Name: probe-based real-time pcr approaches for quantitative measurement of micrornas
Uploaded: 2015-04-14T15:00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs at JoVE.com

تعترف جميع المؤلفين دعم البنية التحتية من NHMRC CTC، جامعة سيدني، ومؤسسة أبحاث السكري الأحداث (JDRF)، وأستراليا، ومؤسسة كوبر ريبيكا واستراليا. وقد تم تمويل هذا البحث من خلال المنح المقدمة من المجلس الأسترالي للبحوث (FT110100254) وJDRF، أستراليا (CRN201314) إلى آآآه WW، RJF وحملت MVJ من كل التجارب المخبرية الرطب، قامت ASJ من تحليل البيانات. كتب WW المسودة الأولى. آآآه التخطيط لدراسة وتحليل البيانات. جميع المؤلفين قراءة واتفقت على الصيغة النهائية للمخطوطة والأرقام وأوراق العمل المقدمة للنشر.

<ol>
	<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+animal+microRNAs.">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li><li>Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+functions+in+animal+development+and+human+disease.">MicroRNA functions in animal development and human disease.</a> Development. 132, 4653-4662 (2005).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li><li>Joglekar, M. V., Wei, C., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+estimation+of+multiple+miRNAs+and+mRNAs+from+a+single+cell.">Quantitative estimation of multiple miRNAs and mRNAs from a single cell.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, pdb prot5478 (2010).</li><li>Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet-specific+microRNAs+in+pancreas+development,+regeneration+and+diabetes.">Islet-specific microRNAs in pancreas development, regeneration and diabetes.</a> Indian J Exp Biol. 49, 401-408 (2011).</li><li>Farr, R. J., Joglekar, M. V., Taylor, C. J., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+non-coding+RNAs+as+biomarkers+of+beta+cell+death+in+diabetes.">Circulating non-coding RNAs as biomarkers of beta cell death in diabetes.</a> Pediatr Endocrinol Rev. 11, 14-20 (2013).</li><li>Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+islet-specific+microRNAs+during+human+pancreatic+development.">Expression of islet-specific microRNAs during human pancreatic development.</a> Gene Expr Patterns. 9, 109-113 (2009).</li><li>Iorio, M. V., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+in+ovarian+cancer.">MicroRNA profiling in ovarian cancer.</a> Methods Mol Biol. 1049, 187-197 (2013).</li><li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection.">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 10513-10518 (2008).</li><li>Mattie, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+high-throughput+microRNA+expression+profiling+provides+novel+biomarker+assessment+of+clinical+prostate+and+breast+cancer+biopsies.">Optimized high-throughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies.</a> Mol Cancer. 5, 24 (2006).</li><li>Zhu, W., Qin, W., Atasoy, U., Sauter, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+breast+cancer+and+healthy+subjects.">Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects.</a> BMC Res Notes. 2, 89 (2009).</li><li>Zhu, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+suitable+reference+genes+for+qRT-PCR+analysis+of+circulating+microRNAs+in+hepatitis+B+virus-infected+patients.">Identification of suitable reference genes for qRT-PCR analysis of circulating microRNAs in hepatitis B virus-infected patients.</a> Mol Biotechnol. 50, 49-56 (2012).</li><li>Yamada, H., Itoh, M., Hiratsuka, I., Hashimoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+autoimmune+thyroid+diseases.">Circulating microRNAs in autoimmune thyroid diseases.</a> Clin Endocrinol (Oxf). , (2014).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+MicroRNA+Expression+Profile+as+a+Biomarker+in+the+Diagnosis+and+Prognosis+of+Pancreatic+Cancer.">Serum MicroRNA Expression Profile as a Biomarker in the Diagnosis and Prognosis of Pancreatic Cancer.</a> Clinical Chemistry. 58, 610-618 (2012).</li><li>Gilad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+microRNAs+are+promising+novel+biomarkers.">Serum microRNAs are promising novel biomarkers.</a> PLoS One. 3, e3148 (2008).</li><li>Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Mehta, S., Bhonde, R. R., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+of+developing+and+regenerating+pancreas+reveal+post-transcriptional+regulation+of+neurogenin3.">MicroRNA profiling of developing and regenerating pancreas reveal post-transcriptional regulation of neurogenin3.</a> Dev Biol. 311, 603-612 (2007).</li><li>Hardikar, A. A., Farr, R. J., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs:+understanding+the+limits+for+quantitative+measurement+by+real-time+PCR.">Circulating microRNAs: understanding the limits for quantitative measurement by real-time PCR.</a> J Am Heart Assoc. 3, e000792 (2014).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+and+Prognostic+Implications+of+a+Serum+miRNA+Panel+in+Oesophageal+Squamous+Cell+Carcinoma.">Diagnostic and Prognostic Implications of a Serum miRNA Panel in Oesophageal Squamous Cell Carcinoma.</a> PLoS One. 9, e92292 (2014).</li><li>McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+microRNA+profiling+of+exosomes+derived+from+blood+and+culture+media.">Purification and microRNA profiling of exosomes derived from blood and culture media.</a> J Vis Exp. , e50294 (2013).</li><li>Joglekar, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-30+family+microRNAs+confer+epithelial+phenotype+to+human+pancreatic+cells.">The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells.</a> Islets. 1, 137-147 (2009).</li><li>Genda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA+changes+in+the+dorsal+horn+of+the+spinal+cord+of+rats+with+chronic+constriction+injury:+A+TaqMan(R)+Low+Density+Array+study.">microRNA changes in the dorsal horn of the spinal cord of rats with chronic constriction injury: A TaqMan(R) Low Density Array study.</a> Int J Mol Med. 31, 129-137 (2013).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+three+microRNA+profiling+platforms:+microarray,+beads+array,+and+quantitative+real-time+PCR+array.">Systematic evaluation of three microRNA profiling platforms: microarray, beads array, and quantitative real-time PCR array.</a> PLoS One. 6, e17167 (2011).</li><li>Cuk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+plasma+as+early+detection+markers+for+breast+cancer.">Circulating microRNAs in plasma as early detection markers for breast cancer.</a> Int J Cancer. 132, 1602-1612 (2013).</li><li>Morrison, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+high+throughput+quantitative+PCR.">Nanoliter high throughput quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 34, e123 (2006).</li><li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+microarray+profiling,+real-time+PCR,+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression.">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16, 991-1006 (2010).</li><li>Benes, V., Castoldi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+of+microRNA+using+real-time+quantitative+PCR,+how+to+use+it+and+what+is+available.">Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available.</a> Methods. 50, 244-249 (2010).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR.">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).</li><li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA.">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44, 31-38 (2008).</li><li>Kodani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+TaqMan+low-density+arrays+for+simultaneous+detection+of+multiple+respiratory+pathogens.">Application of TaqMan low-density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens.</a> J Clin Microbiol. 49, 2175-2182 (2011).</li><li>Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereirae Cotta, ., V, M., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+measurement+of+noncoding+RNA+in+human+serum.">A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum.</a> Exp Diabetes Res. 2012, 168368 (2012).</li><li>Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+extracellular+circulating+microRNA.">Characterization of extracellular circulating microRNA.</a> Nucleic Acids Res. 39, 7223-7233 (2011).</li><li>Li, Y., Kowdley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples.">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal Biochem. 431, 69-75 (2012).</li></ol>

تمت تغطية تكاليف تجهيز المادة / نشر بواسطة تقنيات الحياة، بعد قبول هذه المخطوطة للنشر.

الخطوات الحاسمة ضمن بروتوكولات QPCR القائم على التحقيق للحصول على نتائج دقيقة وقابلة للتكرار هي للتأكد 1) يتم تحميل نفس حجم وتركيز RT-المنتج في كل رد فعل QPCR، 2) النسب والأحجام الصحيحة للمكونات اللازمة ل تعد رد فعل QPCR ومختلطة جيدا، و3) يتم إضافة كميات صحيحة وثابتة على كل رد فعل QPCR، و4) الانتهاء من إعداد وتحميل كل عينة ورد فعل المزيج في اقصر وقت ممكن، في حين لا تزال تضع في اعتبارها الخطوات الحاسمة المذكورة أعلاه في وقت سابق. بطاقات مجموعة على microfluidics تحتاج الطرد المركزي مناسبة والدلاء محددة. كل دلو يمكن أن تعقد ما يصل إلى 3 بطاقات (تحميل / فارغ). تأكد دائما أن جميع فتحات 3 من دلو واحتل ومتوازن دلو من خلال وضع دلو مماثل (وينبغي أن تتضمن هذه دلو أيضا 3 بطاقات، إما فارغة أو كاملة) في فتحة نقيض من أجهزة الطرد المركزي. في حين وضع البطاقة في دلور حامل، تأكد من أن 8 خزانات تتوقع صعودا ويواجه آبار رد فعل الجدار الخارجي للطرد المركزي. تدور البطاقات في 331 x ج لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد أول تدور، فتح الطرد المركزي وضمان بصريا تم الاستغناء عن مزيج التفاعل من خلال الآبار 384. كرر تدور في نفس الإعدادات ل1 المزيد من الوقت. إزالة البطاقة من دلو والتأكد من أن مستوى مزيج رد فعل في كل من 8 خزانات غير موحد. أي تضارب في حجم السائل اليسار في الخزانات تجعل البطاقة غير مناسب لمواصلة استخدامها. لدينا نفس التركيز من RT-المنتج، يضاف نفس التركيز المدخلات من الحمض النووي الريبي في كل رد فعل RT. يتم قياس التركيز الكلي RNA باستخدام volumespectrophotometer الدقيقة. لاحظ نسبة 260/280 يمكن أن تكون منخفضة مثل 1.3 لRNA معزولة عن بلازما / مصل. هذا لا يبدو أن يكون لها تأثير على عملية المصب المتعلقة QPCR أو البيانات ولدت 30. وبالمثل، فإن نسبة 260/280 منكانت عينات الحمض النووي الريبي اختبارها هنا بين 1.3-1.7 مع أي آثار غير طبيعية في QPCR ملاحظتها. عند استخدام عينات منخفضة المحتوى RNA، مثل تلك التي من biofluids، قد يكون من الصعب تحديد RNA قبل المعالجة. ونحن نوصي استخدام الاصطناعية ارتفاع في في عزل الحمض النووي الريبي وكذلك المراحل النسخ العكسي. في تجربتنا، والمرشحين نبات الأرابيدوبسيس thaliana ميرنا (ATH-مير 159a وATH-مير 172a) ويفضل على انواع معينة ايليجانس miRNAs (مثل سل-مير-39 أو سل-مير-54) التي في تجربتنا قد يكون أعلى، التماثل من تلك التي من A. thaliana. استخدام هذا الارتفاع في مرحلة معينة يمكن حساب لتطبيع البيانات ميرنا عبر عينات متعددة يعاير في أوقات مختلفة. باستخدام حجم المدخلات الثابتة من الحمض النووي الريبي لرد فعل التوليف [كدنا] ويوصى أيضا 32،33. ووصفت البروتوكولات القائمة على التحقيق الثلاثة لميرنا الكمي هنا تتطلب كميات متفاوتةمن إجمالي المدخلات RNA، سير العمل وتكاليف مختلفة. تم تصميم كل من سير العمل لتلبية احتياجات الانتاجية المختلفة استنادا إلى عدد من الأهداف ميرنا وعدد من العينات لتحليلها. مع زيادة الإنتاجية (96 rxn 384 rxn 3072 rxn)، والتكلفة لكل رد فعل تتناقص مع زيادة في كمية البيانات التي تم الحصول عليها خلال وحدة الزمن. بما أن جميع هذه المنصات الاستفادة الكيمياء TAQMAN، ونوعية البيانات التي تم الحصول عليها يمكن أن يتوقع أن تكون مشابهة. TAQMAN QPCR هي طريقة راسخة للتعرف على وفرة من miRNAs في عينات المصل / البلازما 9،11،27. على الرغم من أن المنابر الثلاثة التي نوقشت هنا يشتركان فى نفس والكيمياء، وانخفاض في حجم رد الفعل يؤدي إلى انخفاض في النطاق الديناميكي للكشف عن نسخة (فار RJ آخرون، بيانات غير منشورة). منصة 96-جيدا QPCR هو الإنتاجية أقل، ولكن منصة حساسية عالية ورأينا أن &quot;المعيار الذهبي&quot; للجميع (أو صبغ أساس) القائم على التحقيق منصات PCR. ومع ذلك، وهذا قدلن تكون منصة الأكثر اقتصادا أو كفاءة إذا كان يتم يعاير عدة مئات أو آلاف من العينات وعن الرنا الميكروية متعددة. على microfluidics (TLDA) وعلم الموائع النانوي (OA) منصات هي منصات عالية الإنتاجية / المحتوى صممت للسماح الحصول على بيانات أكبر في وقت أقصر. على الرغم من أن لوحظت اختلافات دفعة في بطاقات TLDA، وهذا يمكن أن يكون الحد الأدنى عن طريق طلب بطاقات TLDA من نفس الدفعة. ونلاحظ أن منصة TLDA (الشكل 3) أظهرت تفاوت كبير في 17٪ من منتصف - miRNAs فرة منخفضة عند اختبارها باستخدام نفس العينة على دفعات مختلفة من بطاقات TLDA. ولذلك نوصي باستخدام الأرقام دفعة نفس لتحليلها باستخدام بطاقات TLDA. يمكن أن يكون هذا الاختلاف أيضا يرجع إلى التباين الفني بما في ذلك أي التحميل وpipetting لأخطاء محتملة. ومع ذلك، فإننا نوصي أمر / طلب نفس دفعة من بطاقات TLDA. وقد لوحظ عدم وجود اختلاف دفعة كبير على منصة OA. على الرغم من هذا، TAQMAN التجربه مقرهانهج التل QPCR العرض سهولة لقياس وفرة miRNAs في عينات البلازما / المصل. النهج الإنتاجية المنخفضة والمتوسطة والعالية مناقشتها هنا توفر المرونة لتحليل مجموعة من العينات وmiRNAs باستخدام كفاءة عالية، قابلة للتكرار ونظيفة (انخفاض الضوضاء في الخلفية) الكيمياء.

الرنا الميكروية (miRNAs) هي ~ 22 النوكليوتيدات غير الترميز (نورث كارولاينا) الرنا، كما تعمل الجهات التنظيمية في التعبير الجيني 1-3. معظم miRNAs في الحيوانات وظيفة من خلال تسلسل محدد قاعدة الاقتران مع مرنا، واستهداف &quot;UTR 3، مما يؤدي إلى تنظيم السلبي للالتعبير الجيني 2-4. هذا يحدث عادة عن طريق تثبيط الترجمة مرنا أو عن طريق الريباسي الانزال. وقد ثبت miRNAs في التداول أن تكون المؤشرات الحيوية الجديدة في مجال البحوث والمجالات السريرية لمجموعة متنوعة من الأمراض، مثل السكري 5-7 والمبيض 8، 9 البروستاتا وسرطان الثدي 10،11، والتهاب الكبد B 12 و أمراض المناعة الذاتية الأخرى 13. وقد أجريت الأبحاث لتحديد miRNAs وفرة في الخلايا أو الأنسجة المختلفة، وكذلك في الدورة الدموية من البلازما البشرية وعينات مصل الدم، والتي هي أكثر يسرا وأقل تغلغلا 9،11-15. وكانت وسائل مختلفة من ميرنا الكمي هأقاموا باستخدام منصات متعددة، مثل منصة لوحة معيار 96-جيدا 4،12،16-18، ومنصة بطاقة على microfluidics 12،18-23 ومنصة علم الموائع النانوي مجموعة 17،24. الكمي في الوقت الحقيقي PCR (QPCR) يوفر القدرة على قياس الأعداد النسبية أو المطلقة من النصوص باستخدام متعددة (dye- أو القائم على التحقيق) كيمياء. يستند التحقيق في الوقت الحقيقي PCR الكيمياء يقدم فائدة منخفضة مضان الخلفية وحساسية عالية للكشف عن نسخة نسخة واحدة. ومن نسبيا فعالة من حيث التكلفة، وسهلة الاستخدام وقابلة للتكرار للغاية، مما يجعل الطريقة المفضلة لقياس وتحديد ميرنا التعبير 25. طريقة QPCR يستند التحقيق-ينطوي عموما خطوتين: النسخ (RT) وQPCR 4،26،27 عكس. RT هو المكان الذي تهجين التمهيدي الجذعية حلقة RT إلى ناضجة أو الأساسي جزيء ميرنا وتحويلها إلى مكمل (ج) DNA. يتم بعد ذلك إجراء تقدير حجم المنتج [كدنا خارج باستخدام بادئات PCR ميرنا محددة26-28. ويستند مبدأ QPCR يستند التحقيق على الكشف عن تمديد حبلا التكميلية في الوقت الحقيقي، والذي ينطوي على التحلل من التحقيق fluorescently الموسومة. وتهدف هذه المجسات لاحتواء مراسل الفلورسنت وفاكهه تقضي التي هي مجرد بصرف النظر للسماح الحنق (نقل الإسفار الرنين الطاقة). وملثمين الكشف عن الانبعاثات من مراسل مضان (باعث) من قبل مقربة من جزيء فاكهه تقضي. عندما طق بوليميريز (بول) يمتد من التمهيدي المنبع ويصل شوكة (5 &#39;نهاية التحقيق)، وطق النشاط بول نوكلياز خارجية مائيا التحقيق، مما يؤدي إلى التفكك المادي / فصل باعث الفلورسنت من فاكهه تقضي. يتم تسجيل هذا الإصدار من جزيء واحد من مضان باعث بواسطة كاشف وعرضها على أنها الزيادة التدريجية في إشارة مضان من ذلك جيدا / رد فعل. الزيادة في مضان يتناسب مع كمية من الناتج PCR ولدت، السماح لتشو دقيقةantification من 26،28 الهدف تضخيم. مع تزايد الطلب في ميرنا الكمي، وقد وضعت المتوسطة على التكنولوجيات الإنتاجية العالية للسماح لعدد أكبر من العينات التي سيتم تجهيزها في فترة قصيرة من الزمن. TAQMAN منخفض الكثافة صفيف (TLDA) هو المتوسطة الإنتاجية تصميم ميكروفلويديك مبتكرة على أساس القائمة على التحقيق QPCR الكيمياء تقدم زيادة في عدد miRNAs تحليلها على لوحة واحدة. TLDA تنطوي على استخدام بركة معرفة مسبقا من RT-الاشعال التي تستخدم لتجميع كدنا]. ثم يتم نسج هذه cDNAs إلى 384 بطاقة جيدا الصغرى الموائعية مخصصة لتحديد التعبير عن miRNAs متعددة باستخدام QPCR 22،26،29. كل بئر من بطاقة يحتوي الاشعال وتحقيقات المجففة لتضخيم ميرنا معين (ق)، وبالتالي تصل إلى 384 ردود الفعل يمكن معالجتها في بطاقة TLDA واحد 26. مجموعة علم الموائع النانوي هي عبارة عن منصة عالية الإنتاجية التي يتم استخدامها للكشف عن النصوص الجين <sup&gt; 24 باستخدام نفس الكيمياء القائم على التحقيق. فإنه يستخدم مصفوفة الملكية تقدم التفاعلات مسعور-محبة للماء لتسهيل تحميل السهل لل33 نانولتر خليط التفاعل في صفيف من 3072 من خلال الثقوب على شريحة الفولاذ المقاوم للصدأ 24. تركز هذه المقالة على إظهار كيف يتم تنفيذ هذه الأساليب لقياس miRNAs في المصل / البلازما والعوامل الحاسمة التي يجب مراعاتها عند تنفيذ وتفسير هذه البيانات. المتخذة لالاعتبار، وسيتم مناقشة فوائدها الفردية والقيود في هذه المقالة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well-platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Assays INV SM&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4427975</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 
			The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4366597 or 4366596</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 
			The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For qPCR run on a 96-well platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4367846</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 
			The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on&#160; the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4346907</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics platform (TLDA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399966</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444281</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>OR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444750</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 
			The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4391128 or 4488593</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 
			The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444303</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399233</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE Buffer (100 mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12090-015</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product 
			The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444913</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofluidics platform (OpenArray)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel)</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4470187</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4469576</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray 384-well Sample Plates&#160;&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4406947</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4462159</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray AccuFill System Tips&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4457246</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129117</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probe-based real-time pcr approaches for quantitative measurement of micrornas

يستند التحقيق-PCR الكمي (QPCR) هو وسيلة مفضلة للقياس وفرة النص، لأنها هي واحدة من طرق الكشف الأكثر حساسية أن يقدم تحليلا دقيقا وقابلة للتكرار. الكيمياء يستند التحقيق، ويقدم أقل مضان الخلفية بالمقارنة مع غيرها كيمياء (على صبغ). في الوقت الحاضر، هناك العديد من المنابر المتاحة أن الكيمياء أساس تحقيق الاستخدام ل quantitate فرة النص. QPCR في 96 لوحة جيدا هو الأكثر استخداما بشكل روتيني طريقة، ولكن فقط كحد أقصى من 96 عينات أو miRNAs يمكن اختبارها في تشغيل واحد. هذا هو وقتا طويلا ومملا إذا كان عدد كبير من العينات / miRNAs هي لتحليلها. عالية الإنتاجية المنصات المرتكزة إلى تحقيق مثل على microfluidics (على سبيل المثال TAQMAN بطاقة صفيف) والمصفوفات علم الموائع النانوي (على سبيل المثال OpenArray) عرض سهولة بتكاثر وكفاءة للكشف عن وفرة من microRNAs متعددة في عدد كبير من العينات في وقت قصير. هنا، ونحن لشرح إعداد التجريبيالثانية بروتوكول لميرنا الكميات من المصل أو عينات البلازما EDTA، وذلك باستخدام الكيمياء القائم على التحقيق وثلاث منصات مختلفة (96 لوحة جيدا، على microfluidics والمصفوفات علم الموائع النانوي) تقدم مستويات متزايدة من الإنتاجية.

حجم الموصى بها لمقايسة على أساس التحقيق ميرنا QPCR التفاعل 20 ميكرولتر. ملاحظة: لقد أكدنا أن حجم رد الفعل من 5 ميكرولتر قادر على تحقيق نتائج مماثلة لتلك التي تحققت باستخدام 20 ميكرولتر حجم 4،7،30. خفض حجم رد الفعل إلى 5 ميكرولتر يسمح لانخفاض 75٪ في تكاليف كاشف دون خسارة ملموسة في الحساسية. كما وردت في الشكل 2، حجم رد فعل 20 ميكرولتر و 5 ميكرولتر تظهر وجود علاقة قوية حتى 39 دورات (مع ص 2 من 0.92، P = 0.0002). وتقدم مجموعة على microfluidics أداة للحصول على بيانات عن 754 miRNAs أعرب في عينة في حوالي 5 ساعات (للحصول على بطاقة ألف وبطاقة B)، والذي هو وسيلة أكثر كفاءة لتحليل عينات متعددة بالمقارنة مع التقليدية 96 تقارير إتمام المشروعات لوحة جيدا. قارنا ميرنا بطاقات مجموعة على microfluidics لنفس العينة (عينة ألف وعينة تكرار) الشكل 3A - B يظهر مؤامرة بلاند-التمان (&lt;قوي&gt; 3A) ومؤامرة الارتباط (3B) لجميع miRNAs 754 اختبار هذه العينات. هناك 3 miRNAs التحكم المختلفة (U6، RNU44 وRNU48) وضعت بشكل عشوائي على كل من بطاقات (بطاقة ألف وباء) في مواقع متعددة. عند مقارنة عتبة دورة U6 (ط) القيم بين أشواط 2، ونحن لم نلاحظ اختلافات كبيرة بين القيم (الجدول 4). ومن المهم أيضا أن نلاحظ هنا أن يتم التعبير عن U6 في أكبر وفرة (انخفاض قيمة ط م) في العينة التي تم تقييمها. نحن ثم مقارنة كل miRNAs التي تحتوي على قيم ط م بين 0-19،99 في كل من أشواط (ن = 150)، والتي كان التعبير مماثل من miRNAs عموما مع المشارك الفعال في تقرير من 98٪ (الشكل 3C-D). جميع 277 miRNAs التي تحتوي على قيم ط م بين 20 و 29.99 في كل من يدير، اختلف 16 ميرس كبيرا بين أشواط الأصلية وتكرار (الشكل 3E - F) عدد من miRNAs مع اختلاف كبير بين:.ن تشغيل زادت (89 من 327) عندما تم اختيار القيم ط بين 30-40 لكل من يعمل (الشكل 3G - H). وتوفر منصة علم الموائع النانوي مجموعة البيانات عن 754 miRNAs من كل عينة المصل / البلازما اختبارها، والمتمثلة في الشكل 4A ومن المهم دراسة هذه المنحنيات التضخيم - كما هو الحال مع جميع QPCR - لضمان أن تكون النتيجة هي تدل على التضخيم صحيح. يحتوي كل من 48 subarrays (الشكل 1) أيضا فحص ل &quot;التدبير المنزلي&quot; ncRNAs الأكثر شعبية الثلاثة:. U6، RNU44 وRNU48 الشكل 4B يوضح تجميع نموذجية من U6 يتطابق من عينة واحدة. تعرض هذه مكررات منخفضة الانحراف المعياري (SD &lt;0.5) وهلم هي مؤشر على الاعتمادية. بدلا من ذلك، الشكل 4C يدل على التباين المتزايد للمكررات U6 (SD&gt; 0.5) في العينة الثانية. هذا لا ينفي صحة سو المقايسات المتبقية، على الرغم من أنه لا يتطلب نقد أكثر شمولا. U6، كما هو الحال مع معظم miRNAs &quot;التدبير المنزلي&quot; في السوائل البيولوجية، يمكن أن يكون تعبيرا متغير. وتجدر الإشارة إلى أن واحدة من العينات، والموضحة في الشكل 4C، يعرض 4 أضعاف أقل محتوى من U6 التي قدمت في الشكل 4B. إذ أن مستوى U6 في العينة المعروضة في 4C هو 75٪ أقل لتبدأ من واحد قدم في لوحة 4B، ومن المتوقع بسبب توزيع بواسون من النصوص، التي تزداد تفاقما بسبب حجم رد الفعل صغير 17 تقلب الفني أكبر. أداة أخرى مفيدة وهي مراقبة الجودة (QC) صور، المتاحة للتصدير مرة واحدة اكتمال التشغيل. مجموعة مختارة من هذه تستخدم مضان من ROX، الصبغة السلبي وجدت في كاشف مزيج QPCR، للتأكد من أن كل من خلال حفرة تم تحميل (الشكل 5) بشكل صحيح. A-حفرة من خلال، أو في الواقع EN<html> subarray الإطارات، قد لا يتم تحميل بسبب عدم كفاية حجم العينة، التبخر، فقاعات موجودة في آبار من لوحة عينة 384 أيضا، فشل تماما لإزالة ختم لوحة عينة، أو عيوب في إطار منظومة Accufill أو نصائح به. أي تفريغ يجب تحديدها من خلال ثقوب لتجنب miRNAs وضع العلامات على أنها &quot;غير قابلة للكشف&quot;، بينما في الحقيقة الفحص تم تحميل أبدا. إذا واجهت هذه المشكلة، تأكد من أن لا يقل عن 5 ميكرولتر من عينة / mastermix يتم تحميل في كل بئر من لوحة عينة 384 أيضا، يتم طرد لوحة عينة بشكل صحيح قبل التحميل، وختم احباط هو إزالتها تماما، وOpenArray تحميل مختومة الشرائح وتشغيلها ضمن الوقت المخصص لجميع أشواط متتالية. إذا القضايا تحميل لا تزال قائمة، وهذه قد تكون أكثر عرضة المتعلقة دفعة محددة أو الكثير من صفائف أو المواد الاستهلاكية ذات الصلة ومزيد من المساعدة ينبغي السعي من خلال الشركة المصنعة. &quot;SRC =&quot; / الملفات / ftp_upload / 52586 / 52586fig1.jpg &quot;/&gt; الشكل 1: التخطيط من العينات لصفيف سير العمل علم الموائع النانوي: (A) كل لوحة عينة 384 بشكل جيد يمكن أن تعقد عينات لمدة تصل إلى 8 صفائف علم الموائع النانوي. (B) المخففة، يتم وضع تضخيم ما قبل [كدنا إلى 8 آبار (2 الأعمدة بنسبة 4 صفوف)، حمام سباحة للوبركة B في مجموعات 8 جيدا المجاورة. كل دائرة تمثل بئر واحدة. (C) كل بئر من لوحة عينة سيتم تحميلها في subarray واحدة من مجموعة علم الموائع النانوي. ويمثل كل مربع صغير subarray واحد. <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig2.jpg" /> الشكل 2: تحليل المشارك بالنسبة للالتقليدية 96-جيدا منصات PCR: شارك في العلاقة بين 20 ميكرولتر و 5 مجلدات ميكرولتر رد فعل على TAQMAN في الوقت الحقيقي QPCR باستخدام منصة لوحة معيار 96-جيدا في القيم CT (39 دورات). قارنا 4 الرنا الميكروية مختلفة (مير-375، مير 30C، 30D مير ومير-7) في 4 المصل والبلازما العينات البشرية المختلفة. يتم رسم نقاط البيانات فقط 11 منذ كان الآخرون لا يمكن الكشف عنها. R 2 = 0.92، ع = 0.0002. <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig3.jpg" /> . الشكل (3): تداول ميرنا التنميط باستخدام بطاقات على microfluidics مجموعة عن طريق بطاقات 2 على microfluidics (بطاقة-A وبطاقة-B)، يتم إنشاء الملف الشخصى 754 miRNAs (A - B). كما هو موضح هنا، استخدمنا نفس العينة لمدة 2 على microfluidics مجموعة تدير للتحقق استنساخ نتائج بطاقة على microfluidics. لاحظنا تعبير مماثل من miRNAs عموما، مع القيم ط بين 0 حتي 19،99 (C - D). هناك عدد قليل من miRNAs (16 من 277) مع القيم ط بين 20 حتي 29،99 وهامة الاختلافات بين تكرار أشواط (E - F). تسعة وثمانون من 327الرنا الميكروية مع القيم ط أعلى (30-40) أظهرت اختلافات كبيرة بين كل من أشواط (G - H). &#160; ويتم تحليل البيانات باستخدام تقرن اختبار T. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig4.jpg" /> الشكل 4: الممثل الشخصي للمنحنيات PCR المنتج التضخيم: هو شخصية ممثل من الجمع بين منحنيات (A) التضخيم من جميع الأهداف ميرنا لعينة البلازما البشرية. يتم وضع مقايسة لU6 (أ سيطرة مشتركة ncRNA) في كل subarray. يوضح النموذج في (ب) تقلب منخفض (SD &lt;0.5) بينما (C) ويظهر الانحراف المعياري عالية (SD&gt; 0.5) داخل U6 يعيد. كل من العينات TOTAل RNA معزولة من البلازما البشرية. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig4large.jpg" target="_blank">يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig5.jpg" /> الشكل 5: تحليل QC من علم الموائع النانوي صفائف: مراقبة الجودة (QC) صور لعلم الموائع النانوي مجموعة تحميلها بشكل صحيح (يسار) وعلم الموائع النانوي مجموعة تحميلها بشكل غير صحيح (يمين). الصبغة السلبي، ROX (موجودة في كاشف مزيج QPCR)، تتفلور للإشارة إلى تحميلها بشكل صحيح من خلال حفرة. مجموعة على اليمين لديها العديد من subarrays / من خلال الثقوب التي لم يتم تحميلها مع كاشف مزيج QPCR وهذه يجب تحديدها على أنها ردود فعل PCR سلبية كاذبة. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مكونات </td><td> حجم في 5 رد فعل ميكرولتر (ميكرولتر) </td></tr&gt; <tr><td> RT عازلة (10X) </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> dNTPs (100 ملي) </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> ريبونوكلياز المانع </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> nuclease خالية من المياه </td><td> 1.39 </td></tr><tr><td> الناسخ العكسي </td><td> 0.33 </td></tr><tr><td> الحجم الإجمالي </td><td> 2.33 </td></tr></tbody></table> الجدول 1A: RT مكونات المزيج كاشف في 5 ميكرولتر RT إعداد رد فعل لTAQMAN في الوقت الحقيقي QPCR باستخدام منصة موحدة لوحة 96-جيدا. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مكونات </td><td> حجم في 5 رد فعل ميكرولتر (ميكرولتر) </td><td> حجم في 20 رد فعل ميكرولتر (ميكرولتر) </td></tr><tr><td> سريع PCR mastermix (2X) </td><td> 2.5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> TAQMAN QPCR فحص (20x و) * </td><td> 0.25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> nuclease خاليةماء </td><td> 1.45 </td><td> 5.8 </td></tr><tr><td> إجمالى حجم التداول: </td><td> 4.2 </td><td> 16.8 </td></tr></tbody></table> * عنصر الفحص على أساس ميرنا اختيار اختبارها. الجدول 1B: QPCR مكونات المزيج كاشف في 5 أو 20 ميكرولتر QPCR إعداد رد فعل لTAQMAN في الوقت الحقيقي QPCR باستخدام منصة موحدة لوحة 96-جيدا. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مكونات </td><td> حجم في رد الفعل (ميكرولتر) </td></tr><tr><td> ميجابلكس RT الاشعال (10X) </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td> dNTPs مع dTTp (100 ملي) </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Multiscribe الناسخ العكسي (50 U / ميكرولتر) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT العازلة </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 ملي) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> ريبونوكلياز المانع &amp; #<html> 160؛ (20 U / ميكرولتر) </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> Nuclease خالية من المياه </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> مجموع </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> الجدول 2A: RT مكونات المزيج كاشف في 5 ميكرولتر RT إعداد رد فعل لوحة TLDA ميرنا. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> مكونات </td><td> حجم في رد الفعل (ميكرولتر) </td></tr><tr><td> TAQMAN preamp وMastermix (2X) </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td> ميجابلكس preamp والاشعال (10X) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> nuclease خالية من المياه </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> مجموع </td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> الجدول 2B: preamp ومكونات المزيج كاشف في إعداد رد فعل 25 ميكرولتر قبل amplication لوحة TLDA ميرنا. &quot;هوامش الخلية =&quot; 0 &quot;&gt; <tbody><tr><td> مكونات </td><td> حجم في رد الفعل (ميكرولتر) </td></tr><tr><td> ميجابلكس RT الاشعال (10X) </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> dNTPs مع dTTp (100 ملي) </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> Multiscribe الناسخ العكسي (50 U / ميكرولتر) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT العازلة </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 ملي) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> ريبونوكلياز المانع (20 U / ميكرولتر) </td><td> 0.09 </td></tr><tr><td> Nuclease خالية من المياه </td><td> 0.35 </td></tr><tr><td> مجموع </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> 3A الجدول: RT مكونات المزيج كاشف في 5 ميكرولتر RT إعداد رد فعل لالقائم على التحقيق لوحة علم الموائع النانوي ميرنا. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عنصرالصورة </td><td> حجم في رد الفعل (ميكرولتر) </td></tr><tr><td> TAQMAN preamp وMastermix (2X) </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td> ميجابلكس preamp والاشعال (10X) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> nuclease خالية من المياه </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> مجموع </td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> الجدول 3B: preamp ومكونات المزيج كاشف في إعداد رد فعل 25 ميكرولتر قبل amplication لالقائم على التحقيق لوحة علم الموائع النانوي ميرنا ملاحظة: التكميلية التفاعلية جداول البيانات إكسل ينص على المنصات الثلاث، وحسابات بالفعل لإضافة 5٪ للتعويض عن pipetting لخطأ. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> عينة A </td><td> عينة تكرار </td></tr><tr><td> 15،535 </td><td> 16،156 </td></tr><tr><td> 15،471 </td><td> 15،652 </td></tr><tr><td> 15.623 </td><td> 16،063 </td></tr><tr><td> 15،963 </td><td> 15،889 </td></tr><tr><td> 14،006 </td><td> 13.993 </td></tr><tr><td> 14،502 </td><td> 14،623 </td></tr><tr><td> 14،907 </td><td> 14،384 </td></tr><tr><td> 13،732 </td><td> 14،946 </td></tr></tbody></table> الجدول 4: تداول ميرنا U6 التنميط باستخدام بطاقة على microfluidics مجموعة. باستخدام اثنين من بطاقات مجموعة على microfluidics (A و B). ط م القيم من ميرنا السيطرة U6 من عينة ألف (الكلي = 8). السيطرة U6 متسقة ميرنا وفرة لوحظ بين أشواط.

Watch this Scientific Journal Video about Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs at JoVE.com

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

وقد ظهرت الرنا الميكروية المتداولة مؤخرا في المؤشرات الحيوية واعدة وجديدة لمختلف أنواع السرطان وأمراض أخرى. والهدف من هذه المقالة هو لمناقشة ثلاثة في الوقت الحقيقي PCR منصات مختلفة القائم على التحقيق والأساليب المتوفرة لقياس وتحديد وفرة تعميم الرنا الميكروية.

يستند التحقيق، في الوقت الحقيقي PCR مقاربات للقياس الكمي من microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Research

JoVE Journal

Biology

Experimental Approaches to Tissue Engineering

مقاربات تجريبية لهندسة الأنسجة

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

الكمية في الوقت الحقيقي باستخدام PCR العلمية الحرارية سولاريس qPCR الفحص

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

تحليل التعبير الجيني في الحفار الرماد الزمرد ( Agrilus planipennis) عن طريق ريال الكمية من الزمن - PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

من التنميط المسبق الجزئي الرناوات و microRNAs باستخدام الكمية في الوقت الحقيقي PCR (qPCR) صالحة

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

تحديد ملامح التعبير الجيني في C. ايليجانس استخدام ميكروأري وPCR الوقت الحقيقي

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

الحنق المجهر لمراقبة الوقت الحقيقي من أحداث في اشارة الخلايا الحية باستخدام أجهزة الاستشعار Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

كمي، في الوقت الحقيقي وتحليل قاعدة الختان في نشاط إصلاح Lysates خلية الاستفادة من الآفات محددة منارات الجزيئية

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

خلايا الثدييات إضاءة الحيوية مستقل للمراقبة المستمرة وريال مدريد في الوقت السمسة

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

التنميط الفردية الخلايا الجذعية الجنينية البشرية من خلال الكمي RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

تحليل qPCRTag - إنتاجية عالية، في الوقت الحقيقي PCR الفحص لSc2.0 التنميط الجيني

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...