Name: probe-based real-time pcr approaches for quantitative measurement of micrornas
Uploaded: 2015-04-14T15:00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs at JoVE.com

すべての著者はNHMRC CTC、シドニー大学、若年性糖尿病研究財団（JDRF）、オーストラリア、レベッカクーパー財団、オーストラリアのインフラ支援を認める。本研究は、WWをAAH、オーストラリア研究会議（FT110100254）とJDRF、オーストラリア（CRN201314）からの補助金により資金を調達し、RJFとMVJは、すべての湿ったラボ実験を行った、ASJはデータ分析を行った。 WWは最初の草案を書いた。 AAHは、研究を計画し、データを分析した。すべての著者は、読んで、出版のために提出された原稿、図面およびワークシートの最終版に合意した。

<ol>
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物品処理/出版費用は、出版物のために、この原稿の受け入れを、以下、Life Technologies社覆われていた。

正確で再現性のある結果を得るために、プローブベースの定量PCRプロトコル内の重要なステップはRT-製品の同じ体積および濃度は、それぞれのqPCR反応にロードされる）ことを確認1を作ることであり、2）成分の正しい比率とボリュームのために必要定量PCR反応を調製してよく混合し、3）正確かつ一貫性のあるボリュームは、各定量PCR反応に添加され、および、まだ心に留めながら、4）各サンプルと反応混合物の調製および負荷は、可能な限り最短の時間で完了している上記の重要なステップは、先に述べた。 マイクロ流体アレイカードは、適切な遠心分離し、特定のバケットが必要です。各バケットは3カード（空/ロードされた）を保持できます。常にバケットのすべての3つのスロットが占有されていることを確認し、バケットは遠心機の反対スロットに（このバケットが空またはフルいずれか3枚のカードを、また含まれている必要があります）同じようなバケツを置くことでバランスされている。 buckeにカードを配置しながらTホルダーは、8貯水池が上向きに突出して反応ウェルは遠心機の外壁に直面していることを確認してください。室温で1分間331×gでのカードをスピン。最初のスピンの後、遠心分離を開き、視覚的に、反応混合物を確保する384ウェルを介して分配されている。 1より多くの時間のために同じ設定でスピンを繰り返します。バケツからカードを取り出し、8貯水池の各反応混合物のレベルが均一であることを確認してください。貯水池に残った液体ボリューム内の任意の矛盾がさらに使いのカードが不適切にする。 RT-製品の同じ濃度を有するように、RNAの同一の入力濃度は、各RT反応に添加される。総RNA濃度は、マイクロvolumespectrophotometerを用いて測定される。観察260/280比は、血漿/血清から単離されたRNAは1.3と低くすることができる。これは、下流のqPCR関連プロセスに影響を与えるようには見えない、またはデータ30を生成した。同様に、の260/280比ここにテストされたRNAサンプルを観察し、定量PCRんの異常な効果を1.3から1.7の間であった。 そのような生体液からのもののような低RNA含有量のサンプルを使用する場合には、処理の前にRNAを定量することは困難である。私たちは、RNA単離での合成スパイクでの使用だけでなく、逆転写ステージをお勧めします。我々の経験では、 シロイヌナズナのmiRNA候補（ATH-のmiR-159AとATH-のmiR-172A）は、我々の経験では、より高いがある可能性があり（例えばCEL-のmiR-39またはCEL-のmiR-54のような） 線虫（Caenorhabditis elegans）の miRNAは、より好ましいAからのものよりも相同性シロイヌナズナ 。このような時期特異的スパイクインの使用は、異なる時点でアッセイし、複数の試料にわたってmiRNAのデータの正規化を考慮することができる。 cDNA合成反応のためのRNAの固定入力ボリュームを使用すると、32,33とが推奨される。 ここで説明したmiRNA定量化のための3つのプローブベースのプロトコルは、様々な量を必要とするトータルRNAインプット、異なるワークフローとコストの。ワークフローの各々は、miRNA標的の数と分析されるサンプルの数に基づいて、異なるスループットに対応するために設計されている。スループットを向上させる（384 rxnの3072 rxnは96 rxnが）で、反応あたりのコストは、単位時間にわたって得られたデータの量の増加に伴って減少する。これらのプラットフォームのすべてのTaqMan化学を利用するので、得られたデータの品質が類似していることが期待できる。のTaqMan qPCRに、血清/血漿試料9,11,27におけるmiRNAの存在量を同定するための十分に確立された方法である。ここで説明した3つのプラットフォームは、同じ化学的性質を共有するが、反応体積の減少は、転写産物の検出のダイナミックレンジの低下（ファーRJ ら 、未発表データ）につながる。 96ウェルのqPCRプラットフォームは低いスループットが、高感度·プラットフォームと我々の見解では、すべてのプローブベースのための「ゴールドスタンダード」（または系色素）をPCRプラットフォームです。しかし、これはよいサンプルの数百または数千のアッセイし、複数のマイクロRNAのためにされている場合、最も経済的または効率的なプラットフォームではない。マイクロフルイディクス（TLDA）およびナノ流体工学（OA）のプラットフォームは、より短い時間で大量のデータの取得を可能にするように設計された高スループット/コンテンツ·プラットフォームである。バッチ差がTLDAカードで観察されているが、これは、同じバッチからTLDAカードを要求することによって最小化することができる。本件契約カードの異なるバッチで同じサンプルを用いて試験した場合に低量miRNAは-私たちは、本件契約のプラットフォーム（ 図3）は半ばの17％の大幅な変動を示したことを観察。そこで、本件契約カードを使用して分析のための同じバッチ番号を使用することをお勧めします。この変化はまた、任意の潜在的なロードやペッティングエラーを含む技術的な変動に起因する可能性があります。しかし、我々は、本件契約カードの同じバッチを要求/ご注文をお勧めします。有意なバッチ変動はOAプラットフォーム上で観察されなかった。これにもかかわらず、TaqManに基づくexperimenTAL定量PCRは、血漿/血清サンプルにおけるmiRNAの豊かさを測定するためにオファーしやすさに近づく。ここで説明した低、中、高スループットのアプローチは非常に効率的で再現性のあるクリーンな（低バックグラウンドノイズ）化学を用いて試料およびmiRNAの範囲を分析するための柔軟性を提供する。

マイクロRNA（miRNA）は、遺伝子発現1-3の調節因子として機能する、約22ヌクレオチドの非コード（ncの）RNAである。動物におけるほとんどのmiRNAは、遺伝子発現2-4の負の調節をもたらす3 &#39;UTRを標的とする、mRNAとの配列特異的塩基対形成を介して機能する。これは通常、mRNAの翻訳の阻害を介してまたはリボソームドロップオフによって起こる。循環中のmiRNAは、糖尿病5-7、卵巣8、9前立腺および乳癌10,11、B型肝炎12及び他の自己免疫疾患13として種々の疾患の研究および臨床分野における新規バイオマーカーであることが示されている。研究は、よりアクセス可能と9,11-15低侵襲であり、ヒト血漿および血清試料から異なる細胞または組織における、ならびに循環中の豊富なmiRNAを同定するために行われている。 のmiRNA定量化するさまざまな方法は、電子てきたそのような標準的な96ウェルプレートプラットホーム4,12,16-18、マイクロ流体カードプラットフォーム12,18-23とナノ流体工学アレイプラットフォーム17,24などの複数のプラットフォームを使用して、定評。定量的リアルタイムPCR（定量PCR）は、複数の（色素増またはプローブベース）の化学を用いて転写物の相対または絶対数を測定する能力を提供しています。プローブベースのリアルタイムPCR化学は、単一の転写コピーを検出するために、低バックグラウンド蛍光と高感度の利点を提供しています。これは、比較的それmiRNA発現25を定量化し、決定するための好まれる方法作る、効果的な使い方が簡単かつ再現性の高いコストです。プローブベースの定量PCR法は、一般的に2つのステップを含む：転写（RT）および定量PCR 4,26,27を逆転。ステム - ループRTプライマーは、成熟またはプライマリmiRNA分子にハイブリダイズし、相補的な（c）のDNAに変換されるRTある。 cDNA産物の定量は、その後miRNA特異的PCRプライマーを用いて行われる26-28。プローブベースの定量PCRの原理は、蛍光タグ化プローブの加水分解を伴うリアルタイムで相補鎖伸長の検出に基づいている。これらのプローブは、蛍光レポーターおよびFRET（蛍光共鳴エネルギー移動）できるようにするだけ離れている消光剤を含むように設計されている。蛍光レポーター（エミッタ）からの発光の検出は、クエンチャー分子に近接によってマスクされます。 Taqポリメラーゼ（polの）を上流プライマーから延びており、フォーク（プローブの5 &#39;末端）に達すると、Taqポリメラーゼのpolエキソヌクレアーゼ活性は、消光剤からの蛍光発光の物理的な解離/分離をもたらす、プローブを加水分解する。蛍光発光体の単一分子のこのリリースでは、検出器によって記録され、そのほか/反応からの蛍光シグナルの増加分として提示されている。蛍光の増加は、正確なquのを可能にする、生成されたPCR産物の量に比例する増幅された標的26,28のantification。 miRNAの定量における需要の増加とともに、ハイスループット技術の媒体は、多くのサンプルを短時間で処理することができるように開発されてきた。のTaqMan低密度アレイ（TLDA）は一方のプレート上で分析したmiRNAの数の増加を提供するプローブベースの定量PCR化学に基づく培地スループット革新的なマイクロ流体設計である。 TLDAは、cDNAを合成するために使用されるRT-プライマーの事前定義されたプールの使用を含む。これらのcDNAは、その後のqPCR 22,26,29を使用して、複数のmiRNAの発現を決定するために、カスタマイズされた384ウェルマイクロ流体カードに紡糸される。カードの各ウェルは、したがって、最大384の反応は、単一のTLDAカード26で処理することができ、特定のmiRNA（単数または複数）を増幅するために乾燥されたプライマーおよびプローブを含んでいる。 ナノ流体アレイは、遺伝子転写物の検出のために使用されるハイスループットプラットフォームである<sup&gt;同一のプローブベースの化学を用いて24。また、貫通孔ステンレス鋼スライド24上の3072の配列に33ナノリットルの反応混合物の簡単な取り付けを容易にするために、疎水性-親水性相互作用を提供する独自のマトリックスを利用する。この記事では、血清/血漿中のmiRNAを定量化するため、これらのメソッドを実行し、実行し、このようなデータを解釈する際に考慮しなければならない重要な要因であるかを証明するに焦点を当てています。アカウントに連れて行かれ、彼らの個々の利点と制限は、この記事で説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well-platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Assays INV SM&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4427975</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 
			The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4366597 or 4366596</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 
			The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For qPCR run on a 96-well platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4367846</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 
			The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on&#160; the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4346907</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics platform (TLDA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399966</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444281</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>OR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444750</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 
			The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4391128 or 4488593</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 
			The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444303</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399233</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE Buffer (100 mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12090-015</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product 
			The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444913</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofluidics platform (OpenArray)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel)</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4470187</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4469576</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray 384-well Sample Plates&#160;&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4406947</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4462159</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray AccuFill System Tips&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4457246</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129117</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probe-based real-time pcr approaches for quantitative measurement of micrornas

プローブベースの定量的PCR（qPCRに）それが正確で再現性のある分析を提供する最も高感度な検出方法の一つであるので、転写産物量を測定するための好まれる方法である。プローブベースの化学は、他の（染料系）の化学的性質と比較して、少なくともバックグラウンド蛍光を提供しています。現在、転写産物量を定量するためにプローブベースの化学を使用して利用可能ないくつかのプラットフォームがあります。 96ウェルプレート中のqPCRしかし96サンプルまたはmiRNAの最大値のみが単一のランで試験することができる最も日常的に使用される方法である。多数のサンプル/ miRNAが分析される場合、これは時間がかかり、面倒である。そのようなマイクロフルイディクス（ 例のTaqManアレイカード）などの高スループットプローブベースのプラットフォームとナノ流体工学アレイ（ 例えば OpenArray）を提供し、再現性と効率的に短時間で多数の試料内の複数のマイクロRNAの存在量を検出することが容易になります。ここでは、実験aを実証血清または血漿、EDTA試料からのmiRNAの定量のため番目プロトコル、スループットの増加レベルを提供するプローブベースの化学3つの異なるプラットフォーム（96ウェルプレート、マイクロ流体及びナノ流体アレイ）を使用。

miRNAプローブに基づくアッセイの定量PCR反応のための推奨される容量は20μlである。注：我々は、5μlの反応体積は20μl容量4,7,30を使用して達成されるものと同様の結果を生成することが可能であることを確認した。 5μlに反応容量を小さくすると感度がかなりの損失なしに、試薬コストの75％の減少を可能にする。 図2に示されたように、反応を20μlの体積および5μlをアップ（0.92のR 2、P = 0.0002で）39サイクルまで、強力な共同関係を示している。 マイクロ流体アレイは、従来の96ウェルプレートのPCRと比較して複数のサンプルを分析するより効率的な方法であり、（AカードとカードBの場合）約5時間で、サンプル中で発現されたmiRNA 754上のデータを取得するためのツールを提供する。私たちは（試料Aと繰り返しサンプル）同じサンプル用のmiRNAマイクロ流体アレイカードを比較した図3A - 。Bは、ブランド·アルトマンプロットを示している（&lt;これらのサンプルのために試験されたすべての754のmiRNAのための強力な&gt; 3A）および相関プロット（3B）。 3異なる制御のmiRNA（U6、RNU44とRNU48）が複数の場所にカード（カードAとB）の両方にランダムに配置されています。 U6サイクル閾値（Ct）値は2実行の間を比較すると、我々は、値（ 表4）の間に有意差は観察されなかった。これは、U6を評価サンプルにおいてより豊富（低いCt値）で発現されることをここで留意することも重要である。私たちは、その後の共同効率的な98パーセント（図3C-D）の決定に全体的なmiRNAの同様の発現を持っていたラン（N = 150）の両方で0から19.99の間のCt値を持つすべてのmiRNAを、比較した。 betwee有意差とのmiRNAの数。 -両方のランで20と29.99の間のCt値を持つすべての277のmiRNAの、16のmiRは、オリジナルを繰り返し実行する（F図3E）との間で有意に異なっCt値は、両方のラン（ - H図3G）のために30〜40の間で選択されたときのnランは（327の89）増加した。 ナノ流体アレイプラットフォームは、図4Aに示されるように、試験した各血清/血漿試料からの754のmiRNAのためのデータを提供する。なお、これらの増幅曲線を検討することが重要である-それは、すべてのqPCRであるように-結果が真の増幅の指標であることを保証する。 48サブアレイの各（ 図1）は、3最も人気のある「ハウスキーピング」のncRNAのアッセイが含まれています。U6は、RNU44とRNU48 図4Bは、U6の典型的なクラスタリングは、単一のサンプルから複製し示しています。これらの複製は、低い標準偏差（SD &lt;0.5）を表示するので、信頼性の指標である。また、 図4Cは、第二の試料中のU6の複製物（SD&gt; 0.5）の増加の変動を示しています。これは妥当Oを否定するものではない残りのアッセイF、それはより徹底的な批判を必要としませんが。 U6は、生物学的流体中で最も「ハウスキーピング」のmiRNAと同様に、変数式を持つことができます。これは、 図4Cに概説試料の一つは、 図4Bに示すものよりも4倍未満U6コンテンツを表示することに留意すべきである。 （c）に提示され、サンプル中のU6のレベルは、パネル4Bに提示され1よりで始まる75％未満であることから、より大きな技術的変動が小さいため反応容量17によって悪化する転写産物のポアソン分布に期待されている。 実行が完了すると別の有用なツールでは、輸出のために利用可能な品質管理（QC）の画像、である。これらの選択は、各貫通孔が正常（ 図5）にロードされたことを確認するために、ROX、定量PCR試薬混合物中に見出さ受動染料の蛍光を使用する。エンスルーホール、または実際に<html>タイヤのサブアレイは、不十分な試料体積、蒸発、384ウェルサンプルプレート、完全Accufillシステムまたはそのチップ内のサンプルプレートシール、または欠陥を除去するための失敗のウェル中に存在する気泡によって読み込まれない場合があります。実際に検定がロードされなかったときに貫通孔アンロードはいずれも、「検出できない」として、標識miRNAを回避するために識別されなければならない。この問題が発生した場合、サンプル/マスターミックスの少なくとも5μlを384ウェルサンプルプレートの各ウェルにロードされていることを確認し、サンプルプレートが適切に装填する前に遠心分離し、ホイルシールが完全に除去され、そしてロードOpenArrayスライドを密封し、すべての連続した​​ランの割り当てられた時間内に実行されます。負荷の問題がまだ解決しない場合は、これらは、より可能性が高い特定のバッチや配列または関連消耗品の多くは、さらなる支援に関連することができる製造業者を通じて求められるべきである。 「SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 52586 / 52586fig1.jpg&quot; /&gt; 図1：ナノ流体アレイワークフローのサンプルのレイアウト：（A）各384ウェルサンプルプレートは、最大8ナノ流体工学アレイのためのサンプルを保持することができる。 （B）で希釈し、事前に増幅されたcDNAは、隣接する8ウェルのグループにプールAとプールBで、8ウェル（4行による2列）に配置されます。各円は、1つのウェルを表す。 （C）サンプルプレートの各ウェルは、ナノ流体工学アレイの一サブアレイにロードされる。各小正方形は1部分配列を表す。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig2.jpg" /> 図2：従来の96ウェルPCRプラットフォームの共同関係の分析：20μLとCT値（39サイクル）における標準的な96ウェルプレートプラットフォームを使用したTaqManリアルタイム定量PCRに5μlの反応ボリューム間の共同関係。私たちは、4種類のマイクロRNAを比較した（のmiR-375、4種類のヒト血清および血漿試料におけるmiR-30C、のmiR-30DとのmiR-7）。他は検出できなかったので、唯一の11のデータ点がプロットされている。 R 2 = 0.92のp = 0.0002。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig3.jpg" /> 。図3：（ - B A）マイクロ流体アレイカードを使用してmiRNAプロファイリング循環 2マイクロ流体カード（カードAとカード-B）を使用して、754のmiRNAプロファイルが生成される。ここに示されているように、我々は、マイクロ流体カード結果の再現性を確認するために2マイクロ流体アレイを実行するために、同じサンプルを使用した。私たちは、0から19.99の間のCt値と、全体的なmiRNAの同様の発現を観察した（C - D）。繰り返し実行間20から29.99と有意差（ - F E）間のCt値を持つ少数のmiRNA（277の16）があります。 327の八十9より高いCt値を持つマイクロRNA（30〜40）は、両方のラン（ - H G）の間に有意差を示した。 &#160;データは、対応のあるt検定を用いて分析している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig4.jpg" /> 図4：PCR産物の増幅曲線の代表的なプロフィール：ヒト血漿サンプルのためのすべてのmiRNA標的の組み合わせ（A）の増幅曲線の代表図である。 U6のためのアッセイ（共通制御ncRNAの）は、すべての部分配列に配置されます。 &lt;（0.5（C）は 、高い標準偏差SD）を示している（0.5（B）のサンプルは低い変動SD）を&gt;示していU6内で複製されます。両サンプルを踏太ですヒト血漿から分離され、LのRNA。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig5.jpg" /> 図5：ナノ流体工学配列のQC分析：正しくロードされたナノ流体工学アレイ（左）と間違ってロードされたナノ流体工学アレイ（右）の品質管理（QC）の画像。 （定量PCR試薬混合物中に存在する）受動染料、ROXは、正しくセットされた貫通孔を示すために蛍光を発する。右側のアレイは、貫通孔定量PCR試薬混合物を装填していないと、これらは偽陰性PCR反応として特定されるべきいくつかのサブアレイ/持つ。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> 5μlの反応あたり容量（μL） </td></TR&gt; <tr><td> RTバッファー（10倍） </td><td> 0.5 </td></tr><tr><td>のdNTP（100 mM）を</td><td> 0.05 </td></tr><tr><td> RNaseインヒビター</td><td> 0.6 </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 1.39 </td></tr><tr><td>逆転写酵素</td><td> 0.33 </td></tr><tr><td>全容積</td><td> 2.33 </td></tr></tbody></table> 表1A：RT試薬混合物の成分のTaqManリアルタイム定量PCRのために、5μlのRT反応の調製における標準的な96ウェルプレートプラットホームを使用する。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td>コンポーネント</td><td> 5μlの反応あたり容量（μL） </td><td> 20μlの反応あたり容量（μL） </td></tr><tr><td>ファストPCRマスターミックス（2×） </td><td> 2.5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td>のTaqMan定量PCRアッセイ（20X）* </td><td> 0.25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 1.45 </td><td> 5.8 </td></tr><tr><td>総容積： </td><td> 4.2 </td><td> 16.8 </td></tr></tbody></table> *テストし、選択したmiRNAに基づいたアッセイ成分。 表1B：標準的な96ウェルプレートプラットホームを用いたTaqManリアルタイム定量PCRのために5または20μlの定量PCR反応の調製における定量PCR試薬混合成分。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> 反応あたり容量（μL） </td></tr><tr><td>メガプレックスRTプライマー（10倍） </td><td> 0.8 </td></tr><tr><td>のdTTP（100 mM）を持つのdNTP </td><td> 0.2 </td></tr><tr><td> Multiscribe逆転写酵素（50 U /μL） </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RTバッファー</td><td> 0.8 </td></tr><tr><td>のMgCl 2（25 mM）の</td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNアーゼ阻害剤＆＃<html> 160。 （20 U /μL） </td><td> 0.1 </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 0.2 </td></tr><tr><td>合計</td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> 表2A：本件契約のmiRNAパネルの5μlのRT反応の準備におけるRT試薬混合コンポーネント。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> 反応あたり容量（μL） </td></tr><tr><td>のTaqMan PreAmpのマスターミックス（2×） </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td>メガプレックスプリアンププライマー（10倍） </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 7.5 </td></tr><tr><td>合計</td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> 表2B：本件契約のmiRNAパネル用の25μlのプレamplication反応準備プリアンプ試薬混合コンポーネント。 「CELLSPACING = &quot;0&quot;&gt; <tbody><tr><td> コンポーネント </td><td> 反応あたり容量（μL） </td></tr><tr><td>メガプレックスRTプライマー（10倍） </td><td> 0.75 </td></tr><tr><td>のdTTP（100 mM）を持つのdNTP </td><td> 0.15 </td></tr><tr><td> Multiscribe逆転写酵素（50 U /μL） </td><td> 1.5 </td></tr><tr><td> 10X RTバッファー</td><td> 0.75 </td></tr><tr><td>のMgCl 2（25 mM）の</td><td> 0.9 </td></tr><tr><td> RNアーゼ阻害剤（20 U /μL） </td><td> 0.09 </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 0.35 </td></tr><tr><td>合計</td><td> 4.5 </td></tr></tbody></table> 表3a：プローブベースのナノ流体工学のmiRNAのパネルの5μlのRT反応の準備におけるRT試薬混合コンポーネント。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> コンポーネントS </td><td> 反応あたり容量（μL） </td></tr><tr><td>のTaqMan PreAmpのマスターミックス（2×） </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td>メガプレックスプリアンププライマー（10倍） </td><td> 2.5 </td></tr><tr><td>ヌクレアーゼフリー水</td><td> 7.5 </td></tr><tr><td>合計</td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> 表3B：プローブベースのナノ流体工学のmiRNAのパネル用の25μlのプレamplication反応準備プリアンプ試薬混合コンポーネントは、注：3つのプラットフォームのために提供インタラクティブな補助的なExcelスプレッドシートは、すでにペッティング誤差を補償するために5％の追加を占める。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> サンプルA </td><td> リピートサンプル </td></tr><tr><td> 15.535 </td><td> 16.156 </td></tr><tr><td> 15.471 </td><td> 15.652 </td></tr><tr><td> 15。623 </td><td> 16.063 </td></tr><tr><td> 15.963 </td><td> 15.889 </td></tr><tr><td> 14.006 </td><td> 13.993 </td></tr><tr><td> 14.502 </td><td> 14.623 </td></tr><tr><td> 14.907 </td><td> 14.384 </td></tr><tr><td> 13.732 </td><td> 14.946 </td></tr></tbody></table> 表4：マイクロ流体アレイカードを使用してのmiRNA U6プロファイリングを循環。 2マイクロ流体アレイカード（AおよびB）を使用して。サンプルAからU6制御miRNAのCtの値（合計= 8）。ランの間で観察一貫したU6制御のmiRNA豊富。

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Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

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