Name: probe-based real-time pcr approaches for quantitative measurement of micrornas
Uploaded: 2015-04-14T15:00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs at JoVE.com

Alle Autoren erkennen die Infrastruktur Unterstützung der NHMRC CTC, University of Sydney, der Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF), Australien und den Rebecca Cooper Foundation, Australien. Diese Forschung wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem Australian Research Council (FT110100254) und der JDRF, Australien (CRN201314) finanziert, um WW, RJF AAH und MVJ durchgeführt alle Nasslabor Experimente durchgeführt ASJ Datenanalyse. WW schrieb den ersten Entwurf. AAH geplant das Studium und die Daten analysiert. Alle Autoren lesen und einigten sich auf die endgültige Fassung der Handschrift, Zahlen und Arbeitsblätter zur Veröffentlichung eingereicht.

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Die kritischen Schritte innerhalb der Sonde qPCR-basierte Protokolle, um genaue und reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten, sind Sie sicher, dass es 1) das gleiche Volumen und die Konzentration der RT-Produkt wird in jedem qPCR Reaktions geladen, 2) die richtigen Verhältnisse und Mengen der Komponenten benötigt qPCR Reaktion vorbereitet und gut gemischt, 3) die korrekte und einheitliche Volumina sind miteinander qPCR Reaktion gegeben, und 4) die Vorbereitung und Laden von jeder Probe und Reaktionsgemisch wird in kürzester Zeit wie möglich durchgeführt, während immer noch darauf achten, die obigen kritischen Schritte bereits erwähnt. Die Mikrofluidik Array Karten müssen geeignete Zentrifuge und spezifische Eimer. Jede Schaufel kann bis zu 3 Karten (beladen / leer) zu halten. Achten Sie immer darauf, dass alle 3 Slots eines Becher belegt sind und die Schaufel, indem ähnliche Eimer (Eimer dies sollte auch 3 Karten, entweder leer oder voll enthalten) in die entgegengesetzte Schlitz der Zentrifuge ausgeglichen. Beim Aufsetzen der Karte in der bucket Halter, stellen Sie sicher, dass die 8 Stauseen projizieren nach oben und Reaktionsfeldern vor der Außenwand der Zentrifuge. Dreh die Karten bei 331 × g für 1 min bei Raumtemperatur. Nach dem ersten Durchlauf, öffnen Sie die Zentrifuge und optisch sicher, dass die Reaktionsmischung wurde durch die 384 Vertiefungen verzichtet. Wiederholen Sie den Spin bei gleichen Einstellungen für ein weiteres Mal. Entfernen Sie die Karte aus Eimer und sicherzustellen, dass das Niveau der Reaktionsmischung in jedem der acht Stauseen einheitlich ist. Etwaige Unstimmigkeiten bei den in den Behältern links Flüssigkeitsvolumen machen die Karte ungeeignet zum weiteren Gebrauch. Um die gleiche Konzentration der RT-Produkt haben, wird dieselbe Eingangskonzentration von RNA in jedem RT-Reaktion gegeben. Die Gesamt-RNA-Konzentration wird unter Verwendung eines Mikro volumespectrophotometer gemessen. Die beobachtete 260/280 Verhältnis so niedrig wie 1.3 für die RNA aus Plasma / Serum isoliert werden; dies scheint nicht zu wirken auf den nachgelagerten qPCR bezogene Verfahren oder Daten erzeugt 30. Ebenso ist die 260/280 Verhältnisdie hier getesteten RNA-Proben lagen zwischen 1,3 bis 1,7 ohne abnormale Effekte in der qPCR beobachtet. Bei Verwendung einer geringen Gehalt an RNA-Proben, wie die aus biologischen Flüssigkeiten, kann es schwierig werden, um RNA vor der Verarbeitung zu quantifizieren. Wir empfehlen die Verwendung von synthetischen Spike-in an der RNA-Isolierung sowie die reverse Transkription Stufen. Nach unserer Erfahrung Arabidopsis thaliana miRNA-Kandidaten (ath-miR-159a und ath-miR-172a) über Caenorhabditis elegans miRNAs (wie cel-miR-39 oder cel-miR-54), die in unserer Erfahrung können höher sind bevorzugt Homologie als die von A. thaliana. Die Verwendung einer solchen stufenspezifischen Spike-in kann für die Normalisierung der miRNA Daten über mehrere Proben zu verschiedenen Zeitpunkten getestet ausmachen. Mit einem festen Eingangslautstärke von RNA für die cDNA-Synthese-Reaktion wird auch empfohlen 32,33. Die drei Sonden-basierte Protokolle für miRNA Quantifizierung hier beschriebenen erfordern unterschiedliche MengenGesamt-RNA-Eingang, unterschiedliche Workflows und Kosten. Jeder der Abläufe sind entworfen, um unterschiedliche Durchsätze, basierend auf der Anzahl der miRNA und der Anzahl der zu analysierenden Proben zu bieten. Mit zunehmendem Durchsatz (96 rxn 384 rxn 3072 rxn), die Kosten pro Reaktion mit einer Zunahme in der Menge an Daten über eine Zeiteinheit erhalten wird. Da alle diese Plattformen nutzen TaqMan Chemie, kann die Qualität der erhaltenen Daten erwartungsgemäß ähnlich sein werden. TaqMan qPCR ist ein etabliertes Verfahren zur Identifizierung der Fülle von miRNAs im Serum / Plasma Proben 9,11,27. Obwohl die drei Plattformen hier diskutierten dieselbe Chemie, eine Abnahme der Reaktionsvolumen führt zu einer Verringerung des dynamischen Bereichs des Transkripts Detektion (Farr RJ et al., Unveröffentlichte Daten). Der 96-Loch-qPCR-Plattform ist eine geringeren Durchsatz, aber hohe Empfindlichkeit Plattform und unserer Ansicht nach der &quot;Goldstandard&quot; für alle sondenbasierten (oder dye based) PCR-Plattformen. Dies kann jedochdie wirtschaftlichste und effiziente Plattform nicht sein, wenn mehrere Hundert oder Tausende von Proben, die untersucht und für mehrere microRNAs. Mikrofluidik (TLDA) und nanofluidics (OA) Plattformen mit hohem Durchsatz / Content-Plattformen zur Akquisition von größeren Daten in kürzerer Zeit zu ermöglichen. Obwohl Chargenunterschiede wurden in den TLDA Karten beobachtet worden ist, kann diese durch Anfordern TLDA Karten aus dem gleichen Ansatz minimiert werden. Wir beobachten, dass TLDA Plattform (Abbildung 3) zeigten signifikante Unterschiede in 17% der Mitte - geringe Häufigkeit miRNAs bei der Prüfung mit dem gleichen Probe auf unterschiedliche Chargen TLDA Karten. Wir empfehlen daher die gleichen Chargennummern für die Analyse mit TLDA Karten. Diese Variante könnte auch aufgrund der technischen Variabilität inklusive eventueller Beladung und Pipettierfehlern sein. Wir empfehlen jedoch, Bestellung / Anforderung der gleichen Charge von TLDA Karten. Keine signifikante Batch-Variante wurde auf die OA-Plattform beobachtet. Trotzdem TaqMan basierend experimental qPCR nähert Angebot Leichtigkeit, um die Fülle von miRNAs im Plasma / Serum Proben zu messen. Die niedrigen, mittleren und hohen Durchsatz Ansätze hier nicht an die Flexibilität, um eine Reihe von Proben und miRNAs mit einem hocheffiziente, reproduzierbare und sauber (geringem Hintergrundrauschen) Chemie analysieren.

Mikro-RNAs (miRNAs) sind ~ 22 Nukleotid nicht-kodierenden (NC-) RNAs, die als Regulatoren der Genexpression 1-3. Die meisten miRNAs bei Tieren funktionieren durch sequenzspezifische Basenpaarung mit einer mRNA, zur Förderung der 3&#39;-UTR, die negative Regulation der Genexpression 2-4 führt. Dies erfolgt in der Regel über eine Hemmung der mRNA-Translation oder durch ribosomale Drop-off. miRNAs Umlauf ist gezeigt worden, Biomarkern in Forschungs- und klinischen Gebieten für eine Vielzahl von Krankheiten, wie Diabetes 5-7, Eierstock- 8, 9 Prostata und Brustkrebs 10,11, Hepatitis B 12 und anderen Autoimmunerkrankungen 13 sein. Es wurden Untersuchungen durchgeführt, um reichlich miRNAs in verschiedenen Zellen oder Gewebe zu identifizieren, ebenso wie im Umlauf aus menschlichem Plasma und Serumproben, die besser zugänglich und weniger invasiv ist 9,11-15. Verschiedene Methoden der miRNA Quantifizierung wurden established mit mehreren Plattformen, wie beispielsweise die Standard-96-Well-Platte Plattform 4,12,16-18, der Mikrofluidik Kartenplattform 12,18-23 und der Nanofluidik Array-Plattform 17,24. Quantitative real-time PCR (qPCR) bietet die Möglichkeit, relative oder absolute Zahl der Transkripte Messung mit mehreren (Farbstoff- oder Sonde-basierte) Chemie. Sonde-basierte Echtzeit-PCR-Chemie bietet den Vorteil der niedrigen Hintergrundfluoreszenz und eine hohe Empfindlichkeit, eine einzige Abschrift Kopie zu erkennen. Es ist relativ kostengünstig, einfach zu bedienen und sehr gut reproduzierbar, so dass es eine bevorzugte Methode zur Quantifizierung und Bestimmung miRNA-Expression 25. Probe qPCR-basierte Verfahren umfasst im Allgemeinen zwei Schritte: die reverse Transkription (RT) und qPCR 4,26,27. RT ist, wo der Stamm-Schleifen-RT-Primer an einem reifen oder primären miRNA-Molekül hybridisiert und komplementären (c) DNA umgewandelt. Quantifizierung der cDNA-Produkt wird dann unter Verwendung miRNA-spezifischen PCR Primern26-28. Das Prinzip der sondenbasierten qPCR basiert auf dem Nachweis von Komplementärstrangverlängerung in Echtzeit, was die Hydrolyse des fluoreszenzmarkierten Sonde beinhaltet bezogen. Diese Sonden wurden entwickelt, um einen fluoreszierenden Reporter und einen Quencher, die nur voneinander entfernt sind, um FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) erlauben. Detektion der Emission von der Fluoreszenzreporter (Emitter) von der Nähe des Löschermolekül maskiert. Wenn Taq-Polymerase (pol) sich von der Stromaufwärts-Primer und erreicht eine Gabel (das 5&#39;-Ende der Sonde), hydrolysiert das Taq Pol-Exonukleaseaktivität der Sonde, was zu einer physikalischen Dissoziations / Trennung des fluoreszierenden Emitters vom Quencher. Diese Version von einem einzigen Molekül Fluoreszenzemitter wird durch den Detektor erfasst und als eine inkrementelle Erhöhung des Fluoreszenzsignals von diesem gut / Reaktions dargestellt. Der Anstieg in der Fluoreszenz ist proportional zu der Menge an PCR-Produkt erzeugt wird, so dass eine genaue quantification des amplifizierten Ziel 26,28. Mit zunehmender Nachfrage miRNA Quantifizierung mittlere bis hohe Durchsatz-Technologien wurden entwickelt, damit eine größere Anzahl von Proben in einer kurzen Zeit verarbeitet werden. TaqMan Low Density Array (TLDA) ist ein mittelDurch innovative mikrofluidische Design auf Sondenbasis qPCR Chemie bietet eine Erhöhung der Zahl von miRNAs auf einer Platte analysiert. TLDA beinhalten die Verwendung eines vorgegebenen Pool von RT-Primer, die verwendet werden, um die cDNA zu synthetisieren. Diese cDNAs werden anschließend in einen kunden 384er mikrofluidischer Karte gesponnen, um die Expression mehrerer miRNAs mittels qPCR 22,26,29 bestimmen. Jede Vertiefung der Karte enthält getrockneten Primer und Sonden zur spezifischen miRNA (en) zu verstärken, also bis zu 384 Reaktionen können in Einzel TLDA Karte 26 verarbeitet werden. Die nanofluidics Array ein Hochdurchsatz-Plattform, die zum Nachweis von Gen-Transkripte verwendet wird <sup&gt; 24 unter Verwendung der gleichen Sonde basierenden Chemie. Es nutzt eine proprietäre Matrix mit hydrophoben hydrophilen Wechselwirkungen einfache Laden der 33 Nanoliter-Reaktionsmischung in einer Anordnung von 3072 Durchgangslöcher auf einem Edelstahl-Schlitten 24 zu erleichtern. Dieser Artikel befasst sich zeigen, wie diese Methoden zur Quantifizierung von miRNAs im Serum / Plasma durchgeführt werden und die kritischen Faktoren, die berücksichtigt werden müssen bei der Durchführung und Interpretation dieser Daten. Getroffen, um Konto, werden ihre individuellen Vor- und Nachteile in diesem Artikel beschrieben werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well-platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Assays INV SM&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4427975</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 
			The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4366597 or 4366596</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 
			The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For qPCR run on a 96-well platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4367846</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 
			The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on&#160; the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4346907</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics platform (TLDA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399966</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444281</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>OR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444750</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 
			The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4391128 or 4488593</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 
			The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444303</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399233</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE Buffer (100 mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12090-015</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product 
			The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444913</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofluidics platform (OpenArray)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel)</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4470187</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4469576</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray 384-well Sample Plates&#160;&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4406947</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4462159</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray AccuFill System Tips&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4457246</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129117</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probe-based real-time pcr approaches for quantitative measurement of micrornas

Sondenbasierten quantitative PCR (qPCR) ist ein bevorzugtes Verfahren zum Messen Transkript Fluss, da es eines der am meisten empfindlichen Nachweisverfahren, die eine genaue und reproduzierbare Analyse liefert. Sondenbasierte Chemie bietet den geringsten Grundfluoreszenz im Vergleich zu anderen (Farbstoff) Chemien. Gegenwärtig gibt es verschiedene Betriebssysteme, dass die Verwendung sondenbasierte Chemie Transkript Fluss zu quantifizieren. qPCR in einer 96-Well-Platte ist die routinemßig verwendete Verfahren ist jedoch nur ein Maximum von 96 Proben oder miRNAs kann in einem einzigen Durchlauf getestet werden. Dies ist zeitraubend und mühsam, wenn eine große Anzahl von Proben / miRNAs analysiert werden. Hochdurchsondenbasierten Plattformen wie Mikrofluidik (zB TaqMan Array Card) und nanofluidics Arrays (zB Openarray) bieten eine einfache reproduzierbar und effizient die Fülle von mehreren mikroRNAs detektieren in einer großen Anzahl von Proben in einer kurzen Zeit. Hier zeigen wir, den Versuchsaufbau einnd Protokoll für die miRNA-Quantifizierung von Serum oder Plasma-EDTA-Proben, mit Sonde-basierte Chemie und drei verschiedenen Plattformen (96-Well-Platte, Mikrofluidik und Nanofluidik Arrays) mit steigendem Durchsatz.

Die empfohlene Volumen für eine miRNA-Sonde-basierte Assays qPCR Reaktion ist 20 ul. Anmerkung: Wir haben bestätigt, dass ein Reaktionsvolumen von 5 ul der Lage ist, ähnliche Ergebnisse wie die unter Verwendung von 20 ul Volumen 4,7,30 erreicht herzustellen. Absenken des Reaktionsvolumen auf 5 ul ermöglicht eine 75% ige Abnahme der Kosten für Reagenzien, ohne merklichen Verlust der Empfindlichkeit. Wie in Abbildung 2 dargestellt, Reaktionsvolumen von 20 ul und 5 ul zeigen eine starke Co-Verhältnis bis 39 Zyklen (mit r 2 von 0,92, p = 0,0002). Mikrofluidik Array stellt ein Werkzeug zur Gewinnung von Daten über 754 miRNAs in einer Probe in etwa 5 Stunden (für Karte A und die Karte B), die eine effizientere Methode zur Analyse mehrerer Proben im Vergleich zu herkömmlichen Platte mit 96 Vertiefungen PCR ist ausgedrückt. Wir verglichen miRNA Mikrofluidik Array Karten für die gleiche Probe (Probe A und Probe A Wiederholung) 3A -. B zeigt eine Bland-Altman-Plot (&lt;strong&gt; 3A) und Korrelation Grundstück (3B) für alle 754 miRNAs für diese Proben getestet. Es gibt 3 verschiedene Steuer miRNAs (U6, RNU44 und RNU48) nach dem Zufallsprinzip auf beiden Karten (Karten A und B) an verschiedenen Standorten platziert. Wenn Werte U6 Zyklus Schwelle (Ct) zwischen den 2 läuft im Vergleich haben wir nicht beobachten, signifikante Unterschiede zwischen den Werten (Tabelle 4). Es ist auch wichtig zu beachten, dass U6 ist in größerer Fülle (niedrigere Ct-Wert) in der Probe beurteilt ausgedrückt. Dann verglichen wir alle miRNAs, die Ct-Werte in beiden Läufen (n = 150) haben zwischen 0-19,99, die ähnlich Ausdruck miRNAs insgesamt mit einem Koeffizient der Bestimmung von 98% (3C-D) hatte. Von allen 277 miRNAs, die Ct-Werte zwischen 20 und 29.99 in den beiden Läufen haben, unterschieden sich 16 miRs deutlich zwischen den ursprünglichen und wiederholen Läufe (3E - F) Die Zahl der miRNAs mit signifikanten Unterschied zwische.n die Durchläufe erhöht (89 von 327), wenn die Ct-Werte wurden zwischen 30-40 für beide Läufe (Abbildung 3G - H) ausgewählt. Die nanofluidics Array Plattform liefert die Daten für 754 miRNAs von jedem Serum / Plasma-Probe getestet, wie in 4A dargestellt ist es wichtig, diese Verstärkungskurven zu untersuchen. - Wie es bei allen qPCR - sicherzustellen, dass das Ergebnis anzeigt wahre Verstärkung. Jedes der 48 Untergruppen (Abbildung 1) enthält auch einen Test für die drei beliebtesten &quot;Hauswirtschaft&quot; ncRNAs. U6, RNU44 und RNU48 4B veranschaulicht eine typische Clustering von U6 repliziert aus einer einzigen Probe. Diese Wiederholungen anzuzeigen niedrige Standardabweichung (SD &lt;0,5) und so sind ein Indikator für die Zuverlässigkeit. Alternativ 4C zeigt die erhöhte Variabilität U6 Replikate (SD&gt; 0.5) in einer zweiten Probe. Dies schließt nicht die Gültigkeit o negierenf die übrigen Tests, obwohl es notwendig eine gründliche Kritik. U6, wie bei den meisten &quot;Hauswirtschaft&quot; miRNAs in biologischen Flüssigkeiten, können eine Variable Ausdruck haben. Es sei darauf hingewiesen, daß eine der Proben, in 4C skizziert, wird 4-fach weniger U6 Gehalt als die in Figur 4B dargestellt. Da die Höhe der U6 in Probe in 4C dargestellt ist, 75% weniger als mit der, in der Platte 4B dargestellt zu beginnen, wird eine verstärkte technische Variabilität aufgrund der Poisson-Verteilung von Transkripten, die von der kleinen Reaktionsvolumen 17 verstärkt wird erwartet. Ein weiteres nützliches Tool ist die Qualitätskontrolle (QC) Bilder, für den Export zur Verfügung, sobald der Lauf beendet ist. Eine Auswahl davon ist der Fluoreszenz von ROX, der passive Farbstoff in der qPCR Reagenzgemisch gefunden, um zu bestätigen, dass jedes Durchgangsloch wurde korrekt (Abbildung 5) geladen. Ein Durchgangsloch oder gar ein eigenes<html> Reifen Subarray kann nicht geladen werden aufgrund einer unzureichenden Probenvolumen, Verdampfung, in die Vertiefungen der 384er-Probenplatte, Versagen der Probe Plattendichtung, oder Defekte in dem Accufill Systems oder seiner Spitzen vollständig entfernen vorliegende Blasen. Jede entladen Durchgangsbohrungen müssen identifiziert werden, um die Kennzeichnung miRNAs als &quot;nicht nachweisbar&quot;, zu vermeiden, wenn in Wirklichkeit der Test wurde nicht geladen. Wenn dieses Problem auftritt, zu bestätigen, dass mindestens 5 &amp; mgr; l Probe / Mastermix in jedem Well der 384-well-Probenplatte geladen wird, die Probenplatte ordnungsgemäß vor der Beladung zentrifugiert, ist die Siegelfolie vollständig entfernt, und die beladene Openarray Schieber verschlossen und innerhalb der vorgegebenen Zeit für alle aufeinanderfolgenden Durchläufen ausführen. Wenn Lade Problem nicht beseitigen, können diese werden eher die sich auf bestimmte Partie oder des Loses der Arrays oder ähnlichen Verbrauchsmaterial und weitere Unterstützung sollte durch den Hersteller eingeholt werden. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 52.586 / 52586fig1.jpg &quot;/&gt; Abbildung 1: Layout von Proben für die Nanofluidik Array-Workflow: (A) Jeder 384-Well-Probenteller können Proben für bis zu 8 Nanofluidik Arrays zu halten. (B) Verwässert ist vorverstärkt cDNA in 8 Vertiefungen (2 Spalten von 4 Zeilen) in benachbarten 8-Well-Gruppen gelegt, mit Pool A und Pool B. Jeder Kreis steht für eine gut. (C) Jede Vertiefung der Probenplatte wird zu einem Unterfeld des Nanofluidik Array geladen werden. Jedes kleine Quadrat stellt einen Teilfeld. <img alt="Abbildung 2" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig2.jpg" /> Abbildung 2: Co-Verhältnis-Analyse für konventionelle 96-well PCR-Plattformen: Co-Verhältnis von 20 ul und 5 ul Reaktionsvolumina auf TaqMan Real-time qPCR mit einem Standard-96-Well-Platte-Plattform in CT-Werte (39 Zyklen). Wir verglichen 4 verschiedene microRNAs (miR-375, miR-30c, 30d und miR-miR-7) in 4 verschiedenen menschlichen Serum- und Plasmaproben. Nur 11 Datenpunkte aufgezeichnet, da die anderen waren nicht nachweisbar. R 2 = 0,92, p = 0,0002. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig3.jpg" /> . Abbildung 3: Die Umlauf miRNA Profiling mit Mikrofluidik Array Karten Mit 2 Mikrofluidik-Karten (Karten-A und-B-Karte), ein Profil von 754 miRNAs erzeugt (A - B). Wie hier gezeigt, haben wir dieselbe Probe für 2 Mikrofluidik Array läuft, um die Reproduzierbarkeit der Mikrofluidik Karte Ergebnisse zu überprüfen. Wir beobachteten einen ähnlichen Ausdruck miRNAs insgesamt mit Ct-Werten zwischen 0 bis 19,99 (C - D). Es gibt nur wenige miRNAs (16 von 277) mit Ct-Werten zwischen 20 bis 29,99 und signifikante Unterschiede zwischen den Wiederholungsläufe (E - F). Achtzig neun von 327microRNAs mit höheren Ct-Werte (30-40) zeigten signifikante Unterschiede zwischen den beiden Durchgängen (G - H). &#160; Die Daten werden mit Hilfe gepaart T-Test analysiert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="4" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig4.jpg" /> Abbildung 4: Vertreter Profil von PCR-Produkt Amplifikationskurven: Ist eine repräsentative Figur der kombinierten (A) Amplifikationskurven aller miRNA Ziele für eine menschliche Plasmaprobe. Ein Test auf U6 (eine gemeinsame Steuer ncRNA) ist in jedem Unterfeld platziert. Die Probe in (B) zeigt eine geringe Variabilität (SD &lt;0,5), während (C) zeigt eine hohe Standardabweichung (SD&gt; 0,5) innerhalb U6 repliziert. Beide Proben sind total RNA aus menschlichem Plasma isoliert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieses Bild anzuzeigen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig5.jpg" /> Abbildung 5: QC Analyse Nanofluidik Arrays: Qualitätskontrolle (QC) Bilder einer richtig eingelegt Nanofluidik Array (links) und einer falsch eingelegt Nanofluidik Array (rechts). Die passive Farbstoff ROX (in der qPCR Reagenzienmix vorhanden), fluoresziert, um eine korrekt geladen Durchgangsbohrung angeben. Die Anordnung auf der rechten Seite hat mehrere Subarrays / Durchgangslöcher, die nicht mit der qPCR Reagenzgemisch geladen werden, und diese sollten als falsch-negative PCR-Reaktionen identifiziert werden. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Components </td><td> Volumen pro 5 ul-Reaktion (ul) </td></tr&gt; <tr><td> RT-Puffer (10x) </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> dNTPs (100 mM) </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> 1.39 </td></tr><tr><td> Reverse-Transkriptase- </td><td> 0.33 </td></tr><tr><td> Gesamtvolumen </td><td> 2.33 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1A: RT Reagenzienmischung Komponenten in einer 5 &amp; mgr; l RT-Reaktionsvorbereitung TaqMan Echtzeit qPCR unter Verwendung eines Standard-96-Well-Platte-Plattform. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Components </td><td> Volumen pro 5 ul-Reaktion (ul) </td><td> Volumen pro 20 ul Reaktions (ul) </td></tr><tr><td> Schnelle PCR-Mastermix (2x) </td><td> 2.5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> TaqMan qPCR Assay (20x) * </td><td> 0,25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Nuklease-freiesWasser </td><td> 1,45 </td><td> 5.8 </td></tr><tr><td> Gesamtvolumen: </td><td> 4.2 </td><td> 16,8 </td></tr></tbody></table> * Testkomponente auf Grundlage des ausgewählten miRNA getestet. Tabelle 1B: qPCR Reagenzienmix Komponenten in einem 5 oder 20 &amp; mgr; qPCR Reaktionsansatz für TaqMan Real-time qPCR mit einem Standard-96-Well-Platte Plattform. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Components </td><td> Volumen pro Reaktion (ul) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primer (10x) </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td> dNTPs mit dTTP (100 mM) </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> MultiScribe Reverse Transcriptase (50 U / ul) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT-Puffer </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mM) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor &amp; #<html> 160; (20 U / ul) </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> Nuklease-freiem Wasser </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2A: RT Reagenzienmix Komponenten in einer 5 ul RT-Reaktion Vorbereitung TLDA miRNA-Panel. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Components </td><td> Volumen pro Reaktion (ul) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp Mastermix (2x) </td><td> 12,5 </td></tr><tr><td> Megaplex PreAmp Primers (10x) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 22,5 </td></tr></tbody></table> Tabelle 2B: PreAmp Reagenzienmix Komponenten in einem 25 &amp; mgr; pre-Amplifikation Reaktions Vorbereitung TLDA miRNA-Panel. &quot;Cellspacing =&quot; 0 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Components </td><td> Volumen pro Reaktion (ul) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primer (10x) </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> dNTPs mit dTTP (100 mM) </td><td> 0,15 </td></tr><tr><td> MultiScribe Reverse Transcriptase (50 U / ul) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT-Puffer </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 mM) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNase Inhibitor (20 U / ul) </td><td> 0,09 </td></tr><tr><td> Nuklease-freiem Wasser </td><td> 0,35 </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3A: RT Reagenzienmix Komponenten in einer 5 ul RT-Reaktion Vorbereitung sondenbasierten Nanofluidik miRNA-Panel. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Komponentes </td><td> Volumen pro Reaktion (ul) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp Mastermix (2x) </td><td> 12,5 </td></tr><tr><td> Megaplex PreAmp Primers (10x) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> Nuklease-freies Wasser </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> Gesamt </td><td> 22,5 </td></tr></tbody></table> Tabelle 3B:. PreAmp Reagenzienmix Komponenten in einem 25 &amp; mgr; pre-Amplifikation Reaktionsansatz für sondenbasierten Nanofluidik miRNA Platte HINWEIS: Die interaktive Zusatz Excel-Tabellen für die drei Plattformen zur Verfügung gestellt, die bereits einen Anteil von 5% zusätzlich zu zum Pipettieren Fehler zu kompensieren. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Probe A </td><td> Probe A wiederholen </td></tr><tr><td> 15,535 </td><td> 16,156 </td></tr><tr><td> 15,471 </td><td> 15,652 </td></tr><tr><td> 15.623 </td><td> 16,063 </td></tr><tr><td> 15,963 </td><td> 15,889 </td></tr><tr><td> 14,006 </td><td> 13,993 </td></tr><tr><td> 14,502 </td><td> 14,623 </td></tr><tr><td> 14,907 </td><td> 14,384 </td></tr><tr><td> 13,732 </td><td> 14,946 </td></tr></tbody></table> Tabelle 4: Die Umlauf miRNA U6 Profilerstellung mithilfe der Mikrofluidik Array Karte. Mit zwei Array Mikrofluidik-Karten (A und B). Ct-Werte U6 Steuer miRNA aus Probe A (insgesamt = 8). Konsequente U6 Steuer miRNA Fluss zwischen den Läufen beobachtet.

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Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

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