Name: chitosan/interfering rna nanoparticle mediated gene silencing in disease vector mosquito larvae
Uploaded: 2015-03-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae at JoVE.com

Funding from the Kansas Agricultural Experiment Station and K-State Arthropod Genomics Center to KYZ supported the original development of chitosan/dsRNA-mediated gene silencing in A. gambiae19.The A. gambiae work described here was supported in part by R01-AI095842 from NIH/NIAID to KM. Development of chitosan/siRNA-mediated gene silencing in A. aegypti20,21 was supported by NIH/NIAID Award R01-AI081795 to MDS. The contents of this study are solely the responsibility of the authors and do not necessarily represent the official views of the NIH.

1. Mosquito Arter og stell <ol><li> Opprettholde A. gambiae G3 og A. aegypti Liverpool IB12 stammer (som brukes i de representative studier under) eller andre stammer av interesse i henhold til standard lab praksis eller som tidligere beskrevet 23,24. </li></ol> 2. dsRNA og siRNA Design og Produksjon <ol><li> Design primere for å konstruere lange dsrna maler som er spesifikke for genet av interesse. Bruk E-RNAi verktøy 25. Produsere dsRNA i henhold ti...

<ol>
	<li>Knipling, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+control+of+insects+of+public+health+importance.">Genetic control of insects of public health importance.</a> Bulletin of the World Health Organization. 38 (3), 421-438 (1968).</li><li>Fu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Female-specific+flightless+phenotype+for+mosquito+control.">Female-specific flightless phenotype for mosquito control.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (10), 4550-4554 (2010).</li><li>Wise de Valdez, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+elimination+of+dengue+vector+mosquitoes.">Genetic elimination of dengue vector mosquitoes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (12), 4772-4775 (2011).</li><li>Harris, A. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+suppression+of+a+field+mosquito+population+by+sustained+release+of+engineered+male+mosquitoes.">Successful suppression of a field mosquito population by sustained release of engineered male mosquitoes.</a> Nature Biotechnology. 30 (9), 828-830 (2012).</li><li>Fire, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans.">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li><li>Yu, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Delivery+of+dsRNA+for+RNAi+in+insects:+an+overview+and+future+directions.">Delivery of dsRNA for RNAi in insects: an overview and future directions.</a> Insect science. 20 (1), 4-14 (2013).</li><li>Zhang, H., Li, H. C., Feasibility Miao, X. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=limitation+and+possible+solutions+of+RNAi-based+technology+for+insect+pest+control.">limitation and possible solutions of RNAi-based technology for insect pest control.</a> Insect science. 20 (1), 15-30 (2013).</li><li>Clemons, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+genes+in+Aedes+aegypti+embryos.">Functional analysis of genes in Aedes aegypti embryos.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).</li><li>Clemons, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=siRNA-mediated+gene+targeting+in+Aedes+aegypti+embryos+reveals+that+frazzled+regulates+vector+mosquito+CNS+development.">siRNA-mediated gene targeting in Aedes aegypti embryos reveals that frazzled regulates vector mosquito CNS development.</a> PLoS One. 6 (1), e16730 (2011).</li><li>Haugen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semaphorin-1a+is+required+for+Aedes+aegypti+embryonic+nerve+cord+development.">Semaphorin-1a is required for Aedes aegypti embryonic nerve cord development.</a> PLoS One. 6 (6), e21694 (2011).</li><li>Nguyen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+genetic+characterization+of+salivary+gland+development+in+Aedes+aegypti.">Functional genetic characterization of salivary gland development in Aedes aegypti.</a> EvoDevo. 4 (1), 9 (2013).</li><li>Sarro, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Requirement+for+commissureless2+function+during+dipteran+insect+nerve+cord+development.">Requirement for commissureless2 function during dipteran insect nerve cord development.</a> Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists. 242 (12), 1466-1477 (2013).</li><li>Singh, A. D., Wong, S., Ryan, C. P., Whyard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+delivery+of+double-stranded+RNA+in+larvae+of+the+yellow+fever+mosquito,+Aedes+aegypti:+implications+for+pest+mosquito+control.">Oral delivery of double-stranded RNA in larvae of the yellow fever mosquito, Aedes aegypti: implications for pest mosquito control.</a> J Insect Sci. 13, 69 (2013).</li><li>Lopez-Martinez, G., Meuti, M., Denlinger, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rehydration+driven+RNAi:+a+novel+approach+for+effectively+delivering+dsRNA+to+mosquito+larvae.">Rehydration driven RNAi: a novel approach for effectively delivering dsRNA to mosquito larvae.</a> Journal of medical entomology. 49 (1), 215-218 (2012).</li><li>Scott, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+elements+of+successful+insect+RNAi.">Towards the elements of successful insect RNAi.</a> Journal of insect physiology. 59 (12), 1212-1221 (2013).</li><li>Coy, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+silencing+in+adult+Aedes+aegypti+mosquitoes+through+oral+delivery+of+double-stranded+RNA.">Gene silencing in adult Aedes aegypti mosquitoes through oral delivery of double-stranded RNA.</a> J Appl Entomol. 136 (10), 741-748 (2012).</li><li>Zhang, X., Zhang, J., Zhu, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/double-stranded+RNA+nanoparticle-mediated+RNA+interference+to+silence+chitin+synthase+genes+through+larval+feeding+in+the+African+malaria+mosquito+(Anopheles+gambiae).">Chitosan/double-stranded RNA nanoparticle-mediated RNA interference to silence chitin synthase genes through larval feeding in the African malaria mosquito (Anopheles gambiae).</a> Insect molecular biology. 19 (5), 683-693 (2010).</li><li>Mysore, K., Flannery, E. M., Tomchaney, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disruption+of+Aedes+aegypti+olfactory+system+development+through+chitosan/siRNA+nanoparticle+targeting+of+semaphorin-1a.">Disruption of Aedes aegypti olfactory system development through chitosan/siRNA nanoparticle targeting of semaphorin-1a.</a> PLoS neglected tropical diseases. 7 (5), e2215 (2013).</li><li>Mysore, K., Andrews, E., Li, P., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan/siRNA+nanoparticle+targeting+demonstrates+a+requirement+for+single-minded+during+larval+and+pupal+olfactory+system+development+of+the+vector+mosquito+Aedes+aegypti.">Chitosan/siRNA nanoparticle targeting demonstrates a requirement for single-minded during larval and pupal olfactory system development of the vector mosquito Aedes aegypti.</a> BMC developmental biology. 14 (1), 9 (2014).</li><li>Dass, C. R., Choong, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chitosan-mediated+orally+delivered+nucleic+acids:+a+gutful+of+gene+therapy.">Chitosan-mediated orally delivered nucleic acids: a gutful of gene therapy.</a> Journal of drug targeting. 16 (4), 257-261 (2008).</li><li>An, C., Budd, A., Kanost, M. R., Michel, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+a+regulatory+unit+that+controls+melanization+and+affects+longevity+of+mosquitoes.">Characterization of a regulatory unit that controls melanization and affects longevity of mosquitoes.</a> Cellular and molecular life sciences : CMLS. 68 (11), 1929-1939 (2011).</li><li>Clemons, A., Mori, A., Haugen, M., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+and+egg+collection+of+Aedes+aegypti.">Culturing and egg collection of Aedes aegypti.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (2010).</li><li>Horn, T., Boutros, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=E-RNAi:+a+web+application+for+the+multi-species+design+of+RNAi+reagents--2010+update.">E-RNAi: a web application for the multi-species design of RNAi reagents--2010 update.</a> Nucleic acids research. 38, W332-W339 (2010).</li><li>Patel, N. H., PA, K. r. i. e. g. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+19.+In+situ+hybridization+to+whole+mount+Drosophila+embryos.">Ch. 19. In situ hybridization to whole mount Drosophila embryos.</a> A laboratory guide to RNA: Isolation, Analysis, and Synthesis. , (1996).</li><li>Haugen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Whole-mount in situ hybridization for analysis of gene expression during Aedes aegypti development. 2010 (10), (2010).</li><li>Clemons, A., Flannery, E., Kast, K., Severson, D. W., Duman-Scheel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+analysis+of+protein+expression+during+Aedes+aegypti+development.">Immunohistochemical analysis of protein expression during Aedes aegypti development.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (10), (1101).</li><li>Rund, S. S., Hou, T. Y., Ward, S. M., Collins, F. H., Duffield, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiling+of+diel+and+circadian+gene+expression+in+the+malaria+vector+Anopheles+gambiae.">Genome-wide profiling of diel and circadian gene expression in the malaria vector Anopheles gambiae.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (32), E421-E430 (2011).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN,+TALEN,+CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">ZFN, TALEN, CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends in biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).</li><li>Aryan, A., Myles, K. M., Adelman, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+genome+editing+in+Aedes+aegypti+using+TALENs.">Targeted genome editing in Aedes aegypti using TALENs.</a> Methods. 69 (1), 38-45 (2014).</li><li>Sarathi, M., Simon, M. C., Venkatesan, C., Hameed, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+bacterially+expressed+VP28dsRNA+to+protect+Penaeus+monodon+from+white+spot+syndrome+virus.">Oral administration of bacterially expressed VP28dsRNA to protect Penaeus monodon from white spot syndrome virus.</a> Mar Biotechnol (NY). 10 (3), 242-249 (2008).</li><li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+nanoparticle+delivered+dsRNA+toward+genetic+control+of+insect+pests).">Fluorescent nanoparticle delivered dsRNA toward genetic control of insect pests).</a> Adv Mater. 25 (33), 4580-4584 (2013).</li><li>Giljohann, D. A., Seferos, D. S., Prigodich, A. E., Patel, P. C., Mirkin, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+regulation+with+polyvalent+siRNA-nanoparticle+conjugates.">Gene regulation with polyvalent siRNA-nanoparticle conjugates.</a> Journal of the American Chemical Society. 131 (6), 2072-2073 (2009).</li><li>Davis, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+of+RNAi+in+humans+from+systemically+administered+siRNA+via+targeted+nanoparticles.">Evidence of RNAi in humans from systemically administered siRNA via targeted nanoparticles.</a> Nature. 464 (7921), 1067-1070 (2010).</li><li>Molinaro, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyethylenimine+and+chitosan+carriers+for+the+delivery+of+RNA+interference+effectors.">Polyethylenimine and chitosan carriers for the delivery of RNA interference effectors.</a> Expert opinion on drug delivery. 10 (12), 1653-1668 (2013).</li><li>Singha, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polymers+in+small-interfering+RNA+delivery.">Polymers in small-interfering RNA delivery.</a> Nucleic acid therapeutics. 21 (3), 133-148 (2011).</li></ol>

Chitosan / interfererende RNA nanopartikkel metodologi beskrevet her har blitt brukt til å målrette gener under larveutvikling i A. gambiae (figur 2, 3) og A. aegypti (figur 4, 5, 6, Bord 1, 2). Kitosan nanopartikler kan være forberedt med enten lang dsRNA eller siRNA, som begge har vært brukt med hell i mygg som gjenspeiles av de representative resultatene som er beskrevet her. Syntese av dsRNA er billigere enn å kjøpe siRNA, men er mer arbeidskrevende. Hvis kit...

Blod fôring vektor mygg av Anopheline og Aedine slekter overføre sykdomsfremkallende stoffer som er ansvarlige for flere av de verste svøper i menneskeheten. Anslagsvis 3,4 milliarder mennesker er i faresonen for å pådra malaria, som er ansvarlig for over en halv million dødsfall årlig på verdensbasis. Malaria resultater fra infeksjon med Plasmodium sp. Parasitter, som overføres til mennesker gjennom bitt av infisert mygg av Anopheles slekten, inkludert rektor afrikanske vektor Anopheles gambiae ( <a href="http://www.who.int/topics/malaria/en/">http://www.who.int/topics/malaria/en/</a> , Aedes aegypti er den primære mygg vektor for dengue virus som forårsaker denguefeber, en ikke-spesifikk febril sykdom som er den mest utbredte og betydelig arboviral sykdom i verden 2014) 1.. Dengue-virus er i dag en trussel mot&gt; 2,5 milliarder mennesker i tropene, med en årlig incidence på ca 50 millioner tilfeller har resultert i ~ 24 000 dødsfall årlig ( <a href="http://www.cdc.gov/dengue/">http://www.cdc.gov/dengue/</a> , 2014) 2. Til tross for den ødeleggende globale effekten av mygg-borne sykdommer på menneskers helse, er effektive virkemidler for å forebygge og behandle disse sykdommene mangler. Mygg kontroll er i dag den beste metoden for sykdomsforebygging. Potensialet for å styre leddyr sykdommer ved genetisk manipulering av vektor insekter har blitt anerkjent i over fire tiår tre. Transgene stammer av A. aegypti konstruert for å ha en repressible kvinnelig spesifikke flight fenotype nylig har gjort potensialet for bruk av transgene vektor kontroll strategier en realitet 4-6. Disse fremskritt har utfordret forskerne å identifisere nye genetiske mål for vektor kontroll og ekstra middel til å manipulere gen-funksjon i vektor mygg. Endring av genekspresjon during utvikling, slik tilfellet var i kvinneflight mygg 4 var, kan fremme klarlegging av nye vektor kontroll strategier. Imidlertid i stor grad på grunn av tekniske utfordringer, funksjonene til svært få gener har vært preget under utviklingen av A. gambiae, A. aegypti, eller andre myggarter. Siden den ble oppdaget i C. elegans 7, RNA-interferens (RNAi), som er konservert i dyr, planter og mikroorganismer, har vært i utstrakt bruk for funksjonell genetiske studier i en rekke organismer, inkludert insekter 8,9. RNAi veien er initiert av dicer, som kløyver lang dsRNA i korte 20-25 nukleotid-lang sirnas som fungerer som sekvens-spesifikke RNA forstyrrende. sirnas stillhet gener som er komplementære i rekkefølge ved å fremme avskrift omsetning, cleavage, og forstyrrelse av oversettelses 9. Lange dsrna molekyler (typisk 300-600 bp) eller egendefinerte sirnas rettet mot en particular-sekvens kan anvendes i forskningslaboratorium for lyddemping ethvert gen av interesse. Ved å styre når interfering RNA er levert, kan forskerne styre tiden på hvilket gen stanse innviede. Denne fordel er nyttig fordi det kan brukes til å overvinne utfordringer som utviklings letalitet eller sterilitet, som kan hindre produksjon og vedlikehold av stammer som bærer mutasjoner arve, en kostbar og arbeidskrevende prosess som ennå ikke er tilgjengelig på alle insektarter. Selv om graden av genet Slå av RNAi kan variere fra gen til genet, vev til vev, og dyr til dyr, er RNAi mye brukt for funksjonell analyse av gener i mygg og andre insekter 8,9. Tre interfererende RNA leverings strategier har blitt brukt i mygg: mikroinjeksjon, soaking / lokal applikasjon, og inntak. For en detaljert historie og sammenligning av bruken av disse tre teknikkene i insekter, henvises det til Yu et al 8. We har med hell brukt mikroinjeksjon 10 som et middel til å levere sirnas å målrette utviklings gener i A. aegypti embryoer, larver og pupper 11-14. Men denne arbeidskrevende levering strategi krever både en mikroinjeksjon oppsett og en dyktig hånd. Videre er mikroinjeksjon stressende for organismen, en problemfaktor, spesielt når atferds fenotyper vil bli vurdert. Endelig kan mikroinjeksjon levering ikke forlenges til feltet for vektorkontroll. Som et alternativ, har soaking organismen i interfering RNA løsning også blitt et populært middel for å indusere genet Slå, som det er praktisk og krever lite utstyr eller arbeidskraft. Soaking har primært blitt brukt i insektcellelinje studerer åtte, men i en fersk studie, ble knockdown oppnådd i A. aegypti larver neddykket i en oppløsning av dsRNA 15, hvor dyrene viste seg å være inntak. Imidlertid, for studier som involverer analyse av flere Experimental grupper eller fenotyper, er soaking ganske kostbare. Lopez-Martinez et al. 16 beskrevet rehydrering drevet RNAi, en ny tilnærming for interfering RNA levering som involverer dehydrering i saltvannsoppløsning og rehydrering med en eneste dråpe vann som inneholder RNA forstyrrende. Denne tilnærmingen gjør kutte kostnadene forbundet med hele dyr nedsenking, men er dyrere enn mikroinjeksjon og kan være begrenset i sin søknad til arter som tåler høye osmotiske trykk. Dessuten er det vanskelig å forestille seg hvordan nedsenking eller dehydrering / rehydrering nedsenking metodikk kunne tilpasses for vektorkontroll i felten. For disse grunner, for post-embryonale studier, levering av interfering RNA med inntatt mat er et levedyktig alternativ strategi. Selv svelging baserte strategier ikke fungerer i alle insektarter, kanskje mest kjent Drosophila melanogaster, har oral levering av interfering RNA blandet med mat forfremmet genet silencing i en rekke insekter 8,17, inkludert A. aegypti voksne 18. Vi beskrev kitosan nanopartikkel-mediert RNAi i A. gambiae larver 19 og har med hell brukt denne tilnærmingen for reduksjon av genuttrykk i A. aegypti larver 20,21. Her, metodikk for dette RNAi prosedyre, som innebærer entrapping av interfering RNA ved polymer kitosan, er detaljert. Chitosan / interfererende RNA-nanopartikler er dannet av selvbygging av polykationer med interfererende RNA gjennom de elektrostatiske krefter mellom positive ladninger av aminogruppene i kitosan og negative ladninger som bæres av de fosfatgrupper på ryggraden i interfererende RNA 19. Fremgangsmåten som er beskrevet er kompatibel med både lange dsrna molekyler (heretter referert til som dsRNA) eller dobbelt-trådet siRNA (heretter referert til som siRNA). Etter syntese kitosan / interfererende RNA nanopartikler er blandet med larve mat og levert tillarver gjennom oralt inntak. Denne metoden er relativt billig, krever lite utstyr og arbeidskraft 19, og legger til rette for høy gjennomstrømming analyse av flere fenotyper, inkludert analyse av atferd 20,21. Denne metode, som kan tilpasses for genet Slå studier i andre insekter, blant andre sykdoms vektorer og insekt skadedyr i jordbruket, kan benyttes for genet Slå i en rekke andre dyrearter. Videre, kitosan, en billig, ikke-toksisk og biologisk nedbrytbar polymer 22, kan potensielt bli anvendt i feltet for artsspesifikk mygg kontroll.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1429">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:347px;">Name of Reagent/Equipment</td>
			<td style="width:243px;">Company</td>
			<td style="width:177px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:663px;">Comments/Descriptions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.02 ml pipetteman</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>PR20</td>
			<td>for resuspension of interfering RNA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.2 ml pipetteman</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>PR200</td>
			<td>for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">0.5 ml graduated tube&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>05-408-120</td>
			<td>for aliquoting resuspended interfering RNA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1 ml pipetteman</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>PR1000</td>
			<td>for resuspension of interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1.5 ml graduated tube&#160;</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>05-408-046</td>
			<td>for preparation of interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">1M Sodium Acetate, pH 4.5</td>
			<td>TEKnova</td>
			<td>S0299</td>
			<td>to prepare sodium acetate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Acetic Acid, AIRSTAR. ACS, USP, FCC Grade</td>
			<td>BDH</td>
			<td>VWR BDH3092-500MLP</td>
			<td>to prepare sodium acetate buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Agarose Genetic Technology Grade</td>
			<td>MP Biomedicals LLC.</td>
			<td>800668</td>
			<td>to coat prepared interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf AG</td>
			<td>5415D</td>
			<td>to pellet interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Chitosan, from shrimp shells</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C3646-25G</td>
			<td>to combine with interfering RNA for prepararation of interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dry Yeast</td>
			<td>Universal Food Corp</td>
			<td>NA</td>
			<td>to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">E-RNAi tool</td>
			<td>German Cancer Research Center</td>
			<td>NA</td>
			<td>for design of dsRNA; http://www.dkfz.de/signaling/e-rnai3//</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">goldfish food</td>
			<td>Wardley</td>
			<td>Goldfish FLAKE FOOD</td>
			<td>to prepare mosquito larval food with interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Heated water bath</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>51221048</td>
			<td>to heat the interfering RNA/nanoparticles at 55oC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ice</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>for thawing interfering RNA and preparation of interfering RNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Ice bucket</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>02-591-44</td>
			<td>for storage of ice used during the procedure</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">liver powder</td>
			<td>MP Biomedicals LLC.</td>
			<td>900396</td>
			<td>to feed mosquito larvae post interfering RNA/nanoparticle treatment</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Microwave oven</td>
			<td>A variety of vendors</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>to prepare 2% agarose solution</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">petridish (100X15 mm)</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>875713</td>
			<td>interfering RNA/nanoparticle feeding chamber for larvae</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">pH meter</td>
			<td>Mettler Toledo</td>
			<td>S220</td>
			<td>for preparation of buffers</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Razor blade</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>12-640</td>
			<td>to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">siRNA</td>
			<td>Thermo Scientific/Dharmacon</td>
			<td>custom</td>
			<td>for preparation of siRNA/nanoparticles</td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Sodium Sulfate, Anhydrous (Na2SO4)</td>
			<td>BDH/distributed by VWR</td>
			<td>VWR BDH0302-500G</td>
			<td>to prepare 50mM sodium sulfate solution in which the interfering RNA will be resuspended</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Thermometer</td>
			<td>VWR</td>
			<td>61066-046</td>
			<td>to measure the water bath temperature</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tooth picks</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470146-908</td>
			<td>for stirring during interfering RNA/nanoparticle food preparation and cutting gel pellets</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td height="24" style="height:24px;">Ultralow freezer</td>
			<td>A variety of vendors</td>
			<td>not applicable</td>
			<td>for storage of interfering RNA aliquots and interfering RNA/nanoparticles at -80oC</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Vortex mixer</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>02-216-108</td>
			<td>for preparation of chitosan/interfering RNA</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Weight paper</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>NC9798735</td>
			<td>to divide the interfering RNA/nanoparticle pellet for feedings</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

chitosan/interfering rna nanoparticle mediated gene silencing in disease vector mosquito larvae

Vektor mygg påføre mer menneskelig lidelse enn noen annen organisme - og drepe mer enn én million mennesker hvert år. De mygg genomprosjekter tilrettelagt forskning i nye fasetter av mygg biologi, inkludert funksjonelle genetiske studier i primær afrikanske malaria vektor Anopheles gambiae og dengue og gul feber vektor Aedes aegypti. RNA uforstyrret (RNAi-) mediert genet Slå har blitt brukt til å målrette gener av interesse i begge disse sykdomsvektormyggarter. Her beskriver vi en fremgangsmåte for fremstilling av kitosan / interfererende RNA-nanopartikler som er kombinert med mat og inntas av larver. Dette er teknisk ukomplisert høy gjennomstrømning, og forholdsvis billig metode, som er kompatibel med langt dobbelttrådet RNA (dsRNA) eller små interfererende RNA (siRNA) molekyler har blitt brukt for en vellykket knockdown av en rekke forskjellige gener i A. gambiae og A. aegyptilarver. Etter larve feedings, knockdown, noe som er bekreftet gjennom QRT-PCR eller in situ hybridisering, kan vedvare minst gjennom sent pupal scenen. Denne metoden kan anvendes på et bredt utvalg av mygg og andre insektarter, inkludert skadedyr i jordbruket, så vel som andre ikke-modellorganismer. I tillegg til sin anvendelse i forskningslaboratorium, i fremtiden, kitosan, en billig, ikke-toksisk og biologisk nedbrytbar polymer, kan potensielt bli anvendt i felten.

<html> A. gambiae: Kitosan / dsrna nanopartikler dannes på grunn av den elektrostatiske interaksjon mellom aminogruppene av chitosan og fosfatgrupper av dsRNA. Effektiviteten av dsRNA inkorporering i nanopartikler er vanligvis over 90%, målt ved uttømming av dsRNA fra oppløsningen. Atomic force mikroskopi bilder viser at kitosan-dsrna partikkelstørrelse gjennomsnitt 140 nm i diameter, alt 100-200 nm (figur 1). <p class="jove_content" fo:keep...

Watch this Scientific Journal Video about Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae at JoVE.com

Chitosan/Interfering RNA Nanoparticle Mediated Gene Silencing in Disease Vector Mosquito Larvae

Her beskriver vi en fremgangsmåte for å hemme genfunksjon i sykdomsvektor mygg ved bruk av kitosan / interfererende RNA-nanopartikler som er inntatt av larver.

Chitosan / interfering RNA Nanopartikkel mediert genet Slå i Disease Vector mygglarver

Vector mosquitoes inflict more human suffering than any other organism&#8212;and kill more than one million people each year. The mosquito genome projects ...

Research

JoVE Journal

Biology

Virus-induced Gene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato

Virus-induced Gene Silencing VIGS in Nicotiana benthamiana and Tomato

RNA interference (RNAi) is a highly specific gene-silencing phenomenon triggered by dsRNA1. This silencing mechanism uses two major classes of RNA ...

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

Live Cell Calcium Imaging Combined with siRNA Mediated Gene Silencing Identifies Ca2+ Leak Channels in the ER Membrane and their Regulatory Mechanisms

In mammalian cells, the endoplasmic reticulum (ER) plays a key role in protein biogenesis as well as in calcium signalling1. The heterotrimeric Sec61 ...

Agrobacterium-Mediated Virus-Induced Gene Silencing Assay In Cotton

Cotton (Gossypium hirsutum) is one of the most important crops worldwide. Considerable efforts have been made on molecular breeding of new varieties.  The ...

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transcription and Capping of Gaussia Luciferase mRNA Followed by HeLa Cell Transfection

In vitro Transkripsjon og tildekking av Gaussia luciferase mRNA Etterfulgt av Jakten Cell Transfeksjon

In vitro transcription is the synthesis of RNA transcripts by RNA polymerase from a linear DNA template containing the corresponding promoter sequence ...

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolation of Ribosome Bound Nascent Polypeptides in vitro to Identify Translational Pause Sites Along mRNA

Isolering av ribosome Innbundne begynnende polypeptider<em&gt; In vitro</em&gt; For å identifisere translasjonelle Pause steder langs mRNA

The rate of translational elongation is non-uniform. mRNA secondary structure, codon usage and mRNA associated proteins may alter ribosome movement on the ...

Using SecM Arrest Sequence as a Tool to Isolate Ribosome Bound Polypeptides

Bruke SecM Arrest sekvens som et verktøy for å isolere ribosom Innbundne polypeptider

Extensive research has provided ample evidences suggesting that protein folding in the cell is a co-translational process1-5. However, the exact pathway ...

Depletion of Ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

Nedbryting av ribosomal RNA for Mosquito Gut Metagenomic RNA-seq

The mosquito gut accommodates dynamic microbial communities across different stages of the insect's life cycle. Characterization of the genetic capacity ...

Metabolic Labeling of Leucine Rich Repeat Kinases 1 and 2 with Radioactive Phosphate

Metabolsk Merking av leucine Rich Gjenta Kinaser en og to med Radioaktiv Fosfat

Leucine rich repeat kinases 1 and 2 (LRRK1 and LRRK2) are paralogs which share a similar domain organization, including a serine-threonine kinase domain, ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Analyse av global RNA syntese på celle-nivå etter Hypoksi

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

En eksperimentell og bioinformatikk protokoll for RNA-seq Analyser av Photoperiodic Diapause i den asiatiske tiger Mosquito,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...