Name: genome-wide snapshot of chromatin regulators and states in xenopus embryos by chip-seq
Uploaded: 2015-02-26T13:00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq at JoVE.com

We thank Chris Benner for implementing the X. tropicalis genome (xenTro2, xenTro2r) into HOMER and the Gilchrist lab for discussions on post-sequencing analysis. I.P. assisted the GO term analysis. G.E.G and J.C.S. were supported by the Wellcome Trust and are now supported by the Medical Research Council (program number U117597140).

<ol>
	<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+protein-DNA+interactions+in+vivo:+distribution+of+RNA+polymerase+on+specific+bacterial+genes.">Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (14), 4275-4279 (1984).</li><li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+interactions+of+RNA+polymerase+II+with+genes+of+Drosophila+melanogaster.">In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Mol Cell Biol. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li><li>Solomon, M. J., Larsen, P. L., Varshavsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+protein-DNA+interactions+in+vivo+with+formaldehyde:+evidence+that+histone+H4+is+retained+on+a+highly+transcribed+gene.">Mapping protein-DNA interactions in vivo with formaldehyde: evidence that histone H4 is retained on a highly transcribed gene.</a> Cell. 53 (6), 937-947 (1988).</li><li>Ren, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+location+and+function+of+DNA+binding+proteins.">Genome-wide location and function of DNA binding proteins.</a> Science. 290 (5500), 2306-2309 (2000).</li><li>Johnson, D., Mortazavi, A., Myers, R., Wold, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+mapping+of+in+vivo+protein-DNA+interactions.">Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions.</a> Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).</li><li>Hellsten, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genome+of+the+Western+clawed+frog+Xenopus+tropicalis.">The genome of the Western clawed frog Xenopus tropicalis.</a> Science. 328 (5978), 633-636 (2010).</li><li>Lee, T. I., Johnstone, S. E., Young, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+and+microarray-based+analysis+of+protein+location.">Chromatin immunoprecipitation and microarray-based analysis of protein location.</a> Nature Protocols. 1 (2), 729-748 (2006).</li><li>Blythe, S. A., Reid, C. D., Kessler, D. S., Klein, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+in+early+Xenopus+laevis+embryos.">Chromatin immunoprecipitation in early Xenopus laevis embryos.</a> Dev Dyn. 238 (6), 1422-1432 (2009).</li><li>Gentsch, G. E., Smith, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+physical+chromatin+associations+across+the+Xenopus+genome+by+chromatin+immunoprecipitation.">Investigating physical chromatin associations across the Xenopus genome by chromatin immunoprecipitation.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (5), (2014).</li><li>Ubbels, G. A., Hara, K., Koster, C. H., Kirschner, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+a+functional+role+of+the+cytoskeleton+in+determination+of+the+dorsoventral+axis+in+Xenopus+laevis+eggs.">Evidence for a functional role of the cytoskeleton in determination of the dorsoventral axis in Xenopus laevis eggs.</a> J Embryol Exp Morphol. 77, 15-37 (1983).</li><li>Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+and+memory-efficient+alignment+of+short+DNA+sequences+to+the+human+genome.">Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome.</a> Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).</li><li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sequence+Alignment/Map+format+and+SAMtools.">The Sequence Alignment/Map format and SAMtools.</a> Bioinformatics. 25 (16), 2078-2079 (2009).</li><li>Heinz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simple+combinations+of+lineage-determining+transcription+factors+prime+cis-regulatory+elements+required+for+macrophage+and+B+cell+identities.">Simple combinations of lineage-determining transcription factors prime cis-regulatory elements required for macrophage and B cell identities.</a> Mol Cell. 38 (4), 576-589 (2010).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Model-based+analysis+of+ChIP-Seq+(MACS).">Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS).</a> Genome Biol. 9 (9), R137 (2008).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+genomics+viewer.">Integrative genomics viewer.</a> Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).</li><li>Thorvaldsdottir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrative+Genomics+Viewer+(IGV):+high-performance+genomics+data+visualization+and+exploration.">Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration.</a> Brief Bioinform. 14 (2), 178-192 (2013).</li><li>Imoto, S., Nolan, J., Bioinformatics Miyano, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 20 (9), 1453-1454 (2004).</li><li>Camacho, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BLAST+:+architecture+and+applications.">BLAST+: architecture and applications.</a> BMC Bioinformatics. 10, 421 (2009).</li><li>Conesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blast2GO:+a+universal+tool+for+annotation,+visualization+and+analysis+in+functional+genomics+research.">Blast2GO: a universal tool for annotation, visualization and analysis in functional genomics research.</a> Bioinformatics. 21 (18), 3674-3676 (2005).</li><li>Sive, H., Grainger, R., Harland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Early development of Xenopus laevis: A laboratory manual. , (2000).</li><li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+factors+influencing+ChIP-seq+fidelity.">Systematic evaluation of factors influencing ChIP-seq fidelity.</a> Nat Methods. 9 (6), 609-614 (2012).</li><li>Sharov, A. A., Ko, M. S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exhaustive+search+for+over-represented+DNA+sequence+motifs+with+CisFinder.">Exhaustive search for over-represented DNA sequence motifs with CisFinder.</a> DNA Res. 16 (5), 261-273 (2009).</li><li>Bailey, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEME+SUITE:+tools+for+motif+discovery+and+searching.">MEME SUITE: tools for motif discovery and searching.</a> Nucl Acids Res. 37 (2), W202-W208 (2009).</li><li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2(-Delta+Delta+C(T))+Method.">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li><li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq:+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology.">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li><li>Gentsch, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+T-box+transcription+factor+profiling+reveals+joint+regulation+of+embryonic+neuromesodermal+bipotency.">In vivo T-box transcription factor profiling reveals joint regulation of embryonic neuromesodermal bipotency.</a> Cell Rep. 4 (6), 1185-1196 (2013).</li><li>Barabasi, A. L., Oltvai, Z. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Network+biology:+understanding+the+cell's+functional+organization.">Network biology: understanding the cell's functional organization.</a> Nat Rev Genet. 5 (2), 101-113 (2004).</li><li>Biggin, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+transcription+networks+as+highly+connected,+quantitative+continua.">Animal transcription networks as highly connected, quantitative continua.</a> Dev Cell. 21 (4), 611-626 (2011).</li><li>Nieuwkoop, P. D., Faber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Normal table of Xenopus laevis (Daudin): a systematical and chronological survey of the development from the fertilized egg till the end of metamorphosis. , (1994).</li><li>Akkers, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hierarchy+of+H3K4me3+and+H3K27me3+acquisition+in+spatial+gene+regulation+in+Xenopus+embryos.">A hierarchy of H3K4me3 and H3K27me3 acquisition in spatial gene regulation in Xenopus embryos.</a> Dev Cell. 17 (3), 425-434 (2009).</li><li>Yoon, S. J., Wills, A. E., Chuong, E., Gupta, R., Baker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> HEB and E2A function as SMAD/FOXH1 cofactors. Genes Dev. 25 (15), 1654-1661 (2011).</li><li>Jallow, Z., Jacobi, U. G., Weeks, D. L., Dawid, I. B., Veenstra, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specialized+and+redundant+roles+of+TBP+and+a+vertebrate-specific+TBP+paralog+in+embryonic+gene+regulation+in+Xenopus.">Specialized and redundant roles of TBP and a vertebrate-specific TBP paralog in embryonic gene regulation in Xenopus.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (37), 13525 (2004).</li><li>Buchholz, D. R., Paul, B. D., Shi, Y. -. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-specific+changes+in+promoter+occupancy+by+thyroid+hormone+receptor+during+frog+metamorphosis.+Implications+for+developmental+gene+regulation.">Gene-specific changes in promoter occupancy by thyroid hormone receptor during frog metamorphosis. Implications for developmental gene regulation.</a> J Biol Chem. 280 (50), 41222-41228 (2005).</li><li>Wills, A. E., Guptaa, R., Chuonga, E., Baker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromatin+immunoprecipitation+and+deep+sequencing+in+Xenopus+tropicalis+and+Xenopus+laevis.">Chromatin immunoprecipitation and deep sequencing in Xenopus tropicalis and Xenopus laevis.</a> Methods. 66 (3), 410-421 (2014).</li><li>Metz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+formaldehyde-induced+modifications+in+proteins:+reactions+with+model+peptides.">Identification of formaldehyde-induced modifications in proteins: reactions with model peptides.</a> J Biol Chem. 279 (8), 6235-6243 (2004).</li><li>Landt, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ChIP-seq+guidelines+and+practices+of+the+ENCODE+and+modENCODE+consortia.">ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia.</a> Genome Res. 22 (9), 1813-1831 (2012).</li><li>Mazzoni, E. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cell-based+mapping+of+developmental+transcriptional+programs.">Embryonic stem cell-based mapping of developmental transcriptional programs.</a> Nat Methods. 8 (12), 1056-1058 (2011).</li><li>Deal, R. B., Henikoff, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+gene+expression+and+chromatin+profiling+of+individual+cell+types+within+a+tissue.">A simple method for gene expression and chromatin profiling of individual cell types within a tissue.</a> Dev Cell. 18 (6), 1030-1040 (2010).</li><li>Bonn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-specific+analysis+of+chromatin+state+identifies+temporal+signatures+of+enhancer+activity+during+embryonic+development.">Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development.</a> Nat Genet. 44 (2), 148-156 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

הפרוטוקול שלנו מתאר כיצד לבצע ולנתח פרופילי הכרומטין הגנום מעוברי צפרדעים. היא משתרעת על כל צעד מחלבונים cross-linking ללוקוסי אנדוגני in vivo לעיבוד מיליוני כניסות המייצגים אתרים הגנומי מועשרות בסיליקון ו. מכיוון שמספרים גדלים והולכים של טיוטות הגנום זמינים, פרוטוקול זה צריך להיות ישים לאורגניזמים מודל ולא מודל אחרים. הסעיף הניסיוני החשוב ביותר, הקובע פרוטוקול זה מלבד העבודה קודמת 8,31,33,34, הוא ההליך שלאחר הקיבוע-לחלץ גרעינים צולבים. זה מקל solubilisation יעיל הכרומטין וגז וupscaling קל. יחד עם יעילות משופרת של הכנת ספריית פרוטוקול זה מאפשר הבנייה של ספריות שבב Seq גבוהות מורכבות מחצי עד שני מיליון תאים המבטאים את epitope הקשורים הכרומטין של עניין. בניסויים שבב qPCR, כמה עשרה אלף תאים אלה הם בדרך כלל מספיקכדי לבדוק להעשרת DNA באולי שישה לוקוסים הגנומי מובחנים. מספרים אלה הם הערכות שמרניות, אך עשוי להשתנות בהתאם לרמת ביטוי חלבון, איכות נוגדן, cross-linking יעילות, ונגישות epitope. כמדריך, עובר Xenopus אחת מכיל כ -4,000 תאים בשלב אמצע blastula (8.5 לאחר Nieuwkoop וFaber 29), 40,000 תאים בשלב gastrula מאוחר (12) ו100,000 תאים בשלב מוקדם tailbud (20). זמן הקיבעון המדויק לimmunoprecipitation היעילה צריך להיקבע באופן אמפירי על ידי שבב qPCR (סעיף 10). באופן כללי, פעמים קיבעון יותר נדרשות אם הניסוי כרוך X. laevis עוברים, שלבי התפתחות מוקדמים, ומאפיינים המחייבים DNA חלשים (או עקיפים). עם זאת, זה לא מומלץ תיקון עוברי Xenopus יותר מ -40 דקות, או עיבוד נוסף עוברי מכפי שצוין (סעיף 3), כגז הכרומטין הופך להיות פחות יעיל. חשוב לאלהשתמש בכל גליצין לאחר הקיבוע כצעד משותף זה למרווית פורמלדהיד יכול לעשות מיצוי גרעיני מעוברי חלמון עשיר מאוד קשים. נכון לעכשיו, הסיבה לכך אינה ידועה. זה מתקבל על הדעת כי adduct פורמלדהיד-גליצין מגיב נוסף עם N-מסוף אמינו-קבוצות או שאריות ארגינין 35. הנוגדן הוא מפתח לכל ניסוי שבב ובקרות מספיקות צריכה להתבצע כדי להראות את ייחודה לepitope של עניין (ראה הנחיות בLandt et al. 36). אם אין נוגדני כיתה שבב נגיש, כניסתה של מקביל חלבוני היתוך מתויג epitope עשויה להיות חלופה לגיטימית כחלבונים אלה יכולים לכבוש endogeneous אתרי קישור 37. במקרה זה, עובר uninjected הם הטובים ביותר לשימוש כביקורת שלילית ולא שבב עם סרום שאינו ספציפי. אסטרטגיה זו יכולה גם להיות מיושמת אם החלבון של העניין בא לידי ביטוי ברמות נמוכות וכתוצאה מכך עני ההתאוששות של enriDNA CHED. כלהכנת ספריות שבב Seq, בגלל הכמות הנמוכה של ה- DNA בשימוש, מומלץ לבחור בנהלים המפחיתים את מספר צעדי ניקוי ולשלב תגובות כדי לשמור על כל אובדן של DNA במינימום. המתאמים ופריימרים צריכים להיות תואם עם רצף זמנית ופלטפורמת NGS (ראו טבלה של חומרים / ציוד ספציפי). אם אתה משתמש Y-מתאמים (המכיל נשק חד-גדילים ארוכים), זה הוא קריטי מראש להגביר את הספרייה עם 04:57 סבבים של PCR לפני מוסיף DNA בחירה בגודל (למשל., 100 עד 300 נ&quot;ב) על ידי ג&#39;ל אלקטרופורזה. קצוות חד-גדילים לגרום שברי DNA להעביר הטרוגני. מבחנים שנערכו עם כמויות שונות של DNA קלט (למשל, 0.1, 0.5, 1, 2, 5, 10 ו -20 ng) מומלצים לקבוע את המספר הכולל של מחזורי PCR (פחות או שווה ל -18 מחזורים) הנדרש כדי להפוך את גודל ספריית -selected של 100 עד 200 ng. צמצום מספר מחזורי PCR הופך את הרצף של redundant קורא פחות סביר. חרוזים קיבוע הפיכים שלב מוצק טובים לנקות ריאגנטים לשחזר ביעילות את ה- DNA של עניין ובאמינות להסיר כל מתאמים והדימרים חופשיים מקשירה ותגובות PCR. במונחים של מספר, סוג ואורך של קורא, סביב 20-30,000,000 חד-הסוף קורא של 36 נ&quot;ב הוא מספיק עבור רוב ניסויי שבב Seq כדי לכסות את הגנום Xenopus השלם עם עומק מספיק. מכונות NGS הנפוצות ביותר הן מסוגלים לעמוד בקריטריונים אלה באופן שוטף. עם זאת, זה עשוי להיות מועיל כדי להגדיל את מספר קורא אם הפצות רחבות של קורא צפויות, כפי שנצפה בשינויים היסטון, ולא בפסגות חדות. בניסויים שבב Seq רבים, ניתן ונקווה 4-5 ספריות שונות צמודות ורצף בנתיב תא זרימה חד באמצעות מכונה NGS עתיר ביצועים. לפעמים כן, מומלץ להאריך את אורך הקריאה ורצף בשני הקצוות של תבנית ה- DNA (לזווג-end) כדי להגדיל את mappability wניתוח תרנגולת הכרומטין בתוך אזורים הגנומי חוזר על עצמו. פרוטוקול זה יושם בהצלחה במגוון רחב של תכונות הכרומטין כגון גורמי שעתוק, מתווכי איתות ושינויי היסטון לאחר translational. עם זאת, עובר לרכוש תואר הולך וגדל של ההטרוגניות סלולרית כפי שהם מפתחים ופרופילי הכרומטין להיות קשים יותר לפרש. צעדים מבטיחים נעשו בארבידופסיס ותסיסנית לנופי הכרומטין רקמות ספציפי פרופיל על ידי מיצוי גרעיני סוג ספציפי תא 38,39. הפרוטוקול שלנו כולל שלב חילוץ גרעיני, אשר יכול לסלול את הדרך לרקמות ספציפיות שבב Seq בעוברים אחרים.

The first attempts to characterize protein-DNA interactions in vivo were reported about 30 years ago in an effort to understand RNA polymerase-mediated gene transcription in bacteria and in the fruit fly1,2. Since then, the use of immunoprecipitation to enrich distinct chromatin features (ChIP) has been widely adopted to capture binding events and chromatin states with high efficiency3. Subsequently, with the emergence of powerful microarray technologies, this method led to the characterization of genome-wide chromatin landscapes4. More recently, chromatin profiling has become even more comprehensive and high-resolution, because millions of co-immunoprecipitated DNA templates can now be sequenced in parallel and mapped to the genome (ChIP-Seq)5. As increasing numbers of genome assemblies are available, ChIP-Seq is an attractive approach to learn more about the genome regulation that underlies biological processes. 
Here we provide a protocol to perform ChIP-Seq on yolk-rich embryos such as those of the frog Xenopus. Drafts of the genomes of both widely used Xenopus species&#8212;X. tropicalis and X. laevis&#8212;have now been released by the International Xenopus Genome Consortium6. The embryos of Xenopus species share many desirable features that facilitate and allow the interpretation of genome-wide chromatin studies, including the production of large numbers of high-quality embryos, the large size of the embryos themselves, and their external development. In addition, the embryos are amenable to classic and novel manipulations like cell lineage tracing, whole-mount in situ hybridisation, RNA overexpression, and TALEN/CRISPR-mediated knockout technology.
The following protocol builds on the work of Lee et al., Blythe et al. and Gentsch et al.7-9. Briefly, Xenopus embryos are formaldehyde-fixed at the developmental stage of interest to covalently bind (cross-link) proteins to their associated genomic DNA. After nuclear extraction, cross-linked chromatin is fragmented to focus subsequent sequencing on specific genomic binding or modification sites, and to minimize the contributions of flanking DNA sequences. Subsequently, the chromatin fragments are immunoprecipitated with a ChIP-grade antibody to enrich those containing the protein of interest. The co-immunoprecipitated DNA is stripped from the protein and purified before creating an indexed (paired-end) library for next-generation sequencing (NGS). At the end, simple command lines are offered for the post-sequencing analysis of ChIP-Seq data.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1/16 inch tapered microtip</td>
			<td>Qsonica</td>
			<td>4417</td>
			<td>This microtip is compatible with Sonicator 3000 from Misonix and Q500/700 from Qsonica.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8 ml glass sample vial with cap</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>224884</td>
			<td>8 ml clear glass sample vials for aqueous samples with 15-425 size phenolic rubber-lined screw caps.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adaptor</td>
			<td>IDT or Sigma</td>
			<td>NA</td>
			<td>TruSeq universal adaptor, 
AATGATACGGCGACCACCGAG 
ATCTACACTCTTTCCCTACAC 
GACGCTCTTCCGATC*T. TruSeq indexed adaptor, 
P-GATCGGAAGAGCACACGTC 
TGAACTCCAGTCAC &#8208;NNNNNN&#8208; 
ATCTCGTATGCCGTCT TCTGCTT*G. *, phosphorothioate bondphosphate group at 5&#39; end. NNNNNN, index (see TruSeq ChIP Sample Preparation Guide for DNA sequence). Order adaptors HPLC purified. Adaptors can be prepared by combining equimolar amounts (each 100 &#181;M) of the universal and the indexed adaptor and cooling them down slowly from 95 &#176;C to room temperature. Use 1.5 pmol per ng of input DNA. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>b2g4pipe (software)</td>
			<td>Blast2GO</td>
			<td>non-commercial</td>
			<td>http://www.blast2go.com/data/blast2go/b2g4pipe_v2.5.zip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BLAST+ (software)</td>
			<td>Camacho et al.</td>
			<td>non-commercial</td>
			<td>http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastDocs&#38;DOC_TYPE=Download</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bowtie (software)</td>
			<td>Langmead et al.</td>
			<td>non-commercial</td>
			<td>http://bowtie-bio.sourceforge.net/index.shtml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cisFinder (software)</td>
			<td>Sharov et al.</td>
			<td>non-commercial</td>
			<td>http://lgsun.grc.nia.nih.gov/CisFinder/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip for capillary electrophoresis</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>5067-1504</td>
			<td>Load this chip with 1 &#181;l DNA for library quality control. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chip-based capillary electrophoresis system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>G2940CA</td>
			<td>The Agilent 2100 BioAnalyzer is used to check the quality of ChIP-Seq libraries. Keep reagents at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP-Seq library preparation kit (KAPA Hyper Prep Kit)</td>
			<td>Kapa Biosystems</td>
			<td>KK8504</td>
			<td>Kit contains KAPA end repair and A-tailing enzyme mix, end Repair and A-tailing buffer, DNA ligase, ligation buffer, KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X), and KAPA library amplification primer mix (10X) (see also PCR primers). Adaptors are not included. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ChIP-Seq library preparation kit (alternative, ThruPLEX-FD Prep Kit)</td>
			<td>Rubicon Genomics</td>
			<td>R40048</td>
			<td>Kit uses their own stem-loop adaptors and primers. This kit eliminates intermediate purification steps and is as sensitive as the KAPA Hyper Prep Kit. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cluster3 (software)</td>
			<td>de Hoon et al.</td>
			<td>non-commercial</td>
			<td>http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FastQC (software)</td>
			<td>Simon Andrews</td>
			<td>non-commercial</td>
			<td>http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>Q32866</td>
			<td>Qubit 2.0 Fluorometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorometer reagents</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>Q32851</td>
			<td>The kit provides concentrated assay reagent, dilution buffer, and pre-diluted DNA standards for the Qubit fluorometer. Store DNA standards at 4 &#176;C, buffer and dye at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formaldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F8775-4X25ML</td>
			<td>Formaldehyde solution, for molecular biology, 36.5-38% in H2O, stabilised with 10-15% methanol. Store at room temperature. CAUTION: Formaldehyde is corrosive and highly toxic.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel (E-Gel EX agarose , 2%)</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>G4010</td>
			<td>Pre-cast gel with 11 wells, openable format. Leave one lane between ladder and library empty to avoid cross-contamination. Store gels at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel electrophoresis system</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>G6465</td>
			<td>E-Gel iBase and E-Gel Safe Imager combo kit for size-selecting ChIP-Seq libraries.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gel extraction kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28706</td>
			<td>Store all reagents at room temperature. Use 500 &#181;l of QG buffer per 100 mg of 2% agarose gel slice to extract DNA. Use MinElute columns (from MinElute PCR purification kit) to elute DNA twice.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HOMER (software)</td>
			<td>Chris Benner</td>
			<td>non-commercial</td>
			<td>http://homer.salk.edu/homer/index.html</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hybridization oven</td>
			<td>Techne</td>
			<td>FHB1D</td>
			<td>Hybridizer HB-1D</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IGV (software)</td>
			<td>Robinson et al.</td>
			<td>non-commercial</td>
			<td>http://www.broadinstitute.org/igv/home</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina CASAVA-1.8 quality filter (software)</td>
			<td>Assaf Gordon</td>
			<td>non-commercial</td>
			<td>http://cancan.cshl.edu/labmembers/gordon/fastq_illumina_filter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Java TreeView (software)</td>
			<td>Alok Saldanha</td>
			<td>non-commercial</td>
			<td>http://jtreeview.sourceforge.net</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory jack</td>
			<td>Edu-Lab</td>
			<td>CH0642</td>
			<td>This jack is used to elevate sample in sound enclosure for sonication.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ladder, 100 bp</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3231</td>
			<td>Keep 1x solution at room temperature. Store stock at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ladder, 1 kb</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>N3232</td>
			<td>Keep 1x solution at room temperature. Store stock at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-retention 1.5-ml microcentrifuge tubes</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM12450</td>
			<td>nonstick, RNase-free microfuge tubes, 1.5 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS2 (software)</td>
			<td>Tao Liu</td>
			<td>non-commercial</td>
			<td>https://github.com/taoliu/MACS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>11201D</td>
			<td>These Dynabeads are superparamagnetic beads with affinity purified polyclonal sheep anti-mouse IgG covalently bound to the bead surface. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>11203D</td>
			<td>These Dynabeads are superparamagnetic beads with affinity purified polyclonal sheep anti-rabbit IgG covalently bound to the bead surface. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>10001D</td>
			<td>These Dynabeads are superparamagnetic beads with recombinant protein A covalently bound to the bead surface. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic beads</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>10003D</td>
			<td>These Dynabeads are superparamagnetic beads with recombinant protein G covalently bound to the bead surface. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnetic rack</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>12321D</td>
			<td>DynaMag-2 magnet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MEME</td>
			<td>Bailey et al.</td>
			<td>non-commercial</td>
			<td>http://meme.nbcr.net/meme/</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Na3VO4</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P0758</td>
			<td>Sodium orthovanadate (100 mM) is a commonly used general inhibitor for protein phosphotyrosyl phosphatases. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaF</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P0759</td>
			<td>Sodium fluoride (500 mM) is commonly used as general inhibitor of phosphoseryl and phosphothreonyl phosphatases. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS machine</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-301-1301</td>
			<td>Genome Analyzer IIx</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NGS machine (high performance)</td>
			<td>Illumina</td>
			<td>SY-401-2501</td>
			<td>HiSeq</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal serum (antibody control)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2028</td>
			<td>Use as control for goat polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal serum (antibody control)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2025</td>
			<td>Use as control for mouse polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal serum (antibody control)</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-2027</td>
			<td>Use as control for rabbit polyclonal IgG antibodies in ChIP-qPCR experiments. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nucleic acid staining solution</td>
			<td>iNtRON</td>
			<td>21141</td>
			<td>Use RedSafe nucleic acid staining solution at 1:50,000. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orange G</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>O3756-25G</td>
			<td>1-Phenylazo-2-naphthol-6,8-disulfonic acid disodium salt. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>e.g., IDT or Sigma</td>
			<td>NA</td>
			<td>Primers to enrich adaptor-ligated DNA fragments by PCR: AATGATACGGCGACCACCGA*G and CAAGCAGAAGACGGCATACGA*G, phosphorothioate bond. Primers designed by Ethan Ford. Combine primers at 5 &#181;M each. Use 5 &#181;l in a 50 &#181;l PCR reaction. Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MinElute PCR purification kit&#160;</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>28006</td>
			<td>for purification of ChIP-qPCR and shearing test samples. Store MinElute spin columns at 4 &#176;C, all other buffers and collection tubes at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol:chloroform:isoamyl alcohol (25:24:1, pH 7.9)</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM9730</td>
			<td>Phenol:Chloroform:IAA (25:24:1) is premixed and supplied at pH 6.6. Use provided Tris alkaline buffer to raise pH to 7.9. Store at 4 &#176;C. CAUTION: phenol:chloroform:isoamyl alcohol is corrosive, highly toxic and combustible.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Primer3 (software)</td>
			<td>Steve Rozen &#38; Helen Skaletsky</td>
			<td>non-commercial</td>
			<td>http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11836170001</td>
			<td>cOmplete, Mini, EDTA-free. Use 1 tablet per 10 ml. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protease inhibitor tablets</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11873580001</td>
			<td>cOmplete, EDTA-free. Use 1 tablet per 50 ml. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>AM2548</td>
			<td>proteinase K solution (20 &#181;g/&#181;l). Store at -20 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNase A</td>
			<td>life technologies</td>
			<td>12091-039</td>
			<td>RNase A (20 &#181;g/&#181;l). Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotator</td>
			<td>Stuart</td>
			<td>SB3</td>
			<td>Rotator SB3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SAMtools (software)</td>
			<td>Li et al.</td>
			<td>non-commercial</td>
			<td>http://samtools.sourceforge.neta</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Solid phase reversible immobilisation beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A63882</td>
			<td>The Agencourt AMPure XP beads are used to minimise adaptor dimer contamination in ChIP-Seq libraries. Store at 4 &#176;C.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator 3000</td>
			<td>Misonix/Qsonica</td>
			<td>NA</td>
			<td>Newer models are now available. Q125, Q500 or Q700 are all suitable for shearing crosslinked chromatin.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sound enclosure</td>
			<td>Misonix/Qsonica</td>
			<td>NA</td>
			<td>optional: follow the manufacturer&#39;s recommendation to obtain the correct sound enclosure.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermomixer</td>
			<td>eppendorf</td>
			<td>22670000</td>
			<td>Thermomixer for 24 x 1.5 mL tubes. Precise temperature control from 4 &#176;C above room temperature to 99 &#176;C.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

genome-wide snapshot of chromatin regulators and states in xenopus embryos by chip-seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and organ formation during development. Determining the locations and levels of such chromatin features in vivo will provide valuable information about the spatio-temporal regulation of genomic elements, and will support aspirations to mimic embryonic tissue development in vitro. The most commonly used method for genome-wide and high-resolution profiling is chromatin immunoprecipitation followed by next-generation sequencing (ChIP-Seq). This protocol outlines how yolk-rich embryos such as those of the frog Xenopus can be processed for ChIP-Seq experiments, and it offers simple command lines for post-sequencing analysis. Because of the high efficiency with which the protocol extracts nuclei from formaldehyde-fixed tissue, the method allows easy upscaling to obtain enough ChIP material for genome-wide profiling. Our protocol has been used successfully to map various DNA-binding proteins such as transcription factors, signaling mediators, components of the transcription machinery, chromatin modifiers and post-translational histone modifications, and for this to be done at various stages of embryogenesis. Lastly, this protocol should be widely applicable to other model and non-model organisms as more and more genome assemblies become available.

תוצאות שווה ערך לאלו שהוצגו כאן צפויות אם הפרוטוקול מבוצע היטב והנוגדנים בשימוש הוא באיכות כיתה שבב (ראה דיון). פרוטוקול זה מאפשר מיצוי של גרעינים מעוברי Xenopus-קבוע פורמלדהיד וגז יעיל של הכרומטין ידי sonication (איור 1 א-ג). הכרומטין טעון תערוכות הפצת א-סימטרית של שברי DNA בעיקר נע בין 100 ל -1,000 נקודות בסיס והגיעו לשיא בין 300 ל -500 נ&quot;ב (איור 1 ג). 50 pg מינימאלי של DNA immunoprecipitated נדרש כדי להפוך את ספריית שבב Seq לזווג-סוף באינדקס עם מוסיף בגודל דומה DNA (איור 2 א) בהצלחה. הספרייה צריכה להיות נטול במידה רבה של הדימרים מתאם, אשר ניתן לראות על electropherogram בכ -120 נ&quot;ב. על הרצף-ידי-סינתזה, מראש מעובד-קורא ממופה הגנום (איור 2 ב, ג). בניסוי מוצלח עם <eמ &#39;&gt; X. עוברי tropicalis, בדרך כלל 50 עד 70% מאחת-הסוף קוראים של 40 נ&quot;ב יכולים להיות ממופים באופן ייחודי להרכבת הגנום של v7.1 עם שני חוסר התאמה מקסימאלי. בעוד קלט קורא ליישר די אחיד על פני הגנום, היישור של שבב קורא תוצאות במוספים לגדיל ספציפי כי האגף תכונת הכרומטין של עניין. זאת משום שכל שברים הם רצף מהקצה 5 &#39;(איור 2 ג) 25. הארכת היישור בקריאת כיוון לגודל שבר ממוצע מייצרת פרופילים מדויקים לתכונות הכרומטין בודדות כגון אירועים גורם שעתוק מחייבים. תפוסות DNA אלה מופיעים כפסגות כאשר דמיינו בIGV או כל דפדפן הגנום תואם אחר. מתקשרי שיא כמו MACS משמשים כדי לקבוע את המיקום של הפסגות הללו (איור 3 א). בדרך זו עשרות אלפי אתרי קישור נקבעה בX. tropicalis הגנום לגורמי שעתוק T-box כגון VegT 26. התנסות שבב qPCRמפעלים צריכים לאשר את ההעשרה המקומית שנמצאה על ידי שבב Seq (איור 3). ניסויי שבב Seq מאפשרים לחקור מאפייני הגנום של תכונות הכרומטין. לדוגמא, חישוב חלוקת הקריאה מעל אלמנטים הגנומי כגון תחילת שעתוק ואתרי סיום עשוי לסמן כל העדפות מרחבי מחייבות סביב גנים (איור 3 ג). באופן דומה, Heatmap של הפצות קריאה במקומות שיא משמשת להשוואת תכונות הכרומטין שונות בקנה מידת הגנום (איור 3D). גורמי שעתוק מסוימים להיקשר רצף במיוחד. ניתוח מוטיב DNA De novo של פסגות שבבסיס הדנ&quot;א הגנומי יכולים לאחזר מידע כוללים מוטיבים מועשרים שיתוף של שיתוף גורמים פוטנציאליים (איור 3E) מסוג זה. הרוב הגדול של גני המטרה להראות תפוסת DNA בנמוך ולא ברמה גבוהה יותר (איור 3F). נראה תכונה ללא קנה מידה זה להיות די נפוץ בקרב trהגורמים וanscription מצביעים על כך שרק חלק קטן של גני המטרה מוסדרים ישירות עם הרלוונטיות ביולוגיות 27,28. הניתוח של תנאים מועשרים GO או תכונות אחרות כגון ביטוי ההפרש של גני המטרה עשויה לחשוף עוד תובנות הפונקציה הביולוגית של תכונת הכרומטין בעובר Xenopus (איור 3G). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52535/52535fig1highres.jpg" /> איור 1. הליך immunoprecipitation הכרומטין לעוברי צפרדעים. עוברים () נמצאים בשלב ההתפתחותי של עניין לאגד קוולנטית (קישור צולב) כל חלבונים הקשורים להדנ&quot;א הגנומי-קבוע פורמלדהיד. על המיצוי גרעיני (B), הכרומטין הצולב מפוצל כדי לצמצם את הדנ&quot;א הגנומי מחייב או אתרי שינוי הכרומטין ידי מזעור DN האיגוףרצף (C). בהמשך לכך, שברי הכרומטין הם immunoprecipitated עם נוגדן כיתה שבב להעשיר אלה המכילים epitope של עניין (D). DNA-immunoprecipitated שיתוף הוא פשט את החלבון ומטוהר (E) לפני יצירת ספריית בר השבב לNGS (איור 2). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52535/52535fig2highres.jpg" /> איור 2. הכנת ספריית שבב Seq, רצף-ידי-סינתזה, מיפוי ושיחות שיא. (א) electropherogram מציג ספריית שבב Seq טובה עם תבניות DNA של 250-450 נקודות בסיס. תבניות אלה כרוכות להכניס DNA של העניין מוקף (נ&quot;ב 58) האוניברסלי ומתאם באינדקס (63 נ&quot;ב). (ב) </strong&gt; מיליוני אשכולות, עם כל אשכול המכיל תבניות זהות, הם בסיס רצף של בסיס בנוכחות כל ארבעת נוקלאוטידים בעלי fluorophore הפיך, מובחן ומאפייני סיום זהים. תמונות ניאון מעובדות בזמן אמת לקרוא בסיסים מקבילים, שסופו של דבר הם התאספו לקוראים. (C) קורא רק שהמפה ייחודית להגנום Xenopus נשמרות. כפי שכולם שברי רצף מהקצה &#39;5, המיפוי של שבב קורא תוצאות בפסגות גדיל ספציפי כי האגף תכונת הכרומטין של עניין. וכך, למתקשרים שיא לזהות את ההעשרה שמקורו בimmunoprecipitation ולהאריך את קורא לאורך קטע ממוצע למקם במדויק תכונות הכרומטין. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt = &quot;איור 3&quot; src = &quot;/ קבצים / ftp_upload / 52,535 / 52535fig3highres.jpg&quot; /&gt; איור 3. דוגמא של ניתוח שלאחר רצף-ונתונים להדמיה באמצעות גורם שעתוק T-תיבת zygotic VegT (zVegT). כל קריאת סעיפים המוצגים כאן הם מנורמלים 10 מ&#39;ייחודיים ממופה ולא מיותר קורא. () קטע של פרופיל הגנום של zVegT מחייב בX. עוברי gastrula tropicalis (שלב 11-12.5 לאחר Nieuwkoop וFaber 29). שיא כל, ערימה-מהוארך קורא, מייצג אתר אחד מחייב. פסגות אלה נקראות על ידי MACS2 עם שיעור גילוי שווא (FDR) של פחות מ -1%. כל גן mesp תערוכות zVegT מאוד הפרוקסימלי ובמעלה הזרם מחייב, אבל רק mespa וmespb באים לידי ביטוי בשלב זה (נתוני RNA-Seq 30). (ב) רמות תפוסת DNA של zVegT כפי שנקבעו על ידי שבב qPCR בכמה לוקוסים (כולל לא confi אזור -bound 0.5 kb במעלה הזרם של -actin β)RM ההעשרה הספציפית שנמצאה על ידי שבב Seq. להשוות את התוצאות לmespa עם שיא נקרא (פס אדום) ב (א). רמת תפוסת DNA היא מדמיין כאחוז מקלט עבור שניהם, השבב עם נוגדן VegT (ארנב polyclonal של אלוטיפ IgG) והשבב עם שליטת הנוגדנים (IgG ארנב הרגיל). ברים שגיאה משקפים את סטיית התקן של שני משכפל ביולוגי. (C) Metagene ניתוח מראה zVegT המועדף המחייב (תגים זרקו לפח מעל 25 נ&quot;ב) לאמרגן ביחס לכל אזור גנומי אחר סביב ובתוך גופי גן. (ד) Heatmap תערוכות k-ממוצע רמות (k = 5) תפוסת DNA התקבצו (תגים זרקו לפח מעל 25 נ&quot;ב) של (נתונים שבב Seq 31) zVegT וSmad2 / Smad3 ביחס לכל האזורים מחויבים-zVegT בשלב gastrula. Heatmap היא להיכנס 2 מבוססים ומרוכז בשעה 5 תגים לנ&quot;ב. (E) De novo ניתוח המוטיב מגלה גורם שעתוק הקנונית T-התיבה מחייב מוטיב ב -38% מzVegT-אזורים מחויבים אם ציון המוטיב הבסיסי הוא מנורמל לשיעור גילוי של 5% ברצפי רקע. מפת צפיפות תערוכות ההעשרה הגבוהה ביותר למוטיב T-התיבה במרכז אתרי קישור zVegT, ואילו מוטיב Smad2 / Smad3 מחייב הקנונית כמעט ואינו מועשר. (F) היסטוגרמה מראה רמות תפוסת DNA של zVegT, אשר מחושבות עבור כל גן היעד מכל הפסגות (+/- 200 נ&quot;ב) בין 5 kb במעלה הזרם [-]. ו[ +] 1 kb במורד הזרם של מקביל אתרי תחילת שעתוק (G) 300 גנים למעלה עם הרמות הגבוהות ביותר תפוסת DNA בתוך -5 קילו ו+1 kb הם מועשר לתהליכים ביולוגיים של התפתחות עוברית המוקדמת. אלה GO מונחים עולים בקנה אחד עם התפקוד המשוער של zVegT. FDR מבוסס על בדיקה המדויקת של פישר שני זנב ותיקן לבדיקה מרובה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52535/52535fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq at JoVE.com

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

השאלה כיצד הכרומטין רגולטורים ומדינות הכרומטין משפיעה על הגנום in vivo הוא מפתח להבנה של איך מוקדם החלטות גורל התא נעשות בעובר המתפתח שלנו. שבב Seq-הגישה הפופולרית ביותר לחקור תכונות הכרומטין ברמה-הוא גלובלית המפורטים כאן לעוברי צפרדעים.

Snapshot הגנום של רגולטורי הכרומטין והברית ב<em&gt; Xenopus</em&gt; עוברים על ידי שבב Seq

The recruitment of chromatin regulators and the assignment of chromatin states to specific genomic loci are pivotal to cell fate decisions and tissue and ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Genome-wide Snapshot of Chromatin Regulators and States in Xenopus Embryos by ChIP-Seq

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

Manipulation and In Vitro Maturation of Xenopus laevis Oocytes, Followed by Intracytoplasmic Sperm Injection, to Study Embryonic Development

ומניפולציה<em&gt; במבחנה</em&gt; ההבשלה של<em&gt; Laevis Xenopus</em&gt; ביציות, ואחריו הזרקת Intracytoplasmic זרע, לחקר התפתחות העוברית

Amphibian eggs have been widely used to study embryonic development. Early embryonic development is driven by maternally stored factors accumulated during ...

Accurate and Phenol Free DNA Sexing of Day 30 Porcine Embryos by PCR

חינם מדויק פנול DNA זיהוי מין של יום 30 חזירים העוברים על ידי PCR

Research into prenatal programming in the pig has shown that the sex of the developing embryo or fetus can influence the developmental outcome. Therefore, ...

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

Technique to Target Microinjection to the Developing Xenopus Kidney

טכניקה לכוון Microinjection אל פיתוח<em&gt; Xenopus</em&gt; כליה

The embryonic kidney of Xenopus&#160;laevis (frog), the pronephros, consists of a single nephron, and can be used as a model for kidney disease. Xenopus ...

Generation of Parabiotic Zebrafish Embryos by Surgical Fusion of Developing Blastulae

הדור של Parabiotic דג הזברה עוברים ידי Fusion כירורגי של פיתוח Blastulae

Surgical parabiosis of two animals of different genetic backgrounds creates a unique scenario to study cell-intrinsic versus cell-extrinsic roles for ...

Biosensing Motor Neuron Membrane Potential in Live Zebrafish Embryos

Biosensing מוטורית נוירון פוטנציאל ממברנה עוברי דג הזברה חיים

The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

אינדוקציה של היפוקסיה צפרדע חיה דג הזברה עוברי

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

CARIP-Seq and ChIP-Seq: Methods to Identify Chromatin-Associated RNAs and Protein-DNA Interactions in Embryonic Stem Cells

CARIP-Seq ו שבב-Seq: שיטות לזיהוי RNAs הקשורים כרומטין והן אינטראקציות חלבון-DNA בתאי גזע עובריים

Embryonic stem (ES) cell self-renewal&#160;and differentiation is governed by extrinsic signals and intrinsic networks of transcription factors, ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

להמחיש את צומת ואת צלחת Notochordal Gastrulating עוברי העכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה כל הר Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

הזרקת דנ א לתוך eyebuds ב xenopus זריזה העוברים והדמיה של gfp המבטא האופטי axonal הביע בשלמותו, חי xenopus tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...