Name: assessing bacterial invasion of cardiac cells in culture and heart colonization in infected mice using listeria monocytogenes
Uploaded: 2015-05-27T14:00:00
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Este trabajo fue apoyado por las subvenciones del Servicio de Salud Pública AI41816 y AI099339 (N.E.F.) y por F31AI094886-01 (P.D.M.) del NIAID. Los contenidos son responsabilidad exclusiva de los autores y no representan necesariamente los puntos de vista oficiales de las fuentes de financiación.

1. Condiciones de almacenamiento y cultivo para cepas de L. monocytogenes 
<ol><li>Prepare medios sólidos autoclavando agar de infusión cerebro-corazón (BHI) y vertiendo los medios fundidos en placas de Petri. Deje que las placas se sequen durante la noche a temperatura ambiente, luego vuelva a pasar la noche a 37 °C.</li>
	<li>Usando un lazo estéril, obtenga una pequeña muestra de L. monocytogenes de cualquiera de las existencias previamente hechas del congelador (bacterias suspendidas en glice...

<ol>
	<li>Freitag, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+hot+dogs+to+host+cells:+how+the+bacterial+pathogen+Listeria+monocytogenes+regulates+virulence+gene+expression.">From hot dogs to host cells: how the bacterial pathogen Listeria monocytogenes regulates virulence gene expression.</a> Future Microbiol. 1, 89-101 (2006).</li><li>Drevets, D. A., Bronze, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes:+epidemiology,+human+disease,+and+mechanisms+of+brain+invasion.">Listeria monocytogenes: epidemiology, human disease, and mechanisms of brain invasion.</a> FEMS Immunol Med Microbiol. 53, 151-165 (2008).</li><li>Farber, J. M., Peterkin, P. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+infections+in+the+immunosuppressed+patient.">Cardiac infections in the immunosuppressed patient.</a> Infect Dis Clin North Am. 15, 613-638 (2001).</li><li>McCue, M. J., Moore, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myocarditis+with+microabscess+formation+caused+by+Listeria+monocytogenes+associated+with+myocardial+infarct.">Myocarditis with microabscess formation caused by Listeria monocytogenes associated with myocardial infarct.</a> Hum Pathol. 10, 469-472 (1979).</li><li>Menard, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+L-type+calcium+channel+expression+during+retinoic+acid-induced+differentiation+of+H9C2+cardiac+cells.">Modulation of L-type calcium channel expression during retinoic acid-induced differentiation of H9C2 cardiac cells.</a> J Biol Chem. 274, 29063-29070 (1999).</li><li>Czuprynski, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Listeria+monocytogenes:+silage,+sandwiches+and+science.">Listeria monocytogenes: silage, sandwiches and science.</a> Anim Health Res Rev. 6, 211-217 (2005).</li><li>Grundler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+surface+proteins+InlA+and+InlB+are+interdependently+required+for+polar+basolateral+invasion+by+Listeria+monocytogenes+in+a+human+model+of+the+blood-cerebrospinal+fluid+barrier.">The surface proteins InlA and InlB are interdependently required for polar basolateral invasion by Listeria monocytogenes in a human model of the blood-cerebrospinal fluid barrier.</a> Microbes Infect. 15, 291-301 (2013).</li><li>Zeldovich, V. B., Robbins, J. R., Kapidzic, M., Lauer, P., Bakardjiev, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Invasive+extravillous+trophoblasts+restrict+intracellular+growth+and+spread+of+Listeria+monocytogenes.">Invasive extravillous trophoblasts restrict intracellular growth and spread of Listeria monocytogenes.</a> PLoS Pathog. 7, e1002005 (2011).</li><li>Kimes, B. W., Brandt, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+a+clonal+muscle+cell+line+from+rat+heart.">Properties of a clonal muscle cell line from rat heart.</a> Experimental cell research. 98, 367-381 (1976).</li><li>McMullen, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+sequence+of+Listeria+monocytogenes+07PF0776,+a+cardiotropic+serovar+4b+strain.">Genome sequence of Listeria monocytogenes 07PF0776, a cardiotropic serovar 4b strain.</a> J Bacteriol. 194, 3552 (2012).</li></ol>

L. monocytogenes es un patógeno humano extendido y bien caracterizado, capaz de causar una serie de manifestaciones diferentes de la enfermedad15. La bacteria se ha descrito previamente por su capacidad de translocar a través de barreras, como la barrera hematoencefálica y las barreras placentario-fetales, con el fin de alcanzar y colonizar el sistema nervioso central y el feto en desarrollo, respectivamente. La capacidad in vivo del organismo para colonizar estos tejidos a menudo se compl...

Listeria monocytogenes es un patógeno intracelular Gram-positivo capaz de causar enfermedades graves en poblaciones susceptibles, incluyendo ancianos, mujeres embarazadas, personas con VIH/SIDA y personas que reciben quimioterapia1. La infección en estas poblaciones es frecuentemente el resultado de la ingestión de productos alimenticios contaminados, y la mayoría de las infecciones están asociadas con brotes alimentarios a gran escala2,3. En humanos y otros mamíferos, L. monocytogenes es capaz de translocar a través de la frontera epitelial del intestino delgado, siendo posteriormente transportado al hígado4,5. Los modelos animales sugieren que las bacterias ingeridas se repliquen dentro de las vellosidades intestinales y transiten al hígado a través de la vena porta o se propaguen a través de los ganglios linfáticos mesentéricos hacia el torrente sanguíneo, lo que lleva a la diseminación hematógena al hígado y al bazo6,7. En el hígado y el bazo, la bacteria es capaz de mediar en fagocitos profesionales, así como en las células parenquimatosas residentes, y establece rápidamente infecciones dentro de estos órganos. A medida que aumenta la carga bacteriana, numerosas bacterias se dispersan de nuevo en la sangre, donde son capaces de colonizar aún más los tejidos susceptibles, incluyendo el sistema nervioso central y la placenta (donde esté presente). La colonización de estos sitios excluye las manifestaciones más comunes de listeriosis en humanos, incluyendo meningitis, encefalitis y aborto fetal2.
Recientemente se ha demostrado que determinadas subpoblaciones de L. monocytogenes tienen una mayor capacidad de invadir y replicarse dentro del tejido cardíaco8. Las manifestaciones de afectación cardíaca son variadas, y van desde la endocarditis y la pericarditis, hasta la miocarditis fulminante completa con anomalías de conducción9-13. El número total de casos cardiacos de los monocytogenes del L. por año es bajo pero puede debajo estimado pues esta faceta de la infección no se reconoce generalmente bien. La colonización del corazón por patógenos a menudo requiere predisposiciones del huésped, como daño valvular preexistente o válvulas cardíacas artificiales. Existen, sin embargo, aislados de L. monocytogenes que han sido identificados que son notables por su capacidad de colonizar los corazones de animales infectados en ausencia de cualquier daño cardíaco y/o anormalidades8.
Adjunto se describen in vitro e in vivo los métodos para evaluar la colonización bacteriana del tejido cardiaco dentro de animales infectados usando análisis de la invasión en cultura del tejido así como infecciones animales vivas. Estos métodos han demostrado ser útiles no sólo para identificar cepas con el potencial de colonizar el tejido cardíaco en animales infectados, sino que también deben ser útiles para la identificación de productos de genes bacterianos que sirven para mejorar la invasión de células cardíacas y / o dar lugar a cambios en la patología del corazón. Estos métodos facilitan la comparación del cardiotropismo entre múltiples cepas. Para los métodos descritos aquí, L. monocytogenes 10403S se utiliza como un representante bien estudiado de una cepa no cardiotrópica y el aislado clínico 07PF0776 se utiliza como un ejemplo representativo de una cepa cardiotrópica. Estas dos cepas se eligieron para proporcionar una comparación para la invasión bacteriana de células cardíacas in vitro y la colonización de corazones de ratones infectados in vivo. El aislado 07PF0776 es un aislado clínico recuperado de un absceso interventricular que causó una arritmia fatal en un paciente VIH+8. Los aislados de L. monocytogenes pueden variar en su potencial de virulencia, y dada la propensión de Listeria a infectar a personas con inmunosupresión y mujeres embarazadas, las personas dentro de estas poblaciones deben tener cuidado al evaluar diferentes aislados clínicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Difco</td>
			<td>BHI Broth Base</td>
			<td>237200</td>
			<td>2KG of Brain Heart Infusion powder (without agar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco</td>
			<td>Agar</td>
			<td>214510</td>
			<td>2KG of Granulated Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Difco</td>
			<td>BHI Agar</td>
			<td>241810</td>
			<td>2KG of Brain Heart Infusion Powder with 7.5% Agar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in vitrogen</td>
			<td>LB Broth Base</td>
			<td>12975-084</td>
			<td>2KG of Luria Broth Base Powder (without agar)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher</td>
			<td>Glass Coverslips</td>
			<td>12-545-80</td>
			<td>12mm glass coverslips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon</td>
			<td>24-well Tissue Culture Plate</td>
			<td>35-3047</td>
			<td>24 Well, Plasma-treated Tissue Culture Plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon</td>
			<td>14mL Polystyrene tube</td>
			<td>352051</td>
			<td>14mL Polystyrene tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon</td>
			<td>96-well U-bottom plate</td>
			<td>35-3077</td>
			<td>Non-tissue culture treated 96-well plate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning</td>
			<td>0.05% Trypsin, 0.53 mM EDTA (1X)</td>
			<td>25-052-CI</td>
			<td>Stock solution of Trypsin EDTA for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning</td>
			<td>DMEM (High glucose, high pyruvate)</td>
			<td>15-013-CU</td>
			<td>DMEM media without FBS, glutamine, or antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning</td>
			<td>Pen/Strep/Glut Solution</td>
			<td>30-009-CI</td>
			<td>Stock mixture of penicillin, streptomycin, and L-glutamine for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Corning</td>
			<td>Gentamicin</td>
			<td>30-005-CR</td>
			<td>50mg/mL Stock solution of Gentamicin for tissue culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellgro (Corning)</td>
			<td>L-Glutamine</td>
			<td>25005197</td>
			<td>Stock L-glutamine solution without antibiotics</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denville</td>
			<td>75cm^2 Flask</td>
			<td>T1225</td>
			<td>75cm^2 tissue culture treated flask</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Denville</td>
			<td>1.5mL microcentrifuge tubes</td>
			<td>2013004</td>
			<td>1.5mL microcentrifuge tubes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ATCC</td>
			<td>H9c2 Cardiac Myoblasts</td>
			<td>CRL-1446</td>
			<td>Rat cardiac myoblasts</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hyclone</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>SH30070.63</td>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing bacterial invasion of cardiac cells in culture and heart colonization in infected mice using listeria monocytogenes

Los monocytogenes de la listeriería son un patógeno intracelular facultativo Gram-positivo que es capaz de causar infecciones invasores serias en pacientes immunocompromised, los ancianos, y las mujeres embarazadas. Las manifestaciones mas comunes de la listeriosis en seres humanos incluyen meningitis, encefalitis, y aborto fetal. Una secuela significativa pero mucho menos documentada de la infección invasor de los monocytogenes del L. implica el corazón. La tasa de mortalidad por enfermedad cardíaca puede ser de hasta el 35% a pesar del tratamiento, sin embargo se sabe muy poco sobre la colonización de L. monocytogenes del tejido cardíaco y sus patologías resultantes. Además, recientemente se ha hecho evidente que las subpoblaciones de L. monocytogenes tienen una mayor capacidad para invadir y crecer dentro del tejido cardíaco. Este protocolo describe detalladamente los métodos ines vitro e in vivo que se pueden utilizar para determinar cardiotropism de los aislantes de los monocytogenes del L. Los métodos se presentan para la infección de los mioblastos cardiacos de la rata H9c2 en cultura del tejido así como para la determinación de la colonización bacteriana de los corazones de ratones infectados. Estos métodos son útiles no sólo para identificar tensiones con el potencial de colonizar el tejido cardiaco en animales infectados, pero pueden también facilitar la identificación de los productos bacterianos del gen que sirven para aumentar la invasión de la célula cardiaca y/o para conducir cambios en patología del corazón. Estos métodos también proporcionan la comparación directa del cardiotropismo entre múltiples cepas de L. monocytogenes.

Los aislantes seleccionados de los monocytogenes del L. exhiben la invasión aumentada de células cardiacas en cultivo celular y en modelos del ratón de la infección. La Figura 1 muestra un ejemplo de cómo pueden aparecer colonias bacterianas después del revestimiento puntual de suspensiones en medios de agar. Este método permite una evaluación precisa de las UFC dentro de una muestra sin utilizar un gran número de placas de medios de agar. La Figura 2 muestra un ejemplo...

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Assessing Bacterial Invasion of Cardiac Cells in Culture and Heart Colonization in Infected Mice Using Listeria monocytogenes

Listeria monocytogenes causa infecciones fetales en mujeres embarazadas y meningitis en poblaciones susceptibles. Las subpoblaciones de bacterias pueden colonizar el tejido cardíaco, causando miocarditis en pacientes y animales de laboratorio. Aquí presentamos un protocolo que describe cómo evaluar la invasión de células cardíacas de L. monocytogenes in vitro y la colonización cardíaca en animales infectados.

Evaluación De La Invasión Bacteriana De Las Células Cardíacas En Cultivo Y Colonización Del Corazón En Ratones Infectados Usando Listeria monocytogenes

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La evaluación de la innata de detección de VIH-1 CD4 infectados<sup&gt; +</sup&gt; Células T por las células dendríticas plasmocitoides Usando un<em&gt; Ex vivo</em&gt; Co-cultura del sistema.

HIV-1 innate sensing requires direct contact of infected CD4+ T cells with plasmacytoid dendritic cells (pDCs). In order to study this process, the ...

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La purificación del ARN intracelularmente Grown<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; En los macrófagos

Analysis of the transcriptome of bacterial pathogens during mammalian infection is a valuable tool for studying genes and factors that mediate infection. ...

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La infección experimental con<em&gt; Listeria monocytogenes</em&gt; Como un modelo para el estudio de host Respuestas interferón gamma

L. monocytogenes is a gram-positive bacterium that is a cause of food borne disease in humans. Experimental infection of mice with this pathogen has been ...