Name: assessing bacterial invasion of cardiac cells in culture and heart colonization in infected mice using listeria monocytogenes
Uploaded: 2015-05-27T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes at JoVE.com

Este trabalho foi apoiado pelas bolsas do Serviço Público de Saúde AI41816 e AI099339 (N.E.F.) e pela F31AI094886-01 (P.D.M.) da NIAID. Os conteúdos são de responsabilidade exclusiva de seus autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais das fontes de financiamento.

1. Condições de armazenamento e cultura para cepas de l. monocytogenes 
<ol><li>Prepare a mídia sólida autoclavando o ágar de infusão cérebro-coração (BHI) e despejando a mídia derretida em placas de petri. Deixe as placas secarem durante a noite à temperatura ambiente, depois durante a noite novamente a 37 °C.</li>
	<li>Usando um laço estéril, obtenha uma pequena amostra de L. monocytogenes de estoques congeladores previamente feitos (bactérias suspensas em 20% de glicerol em mídia l?...

<ol>
	<li>Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+hot+dogs+to+host+cells:+how+the+bacterial+pathogen+Listeria+monocytogenes+regulates+virulence+gene+expression.">From hot dogs to host cells: how the bacterial pathogen Listeria monocytogenes regulates virulence gene expression.</a> Future Microbiol. 1, 89-101 (2006).</li><li>Drevets, D. A., Bronze, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes:+epidemiology,+human+disease,+and+mechanisms+of+brain+invasion.">Listeria monocytogenes: epidemiology, human disease, and mechanisms of brain invasion.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 53, 151-165 (2008).</li><li>Farber, J. M., Peterkin, P. 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N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=InlA+promotes+dissemination+of+Listeria+monocytogenes+to+the+mesenteric+lymph+nodes+during+food+borne+infection+of+mice.">InlA promotes dissemination of Listeria monocytogenes to the mesenteric lymph nodes during food borne infection of mice.</a> PLoS Pathog. 8, e1003015 (2012).</li><li>Melton-Witt, J. A., Rafelski, S. M., Portnoy, D. A., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+infection+with+signature-tagged+Listeria+monocytogenes+reveals+organ-specific+growth+and+dissemination+routes+in+guinea+pigs.">Oral infection with signature-tagged Listeria monocytogenes reveals organ-specific growth and dissemination routes in guinea pigs.</a> Infect Immun. 80, 720-732 (2012).</li><li>Alonzo, F., Bobo, L. D., Skiest, D. J., Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+subpopulations+of+Listeria+monocytogenes+with+enhanced+invasion+of+cardiac+cells.">Evidence for subpopulations of Listeria monocytogenes with enhanced invasion of cardiac cells.</a> J Med Microbiol. , (2011).</li><li>Adler, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+pseudotumor+of+the+heart+caused+by+Listeria+monocytogenes+infection.">Inflammatory pseudotumor of the heart caused by Listeria monocytogenes infection.</a> J Infect. 58, 161-163 (2009).</li><li>Antolin, J., Gutierrez, A., Segoviano, R., Lopez, R., Ciguenza, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocarditis+due+to+Listeria:+description+of+two+cases+and+review+of+the+literature.">Endocarditis due to Listeria: description of two cases and review of the literature.</a> Eur J Intern Med. 19, 295-296 (2008).</li><li>Brouqui, P., Raoult, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocarditis+due+to+rare+and+fastidious+bacteria.">Endocarditis due to rare and fastidious bacteria.</a> Clin Microbiol Rev. 14, 177-207 (2001).</li><li>Brusch, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+infections+in+the+immunosuppressed+patient.">Cardiac infections in the immunosuppressed patient.</a> Infect Dis Clin North Am. 15, 613-638 (2001).</li><li>McCue, M. J., Moore, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocarditis+with+microabscess+formation+caused+by+Listeria+monocytogenes+associated+with+myocardial+infarct.">Myocarditis with microabscess formation caused by Listeria monocytogenes associated with myocardial infarct.</a> Hum Pathol. 10, 469-472 (1979).</li><li>Menard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+L-type+calcium+channel+expression+during+retinoic+acid-induced+differentiation+of+H9C2+cardiac+cells.">Modulation of L-type calcium channel expression during retinoic acid-induced differentiation of H9C2 cardiac cells.</a> J Biol Chem. 274, 29063-29070 (1999).</li><li>Czuprynski, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes:+silage,+sandwiches+and+science.">Listeria monocytogenes: silage, sandwiches and science.</a> Anim Health Res Rev. 6, 211-217 (2005).</li><li>Grundler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surface+proteins+InlA+and+InlB+are+interdependently+required+for+polar+basolateral+invasion+by+Listeria+monocytogenes+in+a+human+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier.">The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).</li><li>Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+extravillous+trophoblasts+restrict+intracellular+growth+and+spread+of+Listeria+monocytogenes.">Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes.</a> PLoS Pathog. 7, e1002005 (2011).</li><li>Kimes, B. W., Brandt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+a+clonal+muscle+cell+line+from+rat+heart.">Properties of a clonal muscle cell line from rat heart.</a> Experimental cell research. 98, 367-381 (1976).</li><li>McMullen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+Listeria+monocytogenes+07PF0776,+a+cardiotropic+serovar+4b+strain.">Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain.</a> J Bacteriol. 194, 3552 (2012).</li></ol>

L. monocytogenes é um patógeno humano generalizado e bem caracterizado, capaz de causar uma série de manifestações diferentes da doença15. A bactéria foi descrita anteriormente por sua capacidade de translocar através de barreiras, como a barreira hematoencefálica e as barreiras placentárias-fetais, a fim de alcançar e colonizar o sistema nervoso central e desenvolver feto, respectivamente. A capacidade in vivo do organismo de colonizar esses tecidos é muitas vezes complementada p...

Listeria monocytogenes é um patógeno intracelular gram-positivo capaz de causar doenças graves em populações suscetíveis, incluindo idosos, gestantes, pessoas com HIV/AIDS e pessoas que recebem quimioterapia1. A infecção nessas populações é frequentemente resultado da ingestão de produtos alimentares contaminados, e a maioria das infecções estão associadas a surtos de alimentos em larga escala2,3. Em humanos e outros mamíferos, L. monocytogenes é capaz de translocar através da fronteira epitelial do intestino delgado, sendo posteriormente transportado para o fígado4,5. Modelos animais sugerem que as bactérias ingeridas se replicam dentro do villi intestinal e transitam para o fígado através da veia portal ou se espalham através dos linfonodos mesentéricos na corrente sanguínea, levando à disseminação hematógena no fígado e ao baço6,7. No fígado e no baço, a bactéria é capaz de mediar a absorção tanto em fagocitos profissionais quanto em células parenchímicas residentes, e rapidamente estabelece infecções dentro desses órgãos. À medida que a carga bacteriana aumenta, inúmeras bactérias são dispersas de volta ao sangue, onde são capazes de colonizar ainda mais tecidos suscetíveis, incluindo o sistema nervoso central e a placenta (onde estão presentes). A colonização desses locais impede manifestações mais comuns de listeriose em humanos, incluindo meningite, encefalite e aborto fetal2.
Subpopulações selecionadas de L. monocytogenes têm sido recentemente mostrados com uma capacidade aprimorada de invadir e replicar dentro do tecido cardíaco8. As manifestações de envolvimento cardíaco são variadas, e vão desde endocardite e pericárite, até miocardite fulminante completa com anormalidades de condução9-13. O número total de casos cardíacos de L. monocytogenes por ano é baixo, mas pode ser subestimado, pois essa faceta de infecção não é geralmente bem reconhecida. A colonização do coração por patógenos muitas vezes requer predisposições hospedeiras, como danos valvulares pré-existentes ou válvulas cardíacas artificiais. Há, no entanto, isolados de L. monocytogenes que foram identificados que são notáveis por sua capacidade de colonizar os corações dos animais infectados na ausência de qualquer dano cardíaco e/ou anormalidades8.
Aqui são descritos métodos in vitro e in vivo para avaliar a colonização bacteriana do tecido cardíaco dentro de animais infectados usando ensaios de invasão na cultura tecidual, bem como infecções animais vivos. Esses métodos têm se mostrado úteis não apenas para identificar cepas com potencial para colonizar tecido cardíaco em animais infectados, mas também devem ser úteis para a identificação de produtos genéticos bacterianos que servem para melhorar a invasão celular cardíaca e/ou resultar em alterações na patologia cardíaca. Esses métodos facilitam a comparação do cardiotropismo entre múltiplas cepas. Para os métodos aqui descritos, l. monocytogenes 10403S é usado como um representante bem estudado de uma cepa não cardiotrópica e o isolado clínico 07PF0776 é usado como um exemplo representativo de uma cepa cardiotrópica. Essas duas cepas foram escolhidas para fornecer uma comparação para a invasão bacteriana de células cardíacas in vitro e colonização de corações de camundongos infectados in vivo. O isolado 07PF0776 é um isolado clínico recuperado de um abscesso interventricular que causou uma arritmia fatal em um paciente HIV+8. L. os isolados de monocytogenes podem variar em seu potencial de virulência, e dada a propensão para listeria infectar pessoas com imunossupressão e gestantes, as pessoas dentro dessas populações devem ter cuidado ao avaliar diferentes isolados clínicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Difco</td>
			<td>BHI Broth Base</td>
			<td>237200</td>
			<td>2KG of Brain Heart Infusion powder (without agar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco</td>
			<td>Agar</td>
			<td>214510</td>
			<td>2KG of Granulated Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco</td>
			<td>BHI Agar</td>
			<td>241810</td>
			<td>2KG of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in vitrogen</td>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>12975-084</td>
			<td>2KG of Luria Broth Base Powder (without agar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher</td>
			<td>Glass Coverslips</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td>12mm glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon</td>
			<td>24-well Tissue Culture Plate</td>
			<td>35-3047</td>
			<td>24 Well, Plasma-treated Tissue Culture Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon</td>
			<td>14mL Polystyrene tube</td>
			<td>352051</td>
			<td>14mL Polystyrene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon</td>
			<td>96-well U-bottom plate</td>
			<td>35-3077</td>
			<td>Non-tissue culture treated 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning</td>
			<td>0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X)</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td>Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning</td>
			<td>DMEM (High glucose, high pyruvate)</td>
			<td>15-013-CU</td>
			<td>DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning</td>
			<td>Pen/Strep/Glut Solution</td>
			<td>30-009-CI</td>
			<td>Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning</td>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>30-005-CR</td>
			<td>50mg/mL Stock solution of Gentamicin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellgro (Corning)</td>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>25005197</td>
			<td>Stock L-glutamine solution without antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denville</td>
			<td>75cm^2 Flask</td>
			<td>T1225</td>
			<td>75cm^2 tissue culture treated flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denville</td>
			<td>1.5mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>2013004</td>
			<td>1.5mL microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATCC</td>
			<td>H9c2 Cardiac Myoblasts</td>
			<td>CRL-1446</td>
			<td>Rat cardiac myoblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>SH30070.63</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing bacterial invasion of cardiac cells in culture and heart colonization in infected mice using listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes é um patógeno intracelular facultativo gram-positivo que é capaz de causar infecções invasivas graves em pacientes imunocomprometidos, idosos e gestantes. As manifestações mais comuns de listeriose em humanos incluem meningite, encefalite e aborto fetal. Uma sequência significativa, mas muito menos documentada de infecção invasiva de L. monocytogenes envolve o coração. A taxa de mortalidade por doença cardíaca pode ser de até 35% apesar do tratamento, porém muito pouco se sabe sobre a colonização de L. monocytogenes de tecido cardíaco e suas patologias resultantes. Além disso, tornou-se recentemente evidente que as subpopulações de L. monocytogenes têm uma capacidade aumentada de invadir e crescer dentro do tecido cardíaco. Este protocolo descreve em detalhes métodos in vitro e in vivo que podem ser usados para avaliar o cardiotropismo de L. monocytogenes isolados. Métodos são apresentados para a infecção de míbios cardíacos de rato H9c2 na cultura tecidual, bem como para a determinação da colonização bacteriana dos corações dos camundongos infectados. Esses métodos são úteis não apenas para identificar cepas com potencial para colonizar tecido cardíaco em animais infectados, mas também podem facilitar a identificação de produtos genéticos bacterianos que servem para melhorar a invasão de células cardíacas e/ou promover alterações na patologia cardíaca. Esses métodos também preveem a comparação direta do cardiotropismo entre múltiplas cepas de L. monocytogenes.

Isolados selecionados de L. monocytogenes exibem maior invasão de células cardíacas na cultura celular e em modelos de infecção de camundongos. A Figura 1 mostra um exemplo de como as colônias bacterianas podem aparecer após o revestimento de suspensões na mídia ágar. Este método permite uma avaliação precisa das CFUs dentro de uma amostra sem o uso de um grande número de placas de mídia ágar. A Figura 2 mostra um exemplo de um ensaio baseado em cultura tecidual ...

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Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causa infecções fetais em gestantes e meningite em populações suscetíveis. Subpopulações de bactérias podem colonizar tecido cardíaco, causando miocardite em pacientes e animais de laboratório. Aqui apresentamos um protocolo que descreve como avaliar a invasão de células cardíacas L. monocytogenes in vitro e colonização cardíaca em animais infectados.

Avaliação da invasão bacteriana de células cardíacas na cultura e colonização cardíaca em camundongos infectados usando listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular pathogen that is capable of causing serious invasive infections in immunocompromised ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Usando a luciferase Infecções bacterianas Imagem em camundongos

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Transmissão Oral de<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Em camundongos através de ingestão de alimentos contaminados

L. monocytogenes are facultative intracellular bacterial pathogens that cause food borne infections in humans. Very little is known about the ...

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

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Entérico invasão bacteriana de células epiteliais intestinais<em&gt; In Vitro</em&gt; É dramaticamente aumentada usando um Vertical Modelo câmara de difusão

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

Imaging InlC Secretion to Investigate Cellular Infection by the Bacterial Pathogen Listeria monocytogenes

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Imagiologia inLC Secreção para investigar infecção celular pelo patógeno bacteriano<em&gt; Listeria monocytogenes</em

Bacterial intracellular  pathogens can be conceived as molecular tools to dissect cellular signaling  cascades due to their capacity to exquisitely ...

Assessing the Innate Sensing of HIV-1 Infected CD4+ T Cells by Plasmacytoid Dendritic Cells Using an Ex vivo Co-culture System.

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Avaliando a inata Sensing de HIV-1 CD4 Infected<sup&gt; +</sup&gt; As células T por células dendríticas plasmocitóides Usando um<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura do sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

RNA Purification from Intracellularly Grown Listeria monocytogenes in Macrophage Cells

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A purificação a partir de ARN intracelularmente Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Em macrófagos

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-&#947; Responses

Experimental Infection with Listeria monocytogenes as a Model for Studying Host Interferon-ÃƒÆ’Ã…Â½Ãƒâ€šÃ‚Â³ Responses

Infecção experimental com<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como um modelo para estudar o anfitrião Respostas interferão-y

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...