Name: probe-based real-time pcr approaches for quantitative measurement of micrornas
Uploaded: 2015-04-14T15:00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs at JoVE.com

כל המחברים מודים תמיכת התשתית מNHMRC CTC, אוניברסיטת סידני, קרן המחקר לסוכרת נעורים (JDRF), אוסטרליה וקרן קופר רבקה, אוסטרליה. מחקר זה מומן באמצעות מענקים מהמועצה האוסטרלית למחקר (FT110100254) וJDRF, אוסטרליה (CRN201314) לאהה WW, RJF וMVJ ביצע את כל הניסויים המעבדה הרטובים, ASJ ביצע ניתוח נתונים. WW כתב את הטיוטה הראשונה. אהה מתוכנן המחקר וניתח את הנתונים. כל המחברים לקרוא והסכימו על הנוסח הסופי של כתב היד, דמויות וגיליונות העבודה שהוגשו לפרסום.

<ol>
	<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+animal+microRNAs.">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li><li>Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+functions+in+animal+development+and+human+disease.">MicroRNA functions in animal development and human disease.</a> Development. 132, 4653-4662 (2005).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li><li>Joglekar, M. V., Wei, C., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+estimation+of+multiple+miRNAs+and+mRNAs+from+a+single+cell.">Quantitative estimation of multiple miRNAs and mRNAs from a single cell.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, pdb prot5478 (2010).</li><li>Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet-specific+microRNAs+in+pancreas+development,+regeneration+and+diabetes.">Islet-specific microRNAs in pancreas development, regeneration and diabetes.</a> Indian J Exp Biol. 49, 401-408 (2011).</li><li>Farr, R. J., Joglekar, M. V., Taylor, C. J., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+non-coding+RNAs+as+biomarkers+of+beta+cell+death+in+diabetes.">Circulating non-coding RNAs as biomarkers of beta cell death in diabetes.</a> Pediatr Endocrinol Rev. 11, 14-20 (2013).</li><li>Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+islet-specific+microRNAs+during+human+pancreatic+development.">Expression of islet-specific microRNAs during human pancreatic development.</a> Gene Expr Patterns. 9, 109-113 (2009).</li><li>Iorio, M. V., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+in+ovarian+cancer.">MicroRNA profiling in ovarian cancer.</a> Methods Mol Biol. 1049, 187-197 (2013).</li><li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection.">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 10513-10518 (2008).</li><li>Mattie, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+high-throughput+microRNA+expression+profiling+provides+novel+biomarker+assessment+of+clinical+prostate+and+breast+cancer+biopsies.">Optimized high-throughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies.</a> Mol Cancer. 5, 24 (2006).</li><li>Zhu, W., Qin, W., Atasoy, U., Sauter, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+breast+cancer+and+healthy+subjects.">Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects.</a> BMC Res Notes. 2, 89 (2009).</li><li>Zhu, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+suitable+reference+genes+for+qRT-PCR+analysis+of+circulating+microRNAs+in+hepatitis+B+virus-infected+patients.">Identification of suitable reference genes for qRT-PCR analysis of circulating microRNAs in hepatitis B virus-infected patients.</a> Mol Biotechnol. 50, 49-56 (2012).</li><li>Yamada, H., Itoh, M., Hiratsuka, I., Hashimoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+autoimmune+thyroid+diseases.">Circulating microRNAs in autoimmune thyroid diseases.</a> Clin Endocrinol (Oxf). , (2014).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+MicroRNA+Expression+Profile+as+a+Biomarker+in+the+Diagnosis+and+Prognosis+of+Pancreatic+Cancer.">Serum MicroRNA Expression Profile as a Biomarker in the Diagnosis and Prognosis of Pancreatic Cancer.</a> Clinical Chemistry. 58, 610-618 (2012).</li><li>Gilad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+microRNAs+are+promising+novel+biomarkers.">Serum microRNAs are promising novel biomarkers.</a> PLoS One. 3, e3148 (2008).</li><li>Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Mehta, S., Bhonde, R. R., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+of+developing+and+regenerating+pancreas+reveal+post-transcriptional+regulation+of+neurogenin3.">MicroRNA profiling of developing and regenerating pancreas reveal post-transcriptional regulation of neurogenin3.</a> Dev Biol. 311, 603-612 (2007).</li><li>Hardikar, A. A., Farr, R. J., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs:+understanding+the+limits+for+quantitative+measurement+by+real-time+PCR.">Circulating microRNAs: understanding the limits for quantitative measurement by real-time PCR.</a> J Am Heart Assoc. 3, e000792 (2014).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+and+Prognostic+Implications+of+a+Serum+miRNA+Panel+in+Oesophageal+Squamous+Cell+Carcinoma.">Diagnostic and Prognostic Implications of a Serum miRNA Panel in Oesophageal Squamous Cell Carcinoma.</a> PLoS One. 9, e92292 (2014).</li><li>McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+microRNA+profiling+of+exosomes+derived+from+blood+and+culture+media.">Purification and microRNA profiling of exosomes derived from blood and culture media.</a> J Vis Exp. , e50294 (2013).</li><li>Joglekar, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-30+family+microRNAs+confer+epithelial+phenotype+to+human+pancreatic+cells.">The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells.</a> Islets. 1, 137-147 (2009).</li><li>Genda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA+changes+in+the+dorsal+horn+of+the+spinal+cord+of+rats+with+chronic+constriction+injury:+A+TaqMan(R)+Low+Density+Array+study.">microRNA changes in the dorsal horn of the spinal cord of rats with chronic constriction injury: A TaqMan(R) Low Density Array study.</a> Int J Mol Med. 31, 129-137 (2013).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+three+microRNA+profiling+platforms:+microarray,+beads+array,+and+quantitative+real-time+PCR+array.">Systematic evaluation of three microRNA profiling platforms: microarray, beads array, and quantitative real-time PCR array.</a> PLoS One. 6, e17167 (2011).</li><li>Cuk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+plasma+as+early+detection+markers+for+breast+cancer.">Circulating microRNAs in plasma as early detection markers for breast cancer.</a> Int J Cancer. 132, 1602-1612 (2013).</li><li>Morrison, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+high+throughput+quantitative+PCR.">Nanoliter high throughput quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 34, e123 (2006).</li><li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+microarray+profiling,+real-time+PCR,+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression.">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16, 991-1006 (2010).</li><li>Benes, V., Castoldi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+of+microRNA+using+real-time+quantitative+PCR,+how+to+use+it+and+what+is+available.">Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available.</a> Methods. 50, 244-249 (2010).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR.">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).</li><li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA.">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44, 31-38 (2008).</li><li>Kodani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+TaqMan+low-density+arrays+for+simultaneous+detection+of+multiple+respiratory+pathogens.">Application of TaqMan low-density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens.</a> J Clin Microbiol. 49, 2175-2182 (2011).</li><li>Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereirae Cotta, ., V, M., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+measurement+of+noncoding+RNA+in+human+serum.">A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum.</a> Exp Diabetes Res. 2012, 168368 (2012).</li><li>Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+extracellular+circulating+microRNA.">Characterization of extracellular circulating microRNA.</a> Nucleic Acids Res. 39, 7223-7233 (2011).</li><li>Li, Y., Kowdley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples.">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal Biochem. 431, 69-75 (2012).</li></ol>

עלויות עיבוד / פרסום מאמר היו מכוסות על ידי Life Technologies, הבא קבלה של כתב היד הזה לפרסום.

השלבים הקריטיים בפרוטוקולי qPCR מבוסס הבדיקה כדי לקבל תוצאות מדויקות ושחזור הם לעשות 1 בטוח) את אותו הנפח והריכוז של RT-מוצר טעון בכל תגובת qPCR, 2) היחסים ונפחים הנכונים של הרכיבים דרושים ל תגובת qPCR מוכנה ומעורבת היטב, 3) הכרכים הנכונים ועקביים מתווספים לכל תגובת qPCR, ו -4) העריכה ולטעינה של כל דגימה ותגובת תמהיל הושלמה בזמן הקצר ביותר אפשרי, ועדיין מודעים ל השלבים הקריטיים מעל שהוזכרו קודם לכן. כרטיסי מערך מיקרופלואידיקה צריכים צנטריפוגות המתאימה ודליים ספציפיים. כל אחד מהסלים יכולים להכיל עד 3 כרטיסים (עמוסים / ריק). תמיד לוודא שכל 3 החריצים של דלי עסוקים והדלי הוא מאוזנת על ידי הצבת דלי דומה (הדלי הזה צריך להכיל גם 3 כרטיסים, ריקים או מלאים) בחריץ השני של צנטריפוגות. תוך שימת הכרטיס בbuckeבעל t, לוודא כי המאגרים 8 להקרין כלפי מעלה ובארות תגובת הפנים לקיר החיצוני של צנטריפוגות. ספין הכרטיסים ב331 XG 1 דקות בטמפרטורת חדר. אחרי הספין ראשון, לפתוח את צנטריפוגות וחזותית להבטיח את תערובת התגובה כבר חילקה באמצעות 384 הבארות. חזור על הספין באותן הגדרות עבור 1 יותר זמן. הסר את הכרטיס מהדלי ולהבטיח כי רמת תערובת תגובה בכל אחד מהמאגרים 8 היא אחידה. כל חוסר עקביות בנפחי הנוזל שנותרו במאגרים להפוך את הכרטיס לשימוש בלתי הולם נוסף. כדי לקבל את אותו הריכוז של RT-המוצר, אותו ריכוז קלט של רנ&quot;א הוסיף לכל תגובת RT. סך הכל ריכוז RNA נמדד באמצעות מיקרו-volumespectrophotometer. היחס נצפה 260/280 יכול להיות נמוך כמו 1.3 לRNA מבודד מפלזמה / סרום; זה לא נראה שיש להם השפעה על תהליך הקשור לqPCR במורד הזרם או נתונים שנוצרו 30. כמו כן, יחס 260/280 שלדגימות RNA נבדקו במסמך זה היו בין 1.3-1.7 ללא תופעות חריגות בqPCR נצפו. בעת שימוש בדגימות נמוכות RNA תוכן, כמו אלה מbiofluids, זה עלול להיות קשה לכמת RNA לפני העיבוד. אנו ממליצים על השימוש בספייק-בסינטטי בבידוד RNA, כמו גם את שלבי שעתוק לאחור. מניסיוננו, מועמדי ארבידופסיס thaliana מירנה (ATH-miR-159a וATH-miR-172a) עדיפים על miRNAs elegans Caenorhabditis (כגון cel-miR-39 או cel-miR-54), אשר בניסיון שלנו עשוי להיות גבוה יותר הומולוגיה מאלה מא thaliana. השימוש בספייק-בשלב ספציפי כזה יכול להסביר את הנורמליזציה של נתונים מירנה פני דגימות מרובות assayed בזמנים שונים. שימוש קבוע קלט נפח של RNA לתגובת סינתזת cDNA מומלץ גם 32,33. שלושה הפרוטוקולים מבוססים-הבדיקה לכימות מירנה שתוארו כאן דורשים כמויות משתנותשל קלט RNA הכולל, זרימות עבודה ועלויות שונות. כל אחד מתהליכי העבודה נועד לספק תפוקה שונה המבוססת על מספר מטרות מירנה ומספר הדגימות להיות מנותחים. עם הגדלת תפוקה (96 rxn rxn 3072 384 rxn), העלות לכל תגובה יורדת עם עלייה בכמות של נתונים המתקבלים על יחידת זמן. מאז כל פלטפורמות אלה לנצל כימיה TaqMan, ניתן לצפות באיכות של נתונים המתקבלים להיות דומה. TaqMan qPCR הוא שיטה מבוססת היטב לזיהוי השפע של miRNAs בדגימות סרום / פלזמה 9,11,27. למרות ששלוש הפלטפורמות שנדונו כאן חולקות את אותה הכימיה, ירידה בנפח התגובה מובילה לירידה בטווח דינמי של גילוי תמליל (פאר RJ et al., נתונים שלא פורסמו). פלטפורמת qPCR 96-גם היא תפוקה נמוכה יותר, אבל פלטפורמת רגישות גבוהה ולדעתנו, &quot;תקן הזהב&quot; לכל פלטפורמות PCR (או דיי מבוסס) המבוסס על הבדיקה. עם זאת, ייתכן שזהלא תהיה הפלטפורמה החסכונית או יעילה ביותר אם כמה מאה או אלפי דגימות שמתבצעת assayed ולמייקרו-רנ&quot;א מרובה. מיקרופלואידיקה (TLDA) וnanofluidics פלטפורמות (OA) הן פלטפורמות תפוקה גבוהה / תוכן שנועדו לאפשר רכישה של נתונים גדולים יותר בזמן קצר יותר. למרות הבדלים אצווה נצפו בכרטיסי TLDA, זה יכול להיות ממוזער על ידי בקשת כרטיסי TLDA מאותה אצווה. אנו צופים כי פלטפורמת TLDA (איור 3) הראתה וריאציה משמעותית בכ -17% מאמצע - miRNAs שפע נמוך כאשר נבדק באמצעות המדגם זהה בקבוצות שונות של כרטיסי TLDA. לפיכך, אנו ממליצים על שימוש באותו מספרים אצווה לניתוח באמצעות כרטיסי TLDA. גם וריאציה זו יכולה להיות בגלל ההשתנות הטכניות לרבות כל שגיאות טעינה וpipetting פוטנציאליות. עם זאת, אנו ממליצים הזמנה / מבקש את אותו אצווה של כרטיסי TLDA. אין וריאציה אצווה משמעותית נצפתה על פלטפורמת OA. למרות זאת, TaqMan experimen מבוססטל qPCR גישות הצעת קלות למדוד את השפע של miRNAs בדגימות פלזמה / סרום. גישות התפוקה נמוכה, בינוניות וגבוהות שנדונו כאן מציעות את הגמישות כדי לנתח מגוון של דוגמאות וmiRNAs באמצעות כימיה יעילה ביותר, לשחזור ונקיה (רעש רקע נמוך).

מייקרו RNA (miRNAs) הוא ~ 22 נוקליאוטידים (NC) RNAs ללא קידוד, מתפקד כרגולטורים של ביטוי גני 1-3. רוב miRNAs בבעלי חיים לתפקד באמצעות זיווג בסיס רצף ספציפי עם mRNA, מיקוד &#39;UTR 3, מה שמוביל לרגולציה שלילית של ביטוי גני 2-4. זו מתרחשת בדרך כלל באמצעות בלימת תרגום mRNA או אחר טיפה-off ריבוזומלי. miRNAs במחזור הוכח להיות סמנים ביולוגיים חדשניים במחקר ובשדות קליניים עבור מגוון רחב של מחלות, כגון סוכרת 5-7, השחלות 8, סרטן הערמונית וסרטן השד 9 10,11, צהבת מסוג B 12 ומחלות אוטואימוניות אחרות 13. מחקר נערך לזהות miRNAs בשפע בתאים או רקמות שונים, כמו גם שבמחזור מפלזמה אנושית ודגימות סרום, שהוא נגיש יותר ופחות פולשני 9,11-15. שיטות שונות של כימות מירנה היו דוארstablished באמצעות פלטפורמות מרובות, כגון פלטפורמת 96-היטב סטנדרטית צלחת 4,12,16-18, פלטפורמת כרטיס מיקרופלואידיקה 12,18-23 ופלטפורמת מערך nanofluidics 17,24. בזמן אמת PCR (qPCR) מציע את היכולת למדוד מספרים יחסי או מוחלטים של תמלילים באמצעות מרובה (dye- או מבוסס בדיקה) chemistries. כימיה PCR בזמן אמת המבוססת על הבדיקה מציעה את היתרון של הקרינה רקע נמוכה ורגישות גבוהה לגילוי עותק תמליל בודד. הוא יחסית חסכוני, פשוט לשימוש ומאוד לשחזור, מה שהופך את שיטה מועדפת לכימות וקביעת ביטוי מירנה 25. שיטת qPCR מבוססת בדיקה בדרך כלל כרוכה בשני שלבים: להפוך שעתוק (RT) וqPCR 4,26,27. RT הוא המקום שבי פריימר גזע הלולאה RT הוא הכלאה למולקולת מירנה בוגרת או עיקרי והמיר ל- DNA משלים (ג). כימות של מוצר cDNA מתבצעת לאחר מכן באמצעות פריימרים PCR מירנה ספציפיים26-28. עיקרון qPCR מבוסס בדיקה מבוסס על זיהוי של הארכה משלימה גדיל בזמן אמת, הכוללת הידרוליזה של החללית מתויג fluorescently. בדיקות אלה נועדו להכיל כתב ניאון ומרווה, כי הם פשוט בנפרד כדי לאפשר סריג (העברת הקרינה תהודה אנרגיה). זיהוי של הפליטה מכתב הקרינה (פולט) מוסווה בקרבתה של מולקולת המרווה. כאשר פולימראז תקי (pol) משתרע מפריימר במעלה הזרם ומגיע מזלג (סוף &#39;5 של הבדיקה), פעילות exonuclease pol תקי hydrolyses הבדיקה, שהובילה לניתוק / הפרדה פיזית של פולט הניאון מהמרווה. גרסה זו של מולקולה בודדת של פולט הקרינה שתועדה על ידי הגלאים ומוצגת כגידול מצטבר באות הקרינה שמגם / תגובה. העלייה בקרינה היא פרופורציונלית לכמות של מוצר ה- PCR שנוצרה, המאפשר qu מדויקantification של 26,28 היעד המוגבר. עם ביקוש גובר בכימות מירנה, בינוני לטכנולוגיות תפוקה גבוהה פותחו כדי לאפשר למספר גדול יותר של דגימות לעיבוד בפרק זמן קצר. מערך TaqMan בצפיפות נמוכה (TLDA) הוא עיצוב בינוני תפוקה חדשני microfluidic מבוסס על הכימיה qPCR מבוסס בדיקה מציע גידול במספר miRNAs ניתח בצלחת אחת. TLDA כרוך בשימוש בברכה מוגדרת מראש של RT-פריימרים המשמשים לסינתזת cDNA. אז cDNAs אלה הסתחררו לתוך 384 גם מיקרו-fluidic כרטיס מותאם אישית כדי לקבוע את הביטוי של miRNAs מרובה באמצעות qPCR 22,26,29. היטב בכל הכרטיס מכיל מיובש פריימרים ובדיקות כדי להגביר מירנה ספציפית (ים), ולכן עד 384 תגובות יכולות להיות מעובד בכרטיס היחיד TLDA 26. מערך nanofluidics הוא פלטפורמת תפוקה גבוהה המשמשת לזיהוי של תמלילי גן <sup&gt; 24 תוך שימוש באותה הכימיה מבוססת בדיקה. הוא מנצל מטריצת קניינית מציעה אינטראקציות הידרופוביות-הידרופילי כדי להקל על טעינה קלה של תערובת תגובת 33 nanoliter למערך של 3072 דרך חורים בשקופית נירוסטה 24. מאמר זה מתמקד במדגים כיצד שיטות אלה לכימות miRNAs בסרום / פלזמה מבוצעות והגורמים הקריטיים שיש לקחת בחשבון בעת ​​ביצוע ופרשנות נתונים כאלה. נלקחו בחשבון, היתרונות האישיים שלהם ואת המגבלות יידונו במאמר זה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well-platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Assays INV SM&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4427975</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 
			The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4366597 or 4366596</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 
			The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For qPCR run on a 96-well platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4367846</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 
			The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on&#160; the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4346907</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics platform (TLDA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399966</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444281</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>OR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444750</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 
			The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4391128 or 4488593</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 
			The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444303</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399233</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE Buffer (100 mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12090-015</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product 
			The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444913</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofluidics platform (OpenArray)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel)</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4470187</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4469576</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray 384-well Sample Plates&#160;&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4406947</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4462159</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray AccuFill System Tips&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4457246</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129117</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probe-based real-time pcr approaches for quantitative measurement of micrornas

PCR כמותי המבוסס על בדיקה (qPCR) הוא שיטה מועדפת למדידת שפע תמליל, שכן הוא אחד מהשיטות זיהוי הרגישים ביותר המספקת ניתוח מדויק ושחזור. כימיה מבוססת Probe מציעה את הקרינה רקע לפחות בהשוואה לchemistries אחר (המבוסס על צבע). נכון להיום, יש כמה פלטפורמות זמינות שכימיה מבוססת בדיקה שימוש כדי לכמת שפע תמליל. qPCR בצלחת גם 96 הוא השיטה הנפוצה ביותר באופן שגרתי, אך רק למקסימום של 96 דגימות או miRNAs ניתן לבדוק בטווח אחת. זה זמן רב ומייגע, אם מספר גדול של דגימות / miRNAs הוא להיות מנותח. פלטפורמות מבוססות בדיקה תפוקה גבוהה כגון מיקרופלואידיקה (למשל כרטיס מערך TaqMan) ומערכי nanofluidics (למשל OpenArray) הצעת קלות וביעילות reproducibly לזהות את השפע של מיקרו-רנ&quot;א המרובים במספר גדול של דגימות בזמן קצר. הנה, אנחנו מדגימים את ניסיוני התקנהnd פרוטוקול כדי לכמת את מירנה מסרום או דגימות פלזמה EDTA, באמצעות כימיה מבוססת בדיקה ושלוש פלטפורמות שונות (96 צלחת גם, מיקרופלואידיקה ומערכי nanofluidics) מציעה רמות גוברים של תפוקה.

הנפח המומלץ לתגובת qPCR מבוססת assay הבדיקה מירנה הוא 20 μl. הערה: יש לנו אישר כי עוצמת תגובה של 5 μl היא מסוגלת לייצר תוצאות דומות לאלה שהושגו באמצעות 4,7,30 נפח 20 μl. הפחתת נפח התגובה ל5 μl מאפשרת לירידה של 75% בעלויות מגיב ללא הפסד ניכר ברגישות. כפי שהוצגו באיור 2, כרכי תגובה של 20 μl ו -5 μl להראות שיתוף ביחס חזק עד 39 מחזורים (עם r 2 של 0.92, p = 0.0002). מערך מיקרופלואידיקה מספק כלי לקבלת נתונים על 754 miRNAs בא לידי ביטוי במדגם בסביבות 5 שעות (לכרטיס והכרטיס B), שהיא דרך יעילה יותר של ניתוח דגימות מרובות בהשוואה ל -96 PCRs צלחת גם הקונבנציונלי. אנחנו לעומת כרטיסי מירנה מערך מיקרופלואידיקה עבור אותו המדגם (לדוגמא ודוגמה חוזרת) איור 3 א -. B מציג עלילה בלנד-אלטמן (&lt;strong&gt; 3 א) ועלילת מתאם (3B) לכל 754 miRNAs נבדק דגימות אלה. ישנם 3 miRNAs שונה שליטה (U6, RNU44 וRNU48) ממוקם באופן אקראי בשני כרטיסים (Card ו- B) במקומות רבים. כאשר סף מחזור U6 ערכים (CT) הם בהשוואה בין 2 הריצות, אנחנו לא רואים הבדלים משמעותיים בין הערכים (לוח 4). כמו כן, חשוב לציין כאן שU6 מתבטא בשפע גדול יותר (ערך נמוך Ct) במדגם העריך. לאחר מכן, אנו לעומת כל miRNAs שיש לי ערכי ה- CT בין 0-19.99 בשתי הריצות (n = 150), שהיה לי ביטוי דומה של miRNAs כולל עם שיתוף יעיל של נחישות של 98% (איור 3 ג-ד). מכל 277 miRNAs שיש לי ערכי ה- CT בין 20 ל 29.99 בשתי הריצות, 16 מירס היה שונה משמעותי בין הריצות המקוריות וחזור (איור 3E - F) מספר miRNAs עם הבדל משמעותי betwee.n הריצות מוגברות (89 של 327), כאשר ערכי ה- CT נבחרו בין 30-40 עבור שני הריצות (איור 3G - H). פלטפורמת מערך nanofluidics מספקת נתונים לmiRNAs 754 מכל מדגם בסרום / פלזמה נבדק, כפי שהוא מיוצג באיור 4 א זה חשוב לבחון עקומות הגברה אלה -. כפי שהוא עם כל qPCR - כדי להבטיח שהתוצאה מעידה על הגברה נכונה. כל אחד מsubarrays 48 (איור 1) מכיל גם assay לשלוש ncRNAs הפופולרי ביותר &quot;משק הבית&quot;:. U6, RNU44 וRNU48 איור 4 ממחיש אשכולות טיפוסיים של U6 משכפל ממדגם יחיד. משכפל אלה להציג סטייה נמוכה סטנדרטית (SD &lt;0.5) וכך גם מדד לאמינות. לחלופין, איור 4C מדגים את השונות מוגברות של משכפל U6 (SD&gt; 0.5) במדגם שני. זה אינו שולל את תוקף of מבחני שנותרו, על אף שהוא עושה מחייב ביקורת מעמיקה יותר. U6, כמו עם רוב miRNAs &quot;משק הבית&quot; בנוזלים ביולוגיים, יכול להיות ביטוי משתנה. יש לציין כי אחת דוגמאות, שמתוארים באיור 4C, מציג פי 4 פחות תוכן U6 מכפי שהוצגו באיור 4. מאחר והרמה של U6 במדגם מוצג ב4C היא 75% פחות מלכתחילה מזו שהוצגה ב4B פנל, השתנות טכנית יותר צפויה בשל התפלגות פואסון של תמלילים, שהוחמרה על ידי קטן נפח תגובת 17. כלי שימושי נוסף הוא תמונות בקרת איכות (QC), זמינות ליצוא ברגע שהשלימה הריצה. בחירה של אלה משתמשת בקרינה של רוקס, הצבע הפסיבי נמצא בתמהיל מגיב qPCR, כדי לוודא שכל-חור נטען (איור 5) בצורה נכונה. דרך חור, או אכן en<html> subarray הצמיג, עשוי שלא להיטען בשל מספיק נפח דגימה, אידוי, בועות הנוכחיות בבארות של צלחת מדגם 384 גם, אי להסיר לחלוטין את חותם צלחת מדגם, או פגמים במערכת Accufill או העצות שלה. כל נפרקו דרך החורים חייבים להיות מזוהים, כדי למנוע miRNAs תיוג כ&quot; בלתי ניתן לגילוי &quot;, כאשר במציאות assay לא נטען מעולם. אם בעיה זו היא נתקלה, מאשר כי לפחות 5 μl של המדגם / mastermix הוא נטען לתוך היטב בכל צלחת מדגם 384-היטב, צלחת מדגם centrifuged כראוי לפני הטעינה, חותם נייר נמחק לחלוטין, וOpenArray הטעון השקופית אטומה ולהפעיל בתוך הזמן המוקצב לכל ריצות הרצופות. אם ייתקל בבעיות טעינה עדיין נמשכות, אלה עשויים להיות סביר יותר הנוגעים ליצוו ספציפיים או הרבה מערכים או מתכלה קשורים וסיוע נוסף יש לחפש דרך היצרן. &quot;Src =&quot; / קבצים / ftp_upload / 52,586 / /&gt; 52586fig1.jpg &quot; איור 1: פריסה של דגימות לעבודת מערך Nanofluidics: (א) כל צלחת מדגם 384 גם יכול להחזיק דגימות עד 8 ​​מערכי nanofluidics. (ב) בדילול מלא, cDNA הגברה מראש ממוקם לתוך 8 בארות (2 עמודות על ידי 4 שורות), עם בריכה וברכה ב &#39;בקבוצות 8 היטב סמוכות. כל עיגול מייצג גם אחד. היטב בכל צלחת המדגם (C) יהיה טעון לsubarray אחד של מערך nanofluidics. כל ריבוע קטן מייצג subarray אחד. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig2.jpg" /> איור 2: ניתוח Co-ביחס למשך 96 היטב פלטפורמות קונבנציונליות PCR: Co-יחס בין 20 μl ו -5 כרכי תגובת μl על TaqMan בזמן אמת qPCR באמצעות פלטפורמת צלחת 96-היטב סטנדרטית בערכי CT (39 מחזורים). אנחנו לעומת 4 מיקרו-רנ&quot;א שונה (miR-375, miR-30c, miR-30D וmiR-7) ב 4 דגימות סרום ופלזמה אנושיות שונות. רק 11 נקודות נתונים הם זממו מאז אחרים היו בלתי ניתנות לגילוי. R 2 = 0.92, p = 0.0002. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig3.jpg" /> . איור 3: מחזור פרופיל מירנה באמצעות כרטיסי מערך מיקרופלואידיקה שימוש 2 כרטיסי מיקרופלואידיקה (כרטיס וכרטיס-B), פרופיל של 754 miRNAs נוצר (- B). כפי שניתן לראות כאן, השתמשנו מדגם זהה עבור 2 מערך מיקרופלואידיקה פועל כדי לבדוק שחזור של תוצאות כרטיס מיקרופלואידיקה. אנו הבחנו ביטוי דומה של miRNAs כולל, עם ערכי ה- CT בין 0-19.99 (C - D). יש מעט miRNAs (16 277) עם ערכי ה- CT בין 20-29.99 ומשמעותי הבדלים בין ריצות החוזרות (E - F). שמונים ותשע של 327מיקרו-רנ&quot;א עם ערכי ה- CT גבוהים יותר (30-40) הציג הבדלים משמעותיים בין שני הריצות (G - H). &#160; הנתונים נותחו באמצעות מבחן T לזווג. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig4.jpg" /> איור 4: פרופיל נציג של Curves PCR מוצרי ההגברה: האם דמות מייצגת של עקומות הגברה () בשילוב של כל מטרות מירנה למדגם פלזמה אנושי. Assay לU6 (שליטה משותפת ncRNA) ממוקם בכל subarray. המדגם ב( B) מדגים שונות נמוכות (SD &lt;0.5) ואילו (C) מראה סטיית תקן גבוהה (SD&gt; 0.5) בתוך U6 משכפל. שני הדוגמות טוטהRNA l מבודד מפלזמה אנושית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig5.jpg" /> איור 5: ניתוח QC של מערכי Nanofluidics: בקרת איכות תמונות (QC) של מערך נטען כראוי nanofluidics (משמאל) ומערך nanofluidics נטען באופן שגוי (מימין). הצבע הפסיבי, רוקס (הנוכחי בתמהיל מגיב qPCR), מאיר כדי לציין-חור נטען כראוי. יש המערך מהימין כמה subarrays / דרך חורים שאינם עמוסים בתערובת מגיב qPCR ואלה צריכים להיות מזוהים כPCR תגובות שליליות-שגויות. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיבים </td><td> נפח לכל 5 תגובת μl (μl) </td></tr&gt; <tr><td> מאגר RT (10x) </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td> dNTPs (100 מ&quot;מ) </td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> RNase מעכב </td><td> 0.6 </td></tr><tr><td> nuclease ללא מים </td><td> 1.39 </td></tr><tr><td> Transcriptase הפוך </td><td> 0.33 </td></tr><tr><td> נפח כולל </td><td> 2.33 </td></tr></tbody></table> לוח 1 א: מרכיבי תערובת מגיב RT ב5 μl הכנת תגובת RT בזמן אמת TaqMan qPCR באמצעות פלטפורמת צלחת 96-היטב סטנדרטית. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיבים </td><td> נפח לכל 5 תגובת μl (μl) </td><td> נפח לכל 20 תגובת μl (μl) </td></tr><tr><td> mastermix המהיר PCR (2x) </td><td> 2.5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> assay TaqMan qPCR (20x) * </td><td> 0.25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Nuclease ללאמים </td><td> 1.45 </td><td> 5.8 </td></tr><tr><td> נפח כולל: </td><td> 4.2 </td><td> 16.8 </td></tr></tbody></table> * רכיב assay המבוסס על מירנה נבחרה נבדקה. 1B שולחן: רכיבי תערובת מגיב qPCR ב5 או 20 μl הכנת תגובת qPCR בזמן אמת TaqMan qPCR באמצעות פלטפורמת צלחת 96-היטב סטנדרטית. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיבים </td><td> נפח לכל תגובה (μl) </td></tr><tr><td> Primers Megaplex RT (10x) </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td> dNTPs עם dTTp (100 מ&quot;מ) </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Multiscribe ההפוך transcriptase (50 U / μl) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT מאגר </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 מ&quot;מ) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNase מונעי &amp; #<html> 160; (20 U / μl) </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td> Nuclease ללא מים </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> סה&quot;כ </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> לוח 2 א: מרכיבי תערובת מגיב RT ב5 μl הכנת תגובת RT לפנל TLDA מירנה. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיבים </td><td> נפח לכל תגובה (μl) </td></tr><tr><td> TaqMan קדם המגבר mastermix (2x) </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td> Primers Megaplex קדם המגבר (10x) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> nuclease ללא מים </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> סה&quot;כ </td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> שולחן 2B: רכיבי תערובת מגיב קדם מגבר בהכנת תגובת 25 μl מראש amplication לפנל TLDA מירנה. &quot;Cellspacing =&quot; 0 &quot;&gt; <tbody><tr><td> רכיבים </td><td> נפח לכל תגובה (μl) </td></tr><tr><td> Primers Megaplex RT (10x) </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> dNTPs עם dTTp (100 מ&quot;מ) </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> Multiscribe ההפוך transcriptase (50 U / μl) </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RT מאגר </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td> MgCl 2 (25 מ&quot;מ) </td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNase אינהיביטור (20 U / μl) </td><td> 0.09 </td></tr><tr><td> Nuclease ללא מים </td><td> 0.35 </td></tr><tr><td> סה&quot;כ </td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> לוח 3 א: מרכיבי תערובת מגיב RT ב5 μl הכנת תגובת RT לפנל מירנה nanofluidics מבוסס בדיקה. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> רכיבs </td><td> נפח לכל תגובה (μl) </td></tr><tr><td> TaqMan קדם המגבר mastermix (2x) </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td> Primers Megaplex קדם המגבר (10x) </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td> nuclease ללא מים </td><td> 7.5 </td></tr><tr><td> סה&quot;כ </td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> שולחן 3B:. מרכיבי תערובת מגיב קדם מגבר בהכנת תגובת 25 μl מראש amplication לפנל מירנה nanofluidics מבוסס בדיקה הערה: המשלים האינטראקטיבי להצטיין גיליונות אלקטרוניים הניתנים לשלוש פלטפורמות, כבר מהווה תוספת של 5% כדי לפצות על pipetting שגיאה. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לדוגמא </td><td> לדוגמא חוזרת </td></tr><tr><td> 15.535 </td><td> 16.156 </td></tr><tr><td> 15.471 </td><td> 15.652 </td></tr><tr><td> 15.623 </td><td> 16.063 </td></tr><tr><td> 15.963 </td><td> 15.889 </td></tr><tr><td> 14.006 </td><td> 13.993 </td></tr><tr><td> 14.502 </td><td> 14.623 </td></tr><tr><td> 14.907 </td><td> 14.384 </td></tr><tr><td> 13.732 </td><td> 14.946 </td></tr></tbody></table> לוח 4: מחזור פרופיל U6 מירנה באמצעות כרטיס מערך מיקרופלואידיקה. שימוש בשני כרטיסי מערך מיקרופלואידיקה (A ו- B). CT-ערכים של מירנה שליטת U6 מדוגמה (סה&quot;כ = 8). שפע מירנה שליטת U6 עקבי נצפה בין הריצות.

Watch this Scientific Journal Video about Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs at JoVE.com

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

מיקרו-רנ&quot;א במחזור צמחו לאחרונה כסמנים ביולוגיים מבטיחים וחדשניים לסוגי הסרטן שונים ולמחלות אחרות. המטרה של מאמר זה היא לדון בשלוש פלטפורמות שונות המבוסס על בדיקה בזמן אמת PCR ושיטות שאינן זמינים לכמת ולקבוע את השפע של מיקרו-רנ&quot;א במחזור.

בזמן אמת המבוסס על הבדיקה PCR גישות למדידת כמותית של מיקרו-רנ&quot;א

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Research

JoVE Journal

Biology

Experimental Approaches to Tissue Engineering

גישות ניסויית כדי הנדסת רקמות

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

כמותי Real-Time PCR באמצעות המדעית Thermo Solaris qPCR Assay

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

ניתוח של ביטוי גנים בורר אש אמרלד ( Agrilus planipennis) באמצעות Real Time-PCR כמותי

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

פרופיל של טרום מיקרו RNAs ו רנ&quot;א באמצעות כמותי בזמן אמת PCR (qPCR) מערכים

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

קביעת פרופילים ביטוי גנטיים ג elegans שימוש microarray בזמן אמת PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

סריג מיקרוסקופי לניטור בזמן אמת של אירועי איתות בתאים חיים באמצעות Biosensors Unimolecular

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

כמותי, בזמן אמת, ניתוח של פעילות כריתת מאגר תיקון lysates סלולריים ניצול הנגע ספציפיים משואות מולקולרית

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

תאי יונקים האוטונומיים bioluminescent לניטור רציף וזמן אמת של Cytotoxicity

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag ניתוח - תפוקה גבוהה, בזמן אמת PCR Assay עבור Genotyping Sc2.0

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...