Name: targeted dna methylation analysis by next-generation sequencing
Uploaded: 2015-02-24T15:00:00
Duration: 8 min 38 s
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The authors thank Colleen Van Kirk for mouse retina and cerebellum samples, and Peter Gregory for figure generation. The authors also thank Dr. Allison Gillaspy and the Laboratory for Molecular Biology and Cytometry Research core for access to the MiSeq. This work was supported by NIH grants DA029405, EY021716, and AG026607 and the Donald W. Reynolds Foundation.

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The authors have nothing to disclose.

BSAS permite centrado, precisa cuantificación de metilación del ADN con capacidades de alto rendimiento, tanto en número de muestras y número de objetivos. Además, esta generación biblioteca utilizando tagmentation transposome mediada requiere menos entrada de ADN, es más rápido y contiene menos pasos que esquila tradicional y técnicas de unión adaptador posteriores. Estas mejoras sobre los métodos existentes permiten precisa de nivel de base el análisis de metilación del ADN de cualquier diana de interés. Por otra parte, BSAS proporciona un nuevo método para la confirmación de las regiones de interés (regiones de metilación diferencialmente (DMR), islas CpG, regiones reguladoras) que han sido identificados utilizando todo el genoma de bisulfito 22 o capturar 23 enfoques. Utilizando métodos de confirmación ortogonales y más cuantitativamente métodos precisos mejora el rigor analítico de estudios epigenómicos. La profundidad máxima de lectura alcanzado con BSAS permite la cuantificación precisa en un intervalo de confianza estrecho, reresultante en la cuantificación precisa 16. Además, la capacidad de ejecutar muchas muestras en un solo experimento puede aumentar el tamaño de la muestra para la confirmación de los métodos de todo el genoma, lo que aumentará el poder estadístico; una debilidad de muchos estudios epigenéticos actuales. Es importante destacar que, BSAS proporciona una cuantificación de metilación CpG específicos de base, lo que permite la generación de hipótesis comprobables para la investigación epigenética. Hipótesis como el aumento de la metilación en un elemento de respuesta específica se traducirá en disminución de la unión de un factor de transcripción específico. BSAS, combinado con los datos de expresión de ARNm emparejados, proporciona un método para obtener tanto la regulación epigenética y la expresión del ARNm dentro de una sola pieza de tejido o población de células. Mediciones pareadas de regulación y expresión también aumentan el rigor científico y el impacto de los hallazgos. Los pasos críticos dentro del protocolo BSAS incluyen primer diseño, optimización de amplificación, y la generación de biblioteca /QC. PCR sesgo se introduce si cebadores no están diseñados adecuadamente y amplifican en diferentes eficiencias 8. El uso de estándares de metilación, como 100% y 0% de citosina metilados normas enzimáticamente generadas, se puede utilizar para determinar el grado, si alguno, de sesgo cuantificación de metilación, y es un control metodológico adecuado cuando la cuantificación de metilación 16. Del mismo modo, se debe tener cuidado cuando la optimización de las reacciones de PCR para generar un único amplicón de alta calidad. Si no está presente amplicón utilizando las directrices sugeridas se detallan en el protocolo, pasos de optimización incluyen un número creciente de ciclo de PCR o la cantidad de entrada bsDNA. Si hay múltiples productos de PCR, incluyendo dímeros de cebadores, pasos de optimización incluyen la disminución de la cantidad de entrada bsDNA, la disminución de las concentraciones de entrada de cebadores PCR molares, aumento de las temperaturas de recocido, o disminuyendo el número de ciclos de PCR. Uno o una combinación de estos procedimientos de optimización da resultados suficientes para generar un único higamplicón h calidad. Alternativamente, el rediseño de cebadores es un buen enfoque para conjuntos de cebadores que no producen un solo amplicón. Para aquellas regiones donde rediseño no es adecuado o posible, degenerar conjuntos de primer incluyendo tanto pueden trabajar de citosina y timina de CpG en los sitios en los cebadores directos y adenina y guanina de de en los sitios CpG en cebadores inversos. Sin embargo, estos conjuntos de cebadores necesitan una mayor optimización para asegurar que no se está produciendo PCR sesgo, un proceso fuera del alcance de este protocolo. Bibliotecas de calidad son extremadamente importantes para el éxito. Asegúrese de que las medidas de control de calidad se llevan a cabo para determinar el tamaño, la calidad y cantidad de las bibliotecas antes de la secuenciación. Las reacciones de secuenciación son propensos a fallas con el aporte de las bibliotecas de baja calidad. Sesgo en la cuantificación de metilación puede ser mitigado por garantizar que las frecuencias de metilación están presentes tanto en avance y retroceso secuenciación lee. Además, las puntuaciones de calidad de las bases de la alineación de los sitios CpG deben ser ≥Q30 para alta confidence en la cuantificación. Mientras que otros han demostrado previamente poco o ningún sesgo en las reacciones tagmentation de ADN convertido bisulfito 19, garantizando los parámetros descritos anteriormente permite la confirmación de la baja cuantificación metilación sesgo. BSAS actualmente mide la metilación en sitios CpG, sin embargo, las futuras ampliaciones de este método permitirá que las mediciones pareadas de CpG 5-HMC con la adición de etapas experimentales distinguiendo entre 5-mC y 5-HMC como la introducción de perrutenato de potasio antes de la conversión de bisulfito 24. Esto aumentará el impacto de utilidad BSAS permitiendo para la metilación emparejado, tanto los datos de expresión 5-mC y 5-HMC, y con el fin de determinar la expresión de genes funciones de regulación de la metilación del ADN. Preparación biblioteca mediada por transposome de amplicones de PCR da lugar a la disminución de la profundidad de secuenciación en los extremos de las regiones amplificadas. Por lo tanto, las regiones de alto interés deben ser diseñados para residir en el medio de amplicones. Cómonunca, porque BSAS genera secuenciación leer profundidades de&gt; 1000 X, la precisión cuantitativa de 5-mC mediciones cerca de los extremos de las regiones amplificadas sigue siendo alta.

Ha pasado más de medio siglo desde el primer informe de origen natural modificaciones del ADN en forma de citosina metilación 1. Metilación de citosina es una base de nucleótido citosina modificada donde el 5º de carbono en el anillo de base tiene un grupo metilo (5-mC), que se producen con más frecuencia en el motivo dinucleótido CpG en genomas de mamíferos. La presencia funcional de 5-mC en los promotores de genes se asocia generalmente con la represión transcripcional, mientras que la ausencia se asocia con la actividad transcripcional 2. Grandes avances se han hecho en nuestra comprensión del papel de la metilación del ADN en desarrollo 3, propagación TransGeneration de perfiles epigenéticos 4, la patogénesis del cáncer de 5,6, y una serie de otras áreas de investigación. Muchos de estos avances han llegado en los últimos años a medida que se han desarrollado nuevas metodologías para perfilar la metilación del ADN 7. Con el advenimiento ypopularización de secuenciación (NGS) técnicas de última generación en la actualidad hay una serie de métodos para perfilar la metilación del ADN a través de todo un genoma o grandes regiones de un genoma 8. Estos enfoques abren la posibilidad de realizar estudios de descubrimiento que cuantifican los patrones y las diferencias en la metilación del ADN de metilación del ADN. Además de estos métodos de generación de hipótesis, hay una necesidad significativa de ADN pruebas de métodos de cuantificación de metilación específica / hipótesis. Pirosecuenciación, PCR específica de metilación y la secuenciación directa de ADN Sanger convertida bisulfito han sido los métodos más utilizados para el análisis de regiones específicas (es decir, una región promotora de un gen o de una isla CpG) 9-12. Todos estos métodos se basan en la conversión de bisulfito, una reacción química donde la desaminación de la citosina no metilada se convierten en uracilo de, mientras que la citosina metilados permanecen intactos 13,14. Amplificación por PCR de bisulfite-Los resultados de ADN convertidos en sustitución de de uracilo con timina 15 que permiten la metilación diferencial a leer como una diferencia de base. Aunque muy útil, las limitaciones a estos métodos incluyen baja precisión cuantitativa, la longitud de lectura corta, y bajo rendimiento de la muestra. Para hacer frente a estas limitaciones, hemos desarrollado un método que hemos llamado bisulfito Amplicon Secuenciación (BSAS) 16. El objetivo de este método es ser capaz de analizar diana regiones genómicas de interés en un gran número de muestras con alta precisión cuantitativa. BSAS utiliza elementos de los métodos existentes (la conversión de bisulfito y la amplificación por PCR específica de la región) y los combina con una construcción simple de próxima generación biblioteca (transposome mediada) 17 y de sobremesa NGS 18 (Figura 1). Este enfoque proporciona un método rendimiento más cuantitativa y superior para examinar la metilación de citosina en cualquier región de interés. Aquí presentamos elmétodo en detalle y describir enfoques para la resolución de problemas y la calidad de comprobar el proceso BSAS.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="840">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:304px;">Name</td>
			<td style="width:255px;">Company</td>
			<td style="width:97px;">Cat #</td>
			<td style="width:185px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent 2100 Bioanlyzer</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>G29393AA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent RNA 6000 Nano kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-1511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agilent High Sensitivity DNA kit</td>
			<td>Agilent</td>
			<td>5067-4626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Typhoon 9200</td>
			<td>Amersham/GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agencourt AMPure XP - PCR Purification</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63880</td>
			<td>5 mL</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">PowerPac Basic Power Supply</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>164-5050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">twin.tech PCR plate 96&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>951020362</td>
			<td>semi-skirted</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heatsealing Film</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030127838</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heatsealing Foil</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030127854</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Heat Sealer</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5390000.024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.1-10ul Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030073.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2-200ul Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030073.045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">50-1000ul Tips</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030073.100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MixMate&#160;</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5353000.014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 mL Microcentrifuge Tubes</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>0030121.023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge 5424</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5424000.010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">2.0 mL Microcentrifuge Tube</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>022363352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera XT DNA Sample Preparation Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1024</td>
			<td>24 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nextera XT Index Kit</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>FC-131-1001</td>
			<td>24 indexes</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MiSeq Desktop Sequencer</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">MiSeq Reagent Kit v2</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>MS-102-2002</td>
			<td>300cycle</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit</td>
			<td>KAPA Biosystems</td>
			<td>KK4824</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>P7589</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>R11490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ProFlex 96-well PCR system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4484075</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Novex 6% TBE DNA gel</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EC6261BOX</td>
			<td>10-well</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Novex TBE Running Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC6675</td>
			<td>5X (1 L)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Novex Hi-Density TBE Sample Buffer</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>LC6678</td>
			<td>5X (10 mL)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 Kb Plus DNA Ladder</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10787-018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Xcell SureLock Mini-Cell</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EI0001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">UltraPure 10mg/mL Ethidium Bromide</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15585-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">7900HT Fast Real-Time PCR system</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4329001</td>
			<td>384well block</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DynaMag-96 Side Skirted</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader</td>
			<td>Molecular Devices/VWR</td>
			<td>89429-532</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>80204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Stainless Steel Beads</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>69989</td>
			<td>5 mm</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">CLC Genomics Workbench</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td></td>
			<td>Software for methylation pipeline</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">QIAQuick PCR Purification kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28104</td>
			<td>50 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TissueLyser II</td>
			<td>Retsch/Qiagen</td>
			<td>85300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Nuclease-Free Water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>W4502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">TRIS hydrochloride</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>PHG0002-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween-20</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9416-50ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">NanoDrop 2000</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">384-well Full-Skirted Plate, Standard</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-1384</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Absolute qPCR Seal</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>AB-1170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EZ DNA Methylation-Lightning kit</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>D5030</td>
			<td>50 rxn</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">ZymoTaq DNA Polymerase</td>
			<td>Zymo Research</td>
			<td>E2001</td>
			<td>50 rxn</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

targeted dna methylation analysis by next-generation sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

BSAS lee correctamente alineado con la secuencia de referencia convertida se parecerá a la Figura 5. Dinucleótidos CpG pueden ser claramente identificados y estados de metilación pueden estimarse mediante la observación de base de las llamadas en los sitios CpG en lee el mapeado. Por ejemplo, con controles de metilación, 0% de metilación se traducirá en todo el lecturas asignan a sitios que contienen CpG de T (Figura 5A). 100% de los controles de metilación se traducirá en todo el mapeado lee lee a los sitios que contienen CpG de C (Figura 5B). La cuantificación de la frecuencia de la citosina (C T / C +) en los sitios CpG se obtiene la frecuencia de metilación en la muestra original. Una curva estándar generada representante de los controles de metilación de todo el genoma (n = 3 de relación / metilación) muestra la linealidad de la cuantificación de metilación, así como precisión en la cuantificación en cada relación de metilación (Figura 6). Como un ejemplo de este método en total, ARN y ADN fueron co-iso<html> lada de cerebelo de ratón y la retina (n = 4 / grupo). Expresión rodopsina, expresado selectivamente en tejido de la retina, se midió utilizando qPCR. Expresión sólo se detectó en la retina (Figura 7A). Usando BSAS, los niveles de metilación de CpG se cuantificaron en la región promotora de la rodopsina. Los niveles de metilación acumulados a través de la región del promotor fueron&gt; 80% en el cerebelo en comparación con &lt;15% en la retina (p &lt;0,001, t-test paramétrico) (Figura 7B). BsAs beneficios de cuantificación de metilación metilación cuantificación específica de sitio, y los niveles de metilación se pueden comparar de forma específica de CpG a través de cualquier región genómica dado. Niveles de metilación CpG en todo el promotor rodopsina fueron significativamente mayores en las muestras del cerebelo cuando se compara con muestras de retina (p &lt;0,001, paramétrica t-test en cada sitio CpG) (Figura 7C). 1highres.jpg &quot;/&gt; Figura 1:. Esquemática del método de BSAS En este método, el ADN genómico es bisulfito convertida para modificar las citosinas no metilación a uracilos. Posteriormente, durante la PCR estos uracilos se cambian a timinas. La amplificación por PCR se dirige contra las regiones de interés y altamente enriquece por sólo estas secuencias. Los amplicones de PCR resultantes se convierten en bibliotecas de doble indexado a través de un proceso de tagmentation simple. Posteriormente, las bibliotecas están secuenciados en un secuenciador de última generación de sobremesa y la secuenciación lee se asignan a la secuencia de referencia in silico convertido y ciento metilación de la citosina de se determina de forma-base específica. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig2highres.jpg" /> Figura 2:. En silico conversión de bisulfito de región de interés Cualquier región de interés de toda referencia genómica puede ser selected para in silico bisulfito de conversión. Citosinas no CpG se sustituyen con la timina de la secuencia de referencia. Citosinas CpG permanecen citosinas en el bisulfito convierten referencia. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig3highres.jpg" /> Figura 3:. Cebadores colocación Primer bisulfito de PCR se diseñan contra un bisulfito en silico secuencia de referencia convertidos. Los cebadores deben ser diseñados de manera que no se superpongan dinucleótidos CG, o diseñado junto a dinucleótidos CG. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig4highres.jpg" /> Figura 4: Ejemplos de amplicones altas y pobres de PCR calidad y bibliotecas de secuenciación rastros electropherogram representativos y gel espectáculo (A) amplicón ideal para la generación de bibliotecas transposome mediada con un solo alto.producto de concentración. (B) Biblioteca generada a partir de este amplicón muestra una alta concentración y una distribución uniforme de tamaño. (C) Mala amplicones de PCR de calidad puede ser baja en tamaño, concentración y contiene múltiples productos y / o dímeros de cebadores. Estos amplicones de mala calidad dará lugar a (D) no generación biblioteca con baja concentración y distribución de baja capacidad. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig5highres.jpg" /> Figura 5: Ejemplos de salidas de secuenciación de los controles de metilación. (A) En silico convierte secuenciación de referencia con sitios CpG resaltado en rojo. 0% de control de la metilación del mapeado lee a los timinas seleccionados región mostrando (iluminaciones codicia) de mapeo en sitios CpG. De control (B) 100% metilación asignada lee mostrar (punto culminante azul) mapeo de citosina en los sitios CpG. Figura 6:. Cuantificación de metilación a través de una gama de controles de metilación controles de metilación de todo el genoma mezclados en proporciones de metilación (n = 3 / ratio) de 0% a 100% se cuantificaron utilizando BSAS. Trazado de cuantificación de espera frente cuantificada demuestra la linealidad de la cuantificación de control de la metilación. En todos los controles, hubo una alta precisión en la cuantificación de metilación. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig7highres.jpg" /> Figura 7: Ejemplo de la metilación del ADN y la expresión génica análisis pareado de muestras de tejido. (A) La rodopsina relativa expresión de mRNA de cerebelosa ratón y tejido de la retina. (B) La rodopsina promedio metilación promotor cuantificado por BSAS entre cerebelo y el ADN de la retina (*** p &lt;0,001, paramétrica t-test). &lt;strong&gt; los niveles de metilación C) sitio-específica CpG través promotor rodopsina (-244 a 6, en relación al sitio de inicio de transcripción [SST]) en el cerebelo del ratón y ADN retina.

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Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

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