Name: culture and co-culture of mouse ovaries and ovarian follicles
Uploaded: 2015-03-17T14:00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles at JoVE.com

Work was funded by MRC grant G1002118.

<ol>
	<li>Brien, M. J., Pendola, F. L., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+protocol+for+in+vitro+development+of+mouse+oocytes+from+primordial+follicles+dramatically+improves+their+developmental+competence.">A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental competence.</a> Biol. Reprod. 68 (5), 1682-1686 (2003).</li><li>Fortune, J. E., Yang, M. Y., Muruvi, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+earliest+stages+of+follicle+development:+follicle+formation+and+activation.">The earliest stages of follicle development: follicle formation and activation.</a> Soc. Reprod. Fertil. Suppl. 67, 203-216 (2010).</li><li>McLaughlin, M., Kinnell, H. L., Anderson, R. A., Telfer, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+phosphatase+and+tensin+homologue+(PTEN)+in+human+ovary+in+vitro+results+in+increased+activation+of+primordial+follicles+but+compromises+development+of+growing+follicles.">Inhibition of phosphatase and tensin homologue (PTEN) in human ovary in vitro results in increased activation of primordial follicles but compromises development of growing follicles.</a> Mol. Hum. Reprod. 20 (8), 736-744 (2014).</li><li>Morgan, S., Lopes, F., Gourley, C., Anderson, R. A., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisplatin+and+doxorubicin+induce+distinct+mechanisms+of+ovarian+follicle+loss;+imatinib+provides+selective+protection+only+against+cisplatin.">Cisplatin and doxorubicin induce distinct mechanisms of ovarian follicle loss; imatinib provides selective protection only against cisplatin.</a> PLoS One. 8 (7), e70117 (2013).</li><li>Murray, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Follicular+growth+and+oocyte+competence+in+the+in+vitro+cultured+mouse+follicle:+effects+of+gonadotrophins+and+steroids.">Follicular growth and oocyte competence in the in vitro cultured mouse follicle: effects of gonadotrophins and steroids.</a> Mol Hum Reprod. 14 (2), 75-83 (2008).</li><li>Baker, S. J., Srsen, V., Lapping, R., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+effect+of+follicle-follicle+interactions+and+declining+follicle-stimulating+hormone+on+murine+follicle+health+in+vitro.">Combined effect of follicle-follicle interactions and declining follicle-stimulating hormone on murine follicle health in vitro.</a> Biol. Reprod. 65 (4), 1304-1310 (2001).</li><li>Campbell, L., Trendell, J., Spears, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+cells+migrating+from+the+thecal+layer+of+ovarian+follicles.">Identification of cells migrating from the thecal layer of ovarian follicles.</a> Cell Tissue Res. 353 (1), 189-194 (2013).</li><li>Pratt, T., Sharp, L., Nichols, J., Price, D. J., Mason, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+and+transgenic+mice+ubiquitously+expressing+a+tau-tagged+green+fluorescent+protein.">Embryonic stem cells and transgenic mice ubiquitously expressing a tau-tagged green fluorescent protein.</a> Dev. Biol. 228 (1), 19-28 (2000).</li><li>Feng, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP.">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li><li>Maiani, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reply+to:+cisplatin-induced+primordial+follicle+oocyte+killing+and+loss+of+fertility+are+not+prevented+by+imatinib.">Reply to: cisplatin-induced primordial follicle oocyte killing and loss of fertility are not prevented by imatinib.</a> Nat. Med. 18 (8), 1172-1174 (2012).</li><li>Spears, N., Bruin, d. r., Gosden, J. P., G, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+establishment+of+follicular+dominance+in+co-cultured+mouse+ovarian+follicles.">The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles.</a> J. Reprod. Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).</li><li>Desmeules, P., Devine, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+the+ovotoxicity+of+cyclophosphamide+metabolites+on+cultured+mouse+ovaries.">Characterizing the ovotoxicity of cyclophosphamide metabolites on cultured mouse ovaries.</a> Toxicol. Sc. 90 (2), 500-509 (2006).</li><li>Tagler, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+extracellular+matrix+remodelling+via+ascorbic+acid+enhances+the+survival+of+primary+ovarian+follicles+encapsulated+in+alginate+hydrogels.">Promoting extracellular matrix remodelling via ascorbic acid enhances the survival of primary ovarian follicles encapsulated in alginate hydrogels.</a> Biotechnol. Bioeng. 111 (7), 1417-1429 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Мы описываем здесь различные системы культуры, которые могут быть использованы для поддержки развития мыши фолликулов яичников в пробирке, используя целые новорожденных яичники, содержащие только самые ранние этапы фолликула, индивидуальные preantral фолликулов, а также со-культур двух тканей. Культура новорожденных яичников мыши выступает за скорейшее развития яичников, особенно фолликула начало роста до второй стадии фолликула. Диапазон возрасте от новорожденных мышей могут быть использованы для этих культур, в зависимости от стадии развития, представляющих интерес. Если яичники получают из новорожденных мышей, формирование фолликула будет на ходу, но еще не завершен: культура, по крайней мере частично поддерживает формирование постоянного фолликула с последующим ростом фолликула. Кроме того, использование яичников мышей вокруг четырех до пяти дней возраста (с помощью которых формирование время фолликул уже завершена) результаты в культуре большего числа изначальной и растущей FOLLICles 12. Полезные аспекты конкретного метода, описанного здесь, включают в себя использование плавающей поликарбонатные мембраны, которые позволяют более оксигенации ткани, и культуру в очень щелочной среде, состоящей из единственного αMEM и BSA, избегая использования неопределенных добавок, таких как сыворотка. Культура всей яичников, кажется, не для поддержки развития за пределами вторичной стадии фолликула, с последующим развитием требующие изменения в технике, например, рассечение фолликул-клеток гранулезы комплексов из культуральной новорожденных яичника 1. На более поздних стадиях развития фолликула могут быть разработаны в пробирке путем вскрытия индивидуальные, нетронутых поздно предварительно антральных фолликулов, которые могут быть выращены в преовуляторного этапе в культуре, сохраняя их трехмерную структуру. Использование интактных фолликулов по этой методике культуральной поддерживает связь между различными фолликулярных компонентов, как это происходит в естественных условиях. Тхис системой культуры могут быть использованы для получения ооцитов, которые могут поддерживать оплодотворение и последующее развитие эмбрионов. Оплодотворению ооциты могут быть также получены из мышиного новорожденных яичников с использованием первоначальной протокол много, как описано здесь, культуру, за которым следует второй этап, во время которого ооцит-клеток гранулезы комплексы, выращенные в пробирке 1. Другие системы, используемые в настоящее время довольно часто включают в себя культуру фолликулов яичника или ткани, который был инкапсулированных в материал, такой как альгинат гидрогель, чтобы обеспечить поддержку (см, например, Tagler др. 13). Большая часть внимания разработке метода состоит в повышении методы культуры в яичниках и фолликулов крупных млекопитающих, с долгосрочной целью получения fertilisable ооцитов из примордиальных фолликулов от ряда видов, включая человека. В любой момент времени, яичников млекопитающих содержат фолликулы в диапазоне стадиях развития, с interactioнс между фолликулов, влияющих на их регулирования. Этот аспект функции яичников плохо понимают и трудно изучить в естественных условиях. Последний метод, описанный здесь использует систему взаимоотношений культуры, чтобы поддержать развитие различных этапах фолликулов в пробирке. При необходимости, один или оба ткани могут быть предварительно обработаны в естественных условиях или в пробирке до совместного культивирования. Сотрудничество культуры системы, такие как это обеспечить идеальный способ, в котором для изучения фолликула фолликула взаимодействия, например, как растет, антральных фолликулов влияет на изначальную фолликула бассейн, аспекты яичников биологии, которые оказались трудно не рассмотреть до сих пор. Целые яичников методы культуры довольно просты, хотя при внимательном рассечение требуется, чтобы избежать случайных повреждений тканей. Вскрытие отдельных фолликулов специализированная техника, требующая повторной практики, прежде чем фолликулы в нужное стадии можно разрезать из яичника не повреждена. Очень важно,чтобы рассекать из отдельных фолликулов с осторожностью, или ущерб, понесенный во время протокола вскрытия может привести к фолликула смерти во время последующего периода культивирования. Там, где фолликулы расположены непосредственно в лунку микротитрационных планшетах, важно использовать только без тканевой культуры обработанных пластмасс, чтобы свести к минимуму нанесение вниз гнойный клеток на пластике: при использовании культуры ткани обрабатывают Пластик, фолликулы будет приложить к База скважины и разрыв, как они растут. Для всех со-культуры работы, ткани должны быть расположены в непосредственном контакте друг с другом. Среду описано выше для использования в технике культивировани фолликулов включает добавление мышиной сыворотки. Можно заменить сыворотки мыши с эмбриональной бычьей сыворотки, но только случайные партии такой сыворотки будет полностью поддерживать развитие фолликула в преовуляторного стадии, с пакетной проверки необходимо определить подходящие источники. Batch-тестирование ФСГ Кроме того, целесообразно, как Международный UniTS, с помощью которого ФСГ оценивается коррелируют только грубо роста фолликулов в пробирке. Если разрыв фолликула обычно происходит во время периода культивирования, рассмотреть вопрос о замене акции аскорбиновую кислоту с новой партией. Методы не требуют специального оборудования, особенно, кроме рассекающих микроскопов и тканевой культуры инкубаторов, хотя использование колпака с ламинарным потоком и хорошей стерильных позволить фолликулы, чтобы культивировать в отсутствие антибиотиков, как в способах, описанных здесь. Это может быть полезно, чтобы избежать возможной отрицательное влияние антибиотиков на ооциты, в особенности, если они будут оплодотворены после культуры. Там, где это не возможно, чтобы работать в стерильной среде, желательно добавлять антибиотики, чтобы рассечение и питательных сред.

Яичников млекопитающих состоит из самки жизни поставку ооцитов, каждый из которых находится в пределах фолликула яичника. Фолликулы формируются еще до рождения на Приюте, изначальная стадия: когда фолликул бассейн Установлено, есть постоянное и постепенное движение фолликулов из изначальной в растущий фолликул бассейн. Как фолликулы начинают расти, они развивают в начальных, средних, preantral, а затем антральных стадиях, пока они не достигнут преовуляторных или Graafian, этап. Только ооциты из преовуляторных фолликулов имеют полный компетенции развитием, в состоянии поддерживать эмбриональное развитие в перспективе, если оплодотворена. Яичник Давно известно, развиваться в высокой физиологической образом в пробирке. Это, вероятно, будет из-за каждого фолликула, содержащего внутри себя клетки, необходимые для поддержки яйцеклетки из незрелой стадии (в этот момент он не в состоянии завершить свою деления мейоза), через ТОн развитием компетентным этап (в этот момент он может полностью поддерживать завершение мейоза, оплодотворения и развития эмбриона в результате к перспективе). Физиологический характер развития яичников в пробирке привело к широкому использованию яичника методов культивирования. Следовательно, методы в пробирке были использованы для изучения регуляции развития яичников, рак яичников, патологии (например, что из синдрома поликистозных яичников, СПКЯ), проверка того, как яичники / ооциты зависит от воздействия химических веществ, а также с практической целью получение оплодотворению яйцеклетки из первичных фолликулов. На сегодняшний день, последняя была достигнута только с помощью мыши ткани яичника 1, хотя методы культивирования с использованием фолликулы из крупных млекопитающих, включая человека, значительно улучшилась в последние годы 2,3. Здесь мы опишем несколько методов культивирования с использованием мыши ткани яичника. Первый метоd использует целые новорожденных яичники мыши, и поддерживает образование и раннее развитие первичных фолликулов 4. Вторая система поддерживает рост отдельных, нетронутых фолликулов с конца preantral к преовуляторного этапе; с помощью этой техники, фолликулы можно культивировать в отдельности, или в парах 5,6. Наконец, мы опишем систему совместного культивирования, сочетающий в себе первые два метода в метод, который позволяет исследовать взаимодействия между ростом и первичных фолликулов 7. Культура отдельных интактных фолликулов в яичниках позволяет рост фолликула быть определена из ежедневных измерений фолликула в период культуры, в то время как средний анализ позволяет исследовать фолликула / яичников выработку гормонов. Дальнейший анализ ткани может быть достигнуто посредством сбора фолликулов яичника или ткани в конце культуры, для гистологических анализов / иммуногистологических или для последующей обработки, например, для получениямРНК или белка.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="740">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Name of the Material/Equipment</td>
			<td style="width:159px;">Company</td>
			<td style="width:151px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:265px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Leibowitz L15</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">11415049</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">&#945;MEM</td>
			<td style="width:159px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:151px;">22571020</td>
			<td style="width:265px;">Supplied as sodium bicarbonate buffered (2200 mg/L)</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A9418</td>
			<td style="width:265px;">For dissection medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A3311</td>
			<td style="width:265px;">For culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Bovine serum albumin</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A2153</td>
			<td style="width:265px;">For coating glass pipettes</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Mouse serum</td>
			<td style="width:159px;">-</td>
			<td style="width:151px;">-</td>
			<td style="width:265px;">Collected from cardiac puncture</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">FSH</td>
			<td style="width:159px;">Merck Serono</td>
			<td style="width:151px;">Gonal F</td>
			<td style="width:265px;">Batch testing is often necessary. Make up stock solution of 1IU/10&#181;l in &#945;MEM and store at -20&#176;C.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Ascorbic acid</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">A4034</td>
			<td style="width:265px;">Make up stock of 5mg/ml in &#945;MEM and store at -20&#176;C.&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Silicon oil</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:151px;">630064V</td>
			<td style="width:265px;">Dow Corning Silicone Fluid 200/50cS</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Syringe filters (25mm, 0.2&#181;m)</td>
			<td style="width:159px;">Greiner</td>
			<td style="width:151px;">16532K</td>
			<td style="width:265px;">Cellulose acetate filter: for filtering larger (&#62; 5mls) volumes of medium.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Syringe filters (13mm, 0.2&#181;m)</td>
			<td style="width:159px;">Iwaki</td>
			<td style="width:151px;">3032-013</td>
			<td style="width:265px;">Cellulose acetate filter: for filtering smaller (&#60; 5mls) volumes of medium</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Syringe filters (25mm, 0.45&#181;m)</td>
			<td style="width:159px;">Iwaki</td>
			<td style="width:151px;">2053-025</td>
			<td style="width:265px;">Cellulose acetate filter: for filtering oil.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Sterile tubes</td>
			<td style="width:159px;">Greiner</td>
			<td style="width:151px;">187261</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">24 well plate</td>
			<td style="width:159px;">Greiner</td>
			<td style="width:151px;">662160</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">96 well round bottom plate</td>
			<td style="width:159px;">Iwaki</td>
			<td style="width:151px;">3875-096</td>
			<td style="width:265px;">Use only non-tissue culture treated plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">96 well flat bottomed well</td>
			<td style="width:159px;">Iwaki</td>
			<td style="width:151px;">3860-096</td>
			<td style="width:265px;">Use only non-tissue culture treated plates</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Whatman nucleopore membranes</td>
			<td style="width:159px;">Camlab</td>
			<td style="width:151px;">WN/110414</td>
			<td style="width:265px;">Use shiny surface up, polycarbonate, 13mm diameter, 8.0&#181;m pore size</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Insulin needles</td>
			<td style="width:159px;">BD medical supplies</td>
			<td style="width:151px;">037-7606</td>
			<td style="width:265px;">0.33mm (29G) +1ml</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Glass embryo dishes</td>
			<td style="width:159px;">VWR</td>
			<td style="width:151px;">720-0579</td>
			<td style="width:265px;">Sterilise then warm before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Glass pipettes</td>
			<td style="width:159px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:151px;">10209381</td>
			<td style="width:265px;">BSA coated before use</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Gel tips</td>
			<td style="width:159px;">AlphaLabs</td>
			<td style="width:151px;">LW1103</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">Acupuncture needles</td>
			<td style="width:159px;">Acumedic LTD</td>
			<td style="width:151px;">30mmx0.25 Type C</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Bouin&#8217;s fixative&#160;</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:151px;">HT10132-1L</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:159px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>HT5014-120ml</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:167px;">1.5 ml polypropylene tubes</td>
			<td style="width:159px;">Greiner BioOne</td>
			<td align="right">616201</td>
			<td style="width:265px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

culture and co-culture of mouse ovaries and ovarian follicles

Яичников млекопитающих состоит из фолликулов яичников, каждый фолликул, состоящий из одного ооцита, окруженного соматических клеток гранулезы, заключенный вместе в базальной мембране. Конечная бассейн фолликулов были заложены в период эмбрионального развития, когда ооциты в остановку мейоза образуют тесную связь с плоскими клетками гранулезы, образуя первичные фолликулы. По или вскоре после рождения, яичники млекопитающих содержат запас их жизни в изначальных фолликулов, из которых точка года есть устойчивый выпуск фолликулов в растущую фолликулярной бассейн. Яичников особенно подходит для развития в пробирке, с фолликулами растет в очень физиологическом уровне в культуре. Эта работа описывает культуру целых новорожденных яичников, содержащих первичные фолликулы, и культура отдельных фолликулов, метод, который может поддержать развитие фолликулов из незрелых через к preovulatory стадии, после чего их ооциты способны пройти искусственного оплодотворения. Работа, изложенная здесь использует системы культуры, чтобы определить, как яичник зависит от воздействия внешних соединений. Мы также описать систему совместного культура, которая позволяет исследовать взаимодействие, которое происходит между ростом фолликулов и без растущего числа первичных фолликулов.

На рисунке 1 показана изображения яичников и фолликулов в начале и в ходе процедур культуры. Рисунок 2 показывает репрезентативные результаты новорожденных яичников (здесь, яичников новорожденных щенков), находящегося репродуктивных токсикантов в процессе культивирования. Неонатальные яичников культивировали в течение 6 дней, и подвергают воздействию химиотерапии препарата, либо цисплатин или доксорубицин, на 2-й день культуры. В конце культуры, яичников были зафиксированы, обработаны для гистологического и яичников затем исследовали, чтобы определить число здоровых и нездоровых овариальных фолликулов 4. С другой стороны, в более быстром оценка ранних растущих фолликулов может быть получено из культуры яичников фрагментов, используя яичники от мыши, экспрессирующие ооцита конкретных флуоресцентный маркер 10. Во время культивирования отдельных фолликулов, рост фолликула может быть легко установлено путем ежедневных измерений во время кульПериод ра. Рисунок 3 показывает репрезентативные результаты роста фолликулов, культивированных в присутствии или отсутствии гонадотропин гормонов фолликулостимулирующего гормона (ФСГ) и лютеинизирующий гормон (ЛГ) 5. Фолликулостимулирующий фолликул или фолликулостимулирующего яичников совместно культуры могут быть использованы для изучения взаимодействия между фолликулов. В зависимости от ткани и обработки изображения может быть получено с использованием светлого поля, флуоресценции или конфокальной микроскопы. Рисунок 4 показывает репрезентативные результаты изображений из таких совместных культурах, рассматривая различные типы клеток, участвующих в фолликулостимулирующего фолликула связи, в том числе эндотелиальных и нейронных клеток 7. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig1highres.jpg" width="650" /> Рисунок 1: (А) Микрофотография новорожденных яичника, полученного от мыши в день рождения, помещен<html> на поликарбонатную мембрану. (B) Микрофотография недавно расчлененный здоровый фолликула яичника, причем большинство из окружающего стромы ткани отсечен. (C) Микрофотографии совместного культивирования двух фолликулов яичников в течение первых трех дней культуры, показывающие тесную связь, которая возникает между двумя фолликулов, как культура выручки (ДИ: первый день культуры; CII: второй день культуры; C-III : третий день культуры). Воспроизводится по Спирс и др. 11 (D) Микрофотография со-культурный preantral фолликула и новорожденных яичника после двух дней культуры. Изображение показывает фолликул становится заключено в яичнике. Стрелка показывает preantral фолликул. Изображение от Доктора Федерика Лопес. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52458/52458fig1highres.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.</a> цифра 2 &quot;SRC =&quot; / файлы / ftp_upload / 52458 / 52458fig2.jpg &quot;/&gt; Рисунок 2: Влияние химиотерапии препаратами цисплатин и доксорубицин на новорожденных культивируемых яичников цисплатин и доксорубицин оба ведут к потере здоровья фолликула и сокращение численности фолликула.. () Цисплатин; (B) Доксорубицин: (я) Процент нездоровых фолликулов (CLEAR); и (II) Общее количество фолликулов (заштрихованы) в каждом яичнике. Бары обозначения означает + сем; N = 5 для всех групп, звезды обозначают существенные различия по сравнению с контролем (* р &lt;0,05, ** р &lt;0,01, *** р &lt;0,001). Воспроизводится по Моргана и др. 4 <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig3.jpg" width="400" /> Рисунок 3:. Темпы роста фолликулов, подвергшихся воздействию различных гонадотропина условиях приведены средние значения ± SEM (п ≥16 для каждой группы). Стрелка указывает на начало ANTRAформирование л во всех гонадотропин групп. Воспроизводится с Мюррей и др. 5 <img alt="Рисунок 4" src="/files/ftp_upload/52458/52458fig4highres.jpg" width="650" /> Рисунок 4: Изображения из фолликулостимулирующего фолликула и яичников фолликул-со-культур, показывающие фолликулостимулирующего фолликула взаимодействия (А) конфокальной микроскопический снимок зеленого флуоресцентного белка (GFP), фолликулостимулирующего и дикого типа (WT) фолликула после совместного культивирования (. GFP выражение показано здесь в белом), с процессами из GFP фолликула показаны проходящими над фолликула WT. (В) Сечение через GFP / фолликула комплекса WT после совместного культуры, показывая, что GFP процессов (зеленые) от прилегающей фолликулов лежат прилегающей к базальной пластинки фолликула мас. (C) новорожденных WT яичников после культуру с предварительно антральных GFP-экспрессирующих фолликул, показывая, что GFP клетки и клеточные процессы (зеленый) мигрироваличерез яичников interstitum неонатального яичника. (D) GFP / фолликула комплекс WT, содержащий эндотелиальные клетки, показанные выражения эндотелиальных клеток маркера CD31 (красный). (E) GFP / фолликула комплекс WT, содержащий нервных клеток, показанные выражения нейронального маркера бета тубулина III (см здесь как красный, или в виде желтого если дважды помечены GFP, зеленый). Фолликул комплекс (F) YFP / WT, где YFP относится к фолликул от мыши Thy1-YFP, который имеет случайный экспрессии желтого флуоресцентного белка (YFP: желтый) в подмножестве нервных клеток 9, показывают, что нейроны проходят от фолликула YFP. Бары 50 мкм (А, В, D), 100 мкм (С, Е, F), 100 мкм (вставка в A), 10 мкм (вставка в C), 15 мкм (вставка в D). Воспроизводится с Кэмпбелл и др. 7 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52458/52458fig4highres.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого Fi</a>фигура.

Watch this Scientific Journal Video about Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles at JoVE.com

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Этот протокол описывает первичной культуры / со-культуры ткани яичника мыши, используя яичников новорожденных мышей и отдельных фолликулов яичника от препубертатном мышей. Методы поддержки культуры развития в очень физиологическом уровне, что позволяет исследовать влияние внешних агентов на яичнике, а взаимодействия между фолликулов.

Культура и Co-Культура мыши яичников и фолликулов в яичниках

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

An Optogenetic Approach for Assessing Formation of Neuronal Connections in a Co-culture System

Optogenetic подход к оценке Формирование нейронные связи в совместной культуре системы

Here we describe a protocol to generate a co-culture consisting of 2 different neuronal populations. Induced pluripotent stem cells (iPSCs) are ...

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Ex Utero Electroporation and Organotypic Slice Culture of Mouse Hippocampal Tissue

Экс Utero электропорации и Органотипической фрагмент Культура мыши ткани гиппокампа

Mouse genetics offers a powerful tool determining the role of specific genes during development. Analyzing the resulting phenotypes by immunohistochemical ...

3D Organotypic Co-culture Model Supporting Medullary Thymic Epithelial Cell Proliferation, Differentiation and Promiscuous Gene Expression

3D Органотипической Совместное культивирование Модель поддержки Медуллярный тимуса эпителиальных клеток пролиферации, дифференцировки и Promiscuous экспрессии генов

Intra-thymic T cell development requires an intricate three-dimensional meshwork composed of various stromal cells, i.e., non-T cells. Thymocytes traverse ...

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

В пробирке Рост Preantral фолликулов мыши под искусственной микрогравитации

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Dissection and Culture of Mouse Embryonic Kidney

Диссекция и культура мышей эмбриональной почки

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection, isolation, and culture of mouse metanephric rudiments. 
During mammalian kidney ...

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

The Aortic Ring Co-culture Assay: A Convenient Tool to Assess the Angiogenic Potential of Mesenchymal Stromal Cells In Vitro

Assay Сопредседатель культуры аортального кольца: Удобным инструментом для оценки потенциала ангиогенных мезенхимальных стромальных клеток In Vitro

Angiogenesis is a complex, highly regulated process responsible for providing and maintaining adequate tissue perfusion. Insufficient vasculature ...

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Dissection and Staining of Drosophila Pupal Ovaries

Рассечение и пятнать дрозофилы куколки яичников

Unlike adult Drosophila ovaries, pupal ovaries are relatively difficult to access and examine due to their small size, translucence, and encasing within a ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Клональный анализ прекурсоров эмбриональных гемопоэтических стволовых клеток с использованием индекса одну ячейку Сортировка в сочетании с эндотелиальных клеток нишу Сопредседатель культуры

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Whole Mount Immunofluorescence and Follicle Quantification of Cultured Mouse Ovaries

Вся гора иммунофлюоресценции и количественная оценка фолликула культивировали мыши яичников

Research in the field of mammalian reproductive biology often involves evaluating the overall health of ovaries and testes. Specifically, in females, ...