil.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Sterile tubes</td>
			<td style="width:159px;">Greiner</td>
			<td style="width:151px;">187261</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">24 well plate</td>
			<td style="width:159px;">Greiner</td>
			<td style="width:151px;">662160</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">96 well round bottom plate</td>
			<td style="width:159px;">Iwaki</td>
			<td style="width:151px;">3875-096</td>
			<td style="width:265px;">Use only non-tissue culture treated plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">96 well flat bottomed well</td>
			<td style="width:159px;">Iwaki</td>
			<td style="width:151px;">3860-096</td>
			<td style="width:265px;">Use only non-tissue culture treated plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Whatman nucleopore membranes</td>
			<td style="width:159px;">Camlab</td>
			<td style="width:151px;">WN/110414</td>
			<td style="width:265px;">Use shiny surface up, polycarbonate, 13mm diameter, 8.0&#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Insulin needles</td>
			<td style="width:159px;">BD medical supplies</td>
			<td style="width:151px;">037-7606</td>
			<td style="width:265px;">0.33mm (29G) +1ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Glass embryo dishes</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:151px;">720-0579</td>
			<td style="width:265px;">Sterilise then warm before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Glass pipettes</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">10209381</td>
			<td style="width:265px;">BSA coated before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Gel tips</td>
			<td style="width:159px;">AlphaLabs</td>
			<td style="width:151px;">LW1103</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Acupuncture needles</td>
			<td style="width:159px;">Acumedic LTD</td>
			<td style="width:151px;">30mmx0.25 Type C</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bouin&#8217;s fixative&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">HT10132-1L</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>HT5014-120ml</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">1.5 ml polypropylene tubes</td>
			<td style="width:159px;">Greiner BioOne</td>
			<td align="right">616201</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and co-culture of mouse ovaries and ovarian follicles

השחלה היונקים מורכבת של זקיקים בשחלות, כל זקיק המורכב מביצית אחת מוקפת בתאים סומטיים granulosa, מצורף יחד בתוך קרום במרתף. בריכה סופית של זקיקים הוא הניחה במהלך התפתחות עוברית, כאשר ביציות במעצר meiotic ליצור קשר קרוב עם תאי granulosa שטוחים, ויצרו זקיקים בראשיתי. על ידי או זמן קצר לאחר לידה, השחלות יונקים מכילות אספקה ​​של חייהם של זקיקים בראשיתי, שממנו נקודה זו ואילך יש שחרור קבוע של זקיקים לתוך בריכת הזקיקים גדלה. השחלה היא נוחה במיוחד להתפתחות במבחנה, עם זקיקים גדלו באופן פיסיולוגי מאוד בתרבות. עבודה זו מתארת ​​את התרבות של השחלות בילוד כל המכילות זקיקים בראשיתי, והתרבות של זקיקים בשחלות בודדים, שיטה שיכול לתמוך בפיתוח של זקיקים מבוגרים ועד לpreovuשלב latory, לאחר שהביציות שלהם מסוגל לעבור הפריה חוץ גופית. העבודה המתוארת כאן משתמשת במערכות תרבות כדי לקבוע כיצד השחלה מושפעת מחשיפה לתרכובות חיצוניות. גם אנו מתארים מערכת שיתוף תרבות, המאפשרת חקירה של האינטראקציות המתרחשות בין זקיקים גדלו והבריכה שאינו הצומחת של זקיקים בראשיתי.

איור 1 מציג תמונות של השחלות וזקיקים בתחילת, ובמהלך, נהלי התרבות. איור 2 מציג תוצאות נציג של השחלות בילוד (כאן, השחלות מגורים שנולדו) נחשפו לרעלי רבייה במהלך התרבות. השחלות בילוד היו בתרבית במשך 6 ימים, ונחשפו לתרופה כימותרפית, או ציספלטין או דוקסורוביצין, ביום 2 של התרבות. בסופו של התרבות, השחלות היו קבועות, מעובד להיסטולוגיה, ושחלות אז בדקו כדי לקבוע את מספר זקיקים בשחלות בריאים ולא בריאים 4. לחלופין, ניתן לקבל הערכה מהירה יותר של זקיקים גדלו מוקדם מהתרבות של שברי השחלות, באמצעות השחלות מעכבר להביע סמן פלואורסצנטי ביצית ספציפית 10. במהלך התרבות של זקיקים בודדים, צמיחת זקיק ניתן ללמוד בקלות על ידי מדידות יומיות ברחוב ללא מוצאture תקופה. איור 3 מציג תוצאות נציג של הצמיחה של זקיקים בתרבית בנוכחות או עדר של הורמוני gonadotrophin הורמון מגרים זקיק (FSH) והורמון luteinizing (LH) 5. זקיק זקיק או זקיק בשחלה-שיתוף תרבות יכול לשמש כדי לחקור אינטראקציות בין זקיקים. בהתאם לרקמות והעיבוד, ניתן לקבל תמונות באמצעות בהיר שדה, הקרינה או מיקרוסקופים confocal. איור 4 מציג תוצאות נציג של תמונות משיתוף תרבויות כגון, בוחנים סוגים שונים של תאים מעורבים בתקשורת זקיק זקיק, כוללים אנדותל ותאים עצביים 7. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig1highres.jpg" width="650" /> איור 1: (א) Photomicrograph של השחלה יילודים המתקבלת מעכבר ביום הלידה, הניח<html> על קרום פוליקרבונט. (ב) Photomicrograph של טרי גזור זקיק בשחלה בריא, עם רוב של הרקמות המקיפות את סטרומה גזור משם. (C) Photomicrographs של התרבות המשותפת של שני זקיקים בשחלות בשלושה הימים הראשונים של תרבות, המראה את הקשר ההדוק שנוצר בין שני הזקיקים כתמורת התרבות (Ci: היום הראשון של תרבות; כת&quot;ש: יום שני של תרבות; Ciii : יום שלישי של תרבות). לשכפל מאל ספירס et. 11 (ד) Photomicrograph של זקיק preantral שיתוף תרבותי ושחלה בילוד לאחר יומיים של התרבות. תמונה מראה את הזקיק הופך כמוס על ידי השחלה. חץ מראה זקיק preantral. תמונה מתוך ד&quot;ר פדריקה לופס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52458/52458fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> &quot;Src =&quot; תרשים 2 &quot;/&gt; / קבצים / ftp_upload / 52,458 / 52458fig2.jpg איור 2: השפעה של התרופות כימותרפיות ציספלטין ודוקסורוביצין על השחלות בתרבית בילוד ציספלטין ודוקסורוביצין שני להוביל לאובדן של בריאות זקיק וירידה במספרי זקיק.. ציספלטין (); (ב) דוקסורוביצין: (i) אחוז מהזקיקים בריאים (ברור); וכן (ii) מספר כולל של זקיקים (מוצל) בכל השחלה. ברים לציין מתכוונים + SEM; n = 5 עבור כל הקבוצות, כוכבים לציין הבדלים משמעותיים ביחס לשליטה (* p &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt;0.001). לשכפל מאל מורגן et. 4 <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig3.jpg" width="400" /> איור 3:. צמיחת שיעורים של זקיקים נחשפו לסביבות שונות gonadotrophin ערכים הם ממוצעים ± SEM (n ≥16 לכל קבוצה). חץ מציין את תחילתו של antraהיווצרות l בכל קבוצות gonadotrophin. לשכפל מאל Murray et. 5 <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig4highres.jpg" width="650" /> איור 4: תמונות משיתוף תרבויות זקיק זקיק ושחלת זקיק, המציגות אינטראקציות זקיק זקיק מיקרוסקופ Confocal של חלבון פלואורסצנטי ירוק זקיק (GFP) וwild-type (WT) זקיק לאחר שיתוף התרבות ((). ביטוי של GFP מוצג כאן בלבן), עם תהליכים מזקיק GFP מוצג משתרע על פני זקיק WT. חתך דרך GFP / מורכב זקיק WT הבא שיתוף תרבות (B), שהראה כי תהליכי GFP (ירוק) משקר הזקיק הסמוך הסמוך לlamina הבסיס של זקיק WT. השחלה (C) הילודים WT הבא תרבות עם מראש Antral זקיק, שהראה כי תאי GFP ותהליכים תאיים (ירוק) להביע GFP היגרודרך interstitum השחלות של השחלה בילוד. GFP / מורכב זקיק (D) WT המכיל תאי אנדותל, שמוצגים על ידי ביטוי של CD31 אנדותל סמן תא (אדום). GFP (E) / מורכב זקיק WT המכיל תאים עצביים, שמוצגים על ידי ביטוי של טובולין בטא סמן העצבי III (ראה כאן כאדום, או צהוב אם עם GFP-פעמיים שכותרתו, ירוקות). מורכב (F) YFP / WT זקיק, שבו YFP מתייחס לזקיק מעכבר Thy1-YFP שיש ביטוי מזדמן של חלבון פלואורסצנטי הצהוב (YFP: צהוב) בתת-קבוצה של תאים עצביים 9, שהראה כי תאי עצב להאריך מזקיק YFP. ברים 50 מיקרומטר (A, B, D), 100 מיקרומטר (C, E, F), 100 מיקרומטר (הבלעה ב), 10 מיקרומטר (הבלעה בC), 15 מיקרומטר (הבלעה בD). לשכפל מאל Campbell et. 7 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52458/52458fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של fi זה</a>תרשים.

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles at JoVE.com

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

פרוטוקול זה מתאר את התרבות העיקרית / שיתוף התרבות של רקמת השחלה עכבר, באמצעות השחלות מעכברים בילוד וזקיקים בשחלות בודדות מעכברים לפני גיל בגרות מיניים. טכניקות התרבות לתמוך בפיתוח באופן פיסיולוגי מאוד, המאפשר חקירה של ההשפעה של סוכנים חיצוניים בשחלה, ושל יחסי גומלין בין זקיקים בשחלות.

תרבות ושיתוף התרבות של עכבר שחלות וזקיקים בשחלות

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

גישת optogenetic להערכת יצירת קשרים עצביים במערכת Co-תרבות

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex הרחם Electroporation וOrganotypic Slice תרבות של רקמות העכבר בהיפוקמפוס

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

דגם 3D Organotypic משותף תרבות תמיכה למניעת הפצת נשק מדולרי הרתי אפיתל תאים, התמיינות וביטוי גנים מופקר

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

במבחנה צמיחה של העכבר זקיקים Preantral תחת Microgravity מדומה

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

דיספציה ותרבות של כליה עובריים עכבר

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

וזמינותו תרבות משותפת הטבעת אבי העורקים: כלי נוח כדי להעריך את הפוטנציאל אנגיוגנזה של תאי סטרומה Mesenchymal במבחנה

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

חיתוך, צביעה של השחלות הגולמי דרוזופילה

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

ניתוח המשובטים של תא גזע Hematopoietic מבשרי באמצעות אינדקס תא בודד מיון משולב עם תאי אנדותל נישה תרבות משותפת

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Immunofluorescence הר שלמה, זקיק כימות של השחלות תרבותי. העכבר

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...