Name: techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry
Uploaded: 2015-03-17T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry at JoVE.com

Yazarlar enstrüman ayarları sitometrede akışı ile yaptığı yardım için kan Sistemler Araştırma Enstitüsü&#39;nden Dale Hirschkorn teşekkür etmek istiyorum. NIH tarafından desteklenen bu çalışma HL095470 ve U01 HL072268 ve DoD sözleşmeleri W81XWH-10-1-0023 ve W81XWH-2-0028 verir.

Not: Aşağıdaki protokoller, insan refahı için tüm kurumsal, ulusal ve uluslararası kurallara uygun olarak yapılmıştır. Bütün insan konu örnekleri kurumsal inceleme kurulu (KİK) -onaylı protokol kapsamında ve konuların bilgilendirilmiş rızası ile test edildi. 1. YÖNTEM A: Bireysel Algılama Yöntemi AGH Kan Örneği / İzolasyon 1.1) İşleme <ol><li> Aşağıdaki 2 adımlı diferansiyel santrifüj protokolü kullanılarak ACD-Solüsyon A ya d...

<ol>
	<li>Andaloussi, S., M&#228;ger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).</li><li>Sugawara, A., Nollet, K. E., Yajima, K., Saito, S., Ohto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preventing+platelet-derived+microparticle+formation--and+possible+side+effects-with+prestorage+leukofiltration+of+whole+blood.">Preventing platelet-derived microparticle formation--and possible side effects-with prestorage leukofiltration of whole blood.</a> Archives of Pathology &amp; Laboratory Medicine. 134 (5), 771-775 (2010).</li><li>Th&#233;ry, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses.">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nature Reviews Immunology. 9 (8), 581-593 (2009).</li><li>Mause, S. F., Weber, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microparticles+Protagonists+of+a+Novel+Communication+Network+for+Intercellular+Information+Exchange.">Microparticles Protagonists of a Novel Communication Network for Intercellular Information Exchange.</a> Circulation Research. 107 (9), 1047-1057 (2010).</li><li>Bouvy, C., Gheldof, D., Chatelain, C., Mullier, F., Dogne, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contributing+role+of+extracellular+vesicles+on+vascular+endothelium+haemostatic+balance+in+cancer.">Contributing role of extracellular vesicles on vascular endothelium haemostatic balance in cancer.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).</li><li>Hood, J. L., San, R. S., Wickline, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+Released+by+Melanoma+Cells+Prepare+Sentinel+Lymph+Nodes+for+Tumor+Metastasis.">Exosomes Released by Melanoma Cells Prepare Sentinel Lymph Nodes for Tumor Metastasis.</a> Cancer Research. 71 (11), 3792-3801 (2011).</li><li>Gatti, S., Bruno, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+derived+from+human+adult+mesenchymal+stem+cells+protect+against+ischaemia-reperfusion-induced+acute+and+chronic+kidney+injury.">Microvesicles derived from human adult mesenchymal stem cells protect against ischaemia-reperfusion-induced acute and chronic kidney injury.</a> Nephrology Dialysis Transplantation. 26 (5), 1474-1483 (2011).</li><li>Barteneva, N. S., Fasler-Kan, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microparticles:+square+the+circle.">Circulating microparticles: square the circle.</a> BMC Cell Biology. 14 (1), 23 (2013).</li><li>Van der Pol, E., B&#246;ing, A. N., Harrison, P., Sturk, A., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Classification+functions,+and+clinical+relevance+of+extracellular+vesicles.">Classification functions, and clinical relevance of extracellular vesicles.</a> Pharmacological Reviews. 64 (3), 676-705 (2012).</li><li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Dinkla, S., Brock, R., Joosten, I., Bosman, G. J. C. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gateway+to+understanding+microparticles:+standardized+isolation+and+identification+of+plasma+membrane-derived+vesicles.">Gateway to understanding microparticles: standardized isolation and identification of plasma membrane-derived vesicles.</a> Nanomedicine (London, England). 8 (10), (2013).</li><li>Witwer, K. W., Buzas, E. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).</li><li>Shah, M. D., Bergeron, A. L., Dong, J. -. F., L&#243;pez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+measurement+of+microparticles:+Pitfalls+and+protocol+modifications.">Flow cytometric measurement of microparticles: Pitfalls and protocol modifications.</a> Platelets. 19 (5), 365-372 (2008).</li><li>Dey-Hazra, E., Hertel, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+circulating+microparticles+by+flow+cytometry:+influence+of+centrifugation,+filtration+of+buffer,+and+freezing.">Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing.</a> Vascular Health and Risk Management. 6, 1125-1133 (2010).</li><li>Lacroix, R., Judicone, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+pre-analytical+variables+in+plasma+microparticle+determination:+results+of+the+International+Society+on+Thrombosis+and+Haemostasis+SSC+Collaborative+workshop.">Standardization of pre-analytical variables in plasma microparticle determination: results of the International Society on Thrombosis and Haemostasis SSC Collaborative workshop.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (6), 1190-1193 (2013).</li><li>Mullier, F., Bailly, N., Chatelain, C., Chatelain, B., Dogn&#233;, J. -. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pre-analytical+issues+in+the+measurement+of+circulating+microparticles:+current+recommendations+and+pending+questions.">Pre-analytical issues in the measurement of circulating microparticles: current recommendations and pending questions.</a> Journal of Thrombosis and Haemostasis. 11 (4), 693-696 (2013).</li><li>Peramo, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physical+Characterization+of+Mouse+Deep+Vein+Thrombosis+Derived+Microparticles+by+Differential+Filtration+with+Nanopore+Filters.">Physical Characterization of Mouse Deep Vein Thrombosis Derived Microparticles by Differential Filtration with Nanopore Filters.</a> Membranes. 2 (1), 1-15 (2012).</li><li>Tilley, R. E., Holscher, T., Belani, R., Nieva, J., Mackman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+Factor+Activity+is+Increased+in+a+Combined+Platelet+and+Microparticle+Sample+from+Cancer+Patients.">Tissue Factor Activity is Increased in a Combined Platelet and Microparticle Sample from Cancer Patients.</a> Thrombosis research. 122 (5), 604-609 (2008).</li><li>Rood, I. M., Deegens, J. K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+three+methods+for+isolation+of+urinary+microvesicles+to+identify+biomarkers+of+nephrotic+syndrome.">Comparison of three methods for isolation of urinary microvesicles to identify biomarkers of nephrotic syndrome.</a> Kidney international. 78 (8), 810-816 (2010).</li><li>Van der Pol, E., Hoekstra, A. G., Sturk, A., Otto, C., van Leeuwen, T. G., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+and+non-optical+methods+for+detection+and+characterization+of+microparticles+and+exosomes.">Optical and non-optical methods for detection and characterization of microparticles and exosomes.</a> Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 8 (12), 2596-2607 (2010).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Szab&#243;, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+vesicles,+current+state-of-the-art:+emerging+role+of+extracellular+vesicles.">Membrane vesicles, current state-of-the-art: emerging role of extracellular vesicles.</a> Cellular and Molecular Life Sciences. 68 (16), 2667-2688 (2011).</li><li>Miguet, L., Be&#769;chade, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+Analysis+of+Malignant+B-Cell+Derived+Microparticles+Reveals+CD148+as+a+Potentially+Useful+Antigenic+Biomarker+for+Mantle+Cell+Lymphoma+Diagnosis.">Proteomic Analysis of Malignant B-Cell Derived Microparticles Reveals CD148 as a Potentially Useful Antigenic Biomarker for Mantle Cell Lymphoma Diagnosis.</a> Journal of Proteome Research. 8 (7), 3346-3354 (2009).</li><li>Smalley, D. M., Root, K. E., Cho, H., Ross, M. M., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+discovery+of+21+proteins+expressed+in+human+plasma-derived+but+not+platelet-derived+microparticles.">Proteomic discovery of 21 proteins expressed in human plasma-derived but not platelet-derived microparticles.</a> Thrombosis and Haemostasis. 97 (1), 67-80 (2007).</li><li>Lacroix, R., Robert, S., Poncelet, P., Dignat-George, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overcoming+Limitations+of+Microparticle+Measurement+by+Flow+Cytometry.">Overcoming Limitations of Microparticle Measurement by Flow Cytometry.</a> Seminars in Thrombosis and Hemostasis. 36 (08), 807-818 (2010).</li><li>Mobarrez, F., Antovic, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicolor+flow+cytometric+assay+for+measurement+of+platelet-derived+microparticles.">A multicolor flow cytometric assay for measurement of platelet-derived microparticles.</a> Thrombosis Research. 125 (3), e110-e116 (2010).</li><li>Van der Pol, E., van Gemert, M. J. C., Sturk, A., Nieuwland, R., van Leeuwen, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+vs.+swarm+detection+of+microparticles+and+exosomes+by+flow+cytometry.">Single vs. swarm detection of microparticles and exosomes by flow cytometry.</a> Journal of Thrombosis And Haemostasis: JTH. 10 (5), 919-930 (2012).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Szab&#243;, T. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Flow+Cytometric+Assessment+Reveals+Distinct+Microvesicle+(Cell-Derived+Microparticle)+Signatures+in+Joint+Diseases.">Improved Flow Cytometric Assessment Reveals Distinct Microvesicle (Cell-Derived Microparticle) Signatures in Joint Diseases.</a> PLoS ONE. 7 (11), e49726 (2012).</li><li>Gy&#246;rgy, B., M&#243;dos, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+isolation+of+cell-derived+microparticles+are+compromised+by+protein+complexes+resulting+from+shared+biophysical+parameters.">Detection and isolation of cell-derived microparticles are compromised by protein complexes resulting from shared biophysical parameters.</a> Blood. 117 (4), e39-e48 (2011).</li><li>Gy&#246;rgy, B., Pasztoi, M., Buzas, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Response:+systematic+use+of+Triton+lysis+as+a+control+for+microvesicle+labeling.">Response: systematic use of Triton lysis as a control for microvesicle labeling.</a> Blood. 119 (9), 2175-2176 (2012).</li><li>Trummer, A., De Rop, C., Tiede, A., Ganser, A., Eisert, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isotype+controls+in+phenotyping+and+quantification+of+microparticles:+a+major+source+of+error+and+how+to+evade+it.">Isotype controls in phenotyping and quantification of microparticles: a major source of error and how to evade it.</a> Thrombosis Research. 122 (5), 691-700 (2008).</li><li>Shet, A. S., Aras, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sickle+blood+contains+tissue+factor-positive+microparticles+derived+from+endothelial+cells+and+monocytes.">Sickle blood contains tissue factor-positive microparticles derived from endothelial cells and monocytes.</a> Blood. 102 (7), 2678-2683 (2003).</li><li>Connor, D. E., Exner, T., Ma, D. D. F., Joseph, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+majority+of+circulating+platelet-derived+microparticles+fail+to+bind+annexin+V,+lack+phospholipid-dependent+procoagulant+activity+and+demonstrate+greater+expression+of+glycoprotein+Ib.">The majority of circulating platelet-derived microparticles fail to bind annexin V, lack phospholipid-dependent procoagulant activity and demonstrate greater expression of glycoprotein Ib.</a> Thrombosis and Haemostasis. 103 (5), 1044-1052 (2010).</li><li>Nolte-&#8217;t Hoen, E. N. M., van der Vlist, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+and+qualitative+flow+cytometric+analysis+of+nanosized+cell-derived+membrane+vesicles.">Quantitative and qualitative flow cytometric analysis of nanosized cell-derived membrane vesicles.</a> Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, And Medicine. 8 (5), 712-720 (2012).</li><li>Van der Vlist, E. J., Nolte-&#8217;t Hoen, E. N. M., Stoorvogel, W., Arkesteijn, G. J. A., Wauben, M. H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+labeling+of+nano-sized+vesicles+released+by+cells+and+subsequent+quantitative+and+qualitative+analysis+by+high-resolution+flow+cytometry.">Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry.</a> Nature Protocols. 7 (7), 1311-1326 (2012).</li><li>Orozco, A. F., Lewis, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+circulating+microparticles+in+plasma.">Flow cytometric analysis of circulating microparticles in plasma.</a> Cytometry Part A. 77 A. 77A (6), 502-514 (2010).</li></ol>

İzolasyon, tedavi ve EVs analizi için iki farklı protokol tek bir algılama veya boncuk esaslı yaklaşım kullanılarak sunulmuştur. Kullanmak için en uygun yöntemi seçerek her zaman kolay değildir ve faiz bireysel alt popülasyonlar yanı sıra test edilen numunenin bir anlayış gerektirir. En uygun yöntemi tercih Bundan başka, satın alma için kullanılan sitometresinde duyarlılığı göz önünde bulundurulmalıdır. Çoğu zaman doğrusu yöntemlerin bir kombinasyonu, tek başına herhangi bir yöntem...

Hücre dışı veziküller (EVS) hücre-hücre iletişimine yüksek ilgili olan ve biyolojik süreçler çok çeşitli düzenlemeye yardımcı vücut sıvılarında bulunan küçük, zar-türevi veziküllerdir. Akış sitometrik (FCM) ile AGH analizi nedeniyle küçük boyutu ve ilgi belirteçleri için pozitif ayrık nüfus eksikliği bildiği zor olmuştur. Oldukça son on yılda geliştirilmiş EV analiz yöntemleri, hala devam eden bir çalışma vardır. Ne yazık ki, orada hiç kimse-boyut-uyan tüm protokol ve kullanmak için en uygun yöntemi belirlerken çeşitli yönleri dikkate alınmalıdır. Birkaç farklı işleme AGH için teknikler ve bireysel algılama veya boncuk-tabanlı bir yaklaşım kullanarak AGH analiz için iki protokol burada sundu. rasyonel f yaygın ticari preparatlarda bulunan antikor agregatları bertaraf yardımcı olacaktır Burada tarif edilen yöntemler, artan bir sinyal-gürültü oranı ve ayar kapılarıeşiğe tespitini en aza indirir ashion. İkinci protokol yakalamak ve küçük AGH ve eksozomlar tespit etmek için bir boncuk tabanlı bir yaklaşım kullanır iken ilk protokol, klinik örneklerin yüksek hacimli analiz etmek için özellikle uygundur bireysel algılama yöntemi kullanır. Ayrıca mikro şekilde bilinmektedir EVs, hücre-hücre iletişimine katılan ve biyolojik süreçler 1 çok çeşitli düzenlemeye yardımcı olan vücut sıvılarında bulunan küçük, zar-türevi veziküllerdir. 4 - Çeşitli yüzey belirteçleri ve / veya biyolojik maddenin doğrudan aktarımı ifadesi sayesinde, AGH aktive veya hücreler arası iletişimin 2 rol bastırmak ya oynamak için alıcı hücrelerin fonksiyonunu değiştirmek edebiliyoruz. Diğer tümör Metasta teşvik gelen, geniş bir şartlar aralığında katkıda gösterilmiştir ve Klinik, trombosit türevli EVs kuvvetli pıhtılaşmaya karşı etkinliğe 5 sahip olduğu bilinmektedirHastalığın 7 karşı korumaya sis 6. AGH boyutu ve kuşak 8 mekanizmaya bağlı olarak, bu tür bir eksozom ve microvesicles (MVs) gibi hücre-türevi veziküllerin küçük kategoriye ayrılabilir. MVs 100 1,000 kadar büyük ise hücre kökenli kese alt popülasyonlarının isimlendirme devam eden tartışmanın 8,9 bir konu olmaya devam ediyor, ancak, eksozomlar genellikle, küçük plazma zarı ile endosome füzyon elde edilen 40 ila 100 nm parçacıklar açıklanmıştır nm partiküller, plazma zarının 10 dökülme ile temsil edilmektedir. Burada, genel terim &quot;EV bize&quot; hücreleri tarafından salınan hücre dışı biyolojik veziküllerinin her türlü ifade etmek için kullanılacaktır. Bütün kandan EV&#39;lerin izolasyonu çok aşamalı bir işlemdir ve bir çok farklı işlem değişkenlerinin, depolama sıcaklığı ve süresi 11,12, antikoagülan / koruyucu 13 kullanılır ve de dahil olmak üzere, EV içeriği etkilediği gösterilmiştirsantrifüj yöntemi 14 kullanılır. Bu değişkenlerin standardizasyonu için bir ihtiyaç Tromboz ve Hemostaz Bilimsel ve uygun Standardizasyon Komitesi (ISTH SSC), kan işleme ve EV izolasyon prosedürleri 15,16 Uluslararası Derneği tarafından önerilerine yol açtı, ancak optimum protokolü araştırmacılar arasında fikir birliği hiçbir vardır etti 12 kullanmak için. En sıkı kontrollü ön-analitik değişkenler doğru ve tekrarlanabilir veriler için çok önemli olduğunu, ancak, kabul ediyorum. AGH analiz etmek için, araştırmacılar 20,21 ve 22,23 lekeleme batı saçılma transmisyon elektron mikroskobu 17, taramalı elektron mikroskobu 18,19, atomik kuvvet mikroskobu, dinamik ışık da dahil olmak üzere, çeşitli yöntemler kullanmışlardır. FCM birçok araştırmacı 9,24 için seçim yöntemi iken - nedeniyle yüksek verim yetenekleri 26, FCM kullanarak EVs analizi olmuştur32 - nedeniyle boyutu ve ayrık olumlu nüfus 27 eksikliği oldukça zordur. Hücrelerin analizi ile karşılaştırıldığında, gerekli parçacık başına antijenlerin az sayıda nedeniyle yayılan 1) daha az floresans AGH sonuçların küçük boyutu ve post-leke yıkama 2) sınırlı fizibilite, arka plan floresan azaltmak için. Araştırmacılar arasında ortak zorluklar immunglobulin agrega 27,28 ve antikorların 29 kendini toplama kaynaklanan sinyalleri içerir. Ayrıca, uzun işlem süreleri ve mevcut protokollerin 33,34 birçok kişi tarafından kullanılan uzun yıkama / izolasyon prosedürleri onlara yüksek hacimli uygulamalar için idealdir daha az hale numunelerin az sayıda analiz etmek çok günlük zaman taahhütlerini gerektirir. Bazı araştırmacılar doğru bac değerlendirmek için böyle bir floresan eksi bir (FMO) ve izotiplerle yararsız olarak geleneksel olarak kullanılan FCM negatif kontroller render, tamamen bir yıkama adımı bırakmakkground floresan 30. Antikor agrega ve diğer non-kesecikler, bağlanmamış antikor giderilmesinde zorluk ve farkedilebilir olumlu nüfus eksikliğinden kaynaklanan sinyaller: Bizim protokolleri AGH uygun FCM analizi engelleyebilir üç ortak sorunları çözmek. Burada tarif edilen teknikler, genel olarak ticari preparatlarda bulunan antikor toplulukları ortadan sinyal-gürültü oranını artırmak ve eşiğe tespitini en aza indirir rasyonel bir şekilde kapı ayarlama yardımcı olacaktır. İki farklı algılama yöntemleri burada sunulmuştur: İkinci protokol yakalamak ve küçük AGH ve eksozomlar tespit etmek için bir boncuk-tabanlı bir yaklaşım kullanır iken ilk protokol, klinik örneklerin yüksek hacimli analiz etmek için özellikle uygundur bireysel algılama yöntemi kullanır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" >
	<tbody>
		<tr >
			<td >LSR II benchtop flow cytometer</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td >3-laser (20 mW Coherent Sapphire 488 nm blue, 25 mW Coherent Vioflame 405 nm violet, and 17 mW JDS Uniphase HeNe 633nm red)</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FACS Diva software&#160;</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td ></td>
			<td >PC version 6.0</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >FlowJo software&#160;</td>
			<td >Treestar US</td>
			<td ></td>
			<td >Mac version 9.6.1 or PC version 7.6.5</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Sphero Rainbow fluorescent particles</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >556298</td>
			<td >used to adjust all channel voltages to maintain fluorescence intensity consistency&#160;</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultra Rainbow fluorescent particles&#160;</td>
			<td >Spherotech</td>
			<td >URFP-10-5</td>
			<td >used in addition to Megamix-Plus SSC beads to ensure EV gating consistency from batch to batch</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Megmix-Plus SSC beads</td>
			<td >Biocytex</td>
			<td >7803</td>
			<td >used to adjust FSC and SSC&#160; voltages to maintain&#160; consistency&#160; between runs. Can also used to monitor flow rate and ajust flow rate dial in order to ensure that same flow rate is used in all runs</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >AbC Anti-Mouse Bead Kit</td>
			<td >Life Technologies</td>
			<td >A-10344</td>
			<td >used for compensation controls &#38; negative AbC beads used for beads-based method</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Nonidet P-40 Alternative (NP-40) (CAS 9016-45-9)</td>
			<td >Santa Cruz&#160;</td>
			<td >sc-281108</td>
			<td >used in the individual detection method only to lyse samples after initial reading for use as negative controls. Stock may be diluted to 1:10 in PBS and stored in fridge for up to 1 month.</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >BD TruCOUNT Tubes</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >340334</td>
			<td >used whenver absolute EV concentrations are needed</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultrafree-MC, GV 0.22 &#181;m Centrifugal Filter Units</td>
			<td >Millipore&#160;</td>
			<td >UFC30GVNB</td>
			<td >used to post-stain wash Evs and/or fractionate EVs based on size</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Vacutainer glass whole blood tubes ACD-A</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >364606</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Facs tubes 12x75 polystrene</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >352058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >50mL Reservoirs individually wrapped&#160;</td>
			<td >Phenix</td>
			<td >RR-50-1s</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Green-Pak pipet tips - 10&#181;L</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >GP-L10S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Green-Pak pipet tips -200&#181;L&#160;</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >GP-L250S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Green -Pak pipet tips - 1000&#181;L&#160;</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >GP-L1000S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Stable Stack L300 tips presterilized</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >SS-L300S</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Pipet-Lite&#160;XLS 8 Channel LTS&#160;Adjustable&#160;Spacer&#160;</td>
			<td >Rainin</td>
			<td >LA8-300XLS</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >96 well tissue culture plates</td>
			<td >E&#38;K Scientific</td>
			<td >EK-20180</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >RPMI 1640 Media (without Hepes)</td>
			<td >UCSF Cell Culture Facility</td>
			<td >CCFAE001</td>
			<td >media used for bead-based detection method</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Dulbeccos PBS D-PBS, CaMg-free, 0.2&#181;m filtered</td>
			<td >UCSF Cell Culture Facility</td>
			<td >CCFAL003</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >Ultracentrifuge Tube, Thinwall, Ultra-Clear</td>
			<td >BECKMAN COULTER INC</td>
			<td >344058</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PANEL I</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD3 PerCP-Cy5.5</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >344808</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD14 APC-Cy7</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >301820</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD16 V450</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >560474</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD28 FITC</td>
			<td >biolegend</td>
			<td >302906</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD152 APC</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >555855</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD19 A700</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >302226</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PANEL II</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD41a PerCP-Cy5.5</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >340930</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD62L APC</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >304810</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD108 PE&#160;</td>
			<td >BD Biosciences</td>
			<td >552830</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD235a FITC</td>
			<td >biolegend</td>
			<td >349104</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >PANEL III</td>
			<td ></td>
			<td ></td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD11b PE-Cy7</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >301322</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD62p APC</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >304910</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD66b PE&#160;</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >305106</td>
			<td >2 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD15 FITC</td>
			<td >exalpha</td>
			<td >X1496M</td>
			<td >5 &#181;l</td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD9 PE</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >555372</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >CD63 APC</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >353008</td>
			<td ></td>
		</tr>
		<tr >
			<td >APC-Cy7 Ms IgG2a, &#954;</td>
			<td >Biolegend</td>
			<td >400230</td>
			<td ></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

techniques for the analysis of extracellular vesicles using flow cytometry

Hücre dışı veziküller (EVS) hücre-hücre iletişimine yüksek ilgili olan ve biyolojik süreçler çok çeşitli düzenlemeye yardımcı vücut sıvılarında bulunan küçük, zar-türevi veziküllerdir. Akış sitometrik (FCM) ile AGH analizi nedeniyle küçük boyutu ve ilgi belirteçleri için pozitif ayrık nüfus eksikliği bildiği zor olmuştur. Oldukça son on yılda geliştirilmiş EV analiz yöntemleri, hala devam eden bir çalışma vardır. Ne yazık ki, orada hiç kimse-boyut-uyan tüm protokol ve kullanmak için en uygun yöntemi belirlerken çeşitli yönleri dikkate alınmalıdır. Birkaç farklı işleme AGH için teknikler ve bireysel algılama veya boncuk-tabanlı bir yaklaşım kullanarak AGH analiz için iki protokol burada sundu. rasyonel f yaygın ticari preparatlarda bulunan antikor agregatları bertaraf yardımcı olacaktır Burada tarif edilen yöntemler, artan bir sinyal-gürültü oranı ve ayar kapılarıeşiğe tespitini en aza indirir ashion. İkinci protokol yakalamak ve küçük AGH ve eksozomlar tespit etmek için bir boncuk tabanlı bir yaklaşım kullanır iken ilk protokol, klinik örneklerin yüksek hacimli analiz etmek için özellikle uygundur bireysel algılama yöntemi kullanır.

<html> Şekil 1, izolasyon ve boncuk esaslı yöntemi veya tek tek tespit metodu kullanarak EV&#39;lerin tespiti için genel işlem şemasını açıklar. FCM büyük AGH analiz için iyi çalışır ama çoğu sitometrelerinde bireysel eksozom gibi parçacıkları kadar küçük tespit yeteneğine sahip değildir kullanarak EVs Bireysel algılama. Bir tane bazlı yaklaşım, Tablo 1 &#39;de belirtildiği gibi küçük EVs, ancak, bu yöntem kullanılarak ilişkili dezavantajları vardı...

Watch this Scientific Journal Video about Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry at JoVE.com

Techniques for the Analysis of Extracellular Vesicles Using Flow Cytometry

Pek çok farklı yöntem akış sitometrik (FCM) ile hücre dışı veziküller (EVS) ölçülmesi için vardır. Kullanmak için en uygun yöntemi belirlerken çeşitli yönleri dikkate alınmalıdır. Ölçüm EVs için iki protokoller bireysel algılama veya boncuk esaslı yaklaşım kullanılarak sunulmuştur.

Akım Sitometri Kullanımı Ekstrasellüler Veziküller Analizi Teknikleri

Extracellular Vesicles (EVs) are small, membrane-derived vesicles found in bodily fluids that are highly involved in cell-cell communication and help ...

Research

JoVE Journal

Biology

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Fare Mayotik Hücreler Sitometrisi Arıtma

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Biyoloji

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Temporal Tracking of Cell Cycle Progression Using Flow Cytometry without the Need for Synchronization

Senkronizasyon Need for olmadan Akım Sitometri Kullanımı Hücre Döngüsü ilerleme zamansal İzleme

This protocol describes a method to permit the tracking of cells through the cell cycle without requiring the cells to be synchronized. Achieving cell ...

Sample Preparation for Mass Cytometry Analysis

Kütle Sitometri Analizi için Numune Hazırlama

Mass cytometry utilizes antibodies conjugated with heavy metal labels, an approach that has greatly increased the number of parameters and opportunities ...

LED Thermo Flow &#8212; Combining Optogenetics with Flow Cytometry

LED Thermo Akışı - Akım Sitometrisi ile optogenetics birleştiren

Optogenetic tools allow isolated, functional investigations of almost any signaling molecule within complex signaling pathways. A major obstacle is the ...

Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry

Spektral Sitometrisi ile Katı Dokular İzole Hücre Cezalar Analizi

Flow cytometry has been used for the past 40 years to define and analyze the phenotype of lymphoid and other hematopoietic cells. Initially restricted to ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Hücre şartına ortamdan hücre dışı veziküller sitometrik analizinde akışı

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles

Arınma ve Caenorhabditis elegans Ekstrasellüler Veziküllerin Analizi

The secretion of small membrane-bound vesicles into the external environment is a fundamental physiological process of all cells. These extracellular ...

Nanoparticle Tracking Analysis for the Quantification and Size Determination of Extracellular Vesicles

Hücre Dışı Veziklinlerin Nicelleştirilmesi ve Boyut Tayini için Nanopartikül Takip Analizi

The physiological and pathophysiological roles of extracellular vesicles (EVs) have become increasingly recognized, making the EV field a quickly evolving ...

Single Extracellular Vesicle Transmembrane Protein Characterization by Nano-Flow Cytometry

Nano-Flow Sitometri ile Tek Hücre Dışı Vezikül Transmembran Protein Karakterizasyonu

Single particle characterization has become increasingly relevant for research into extracellular vesicles, progressing from bulk analysis techniques and ...