Name: probe-based real-time pcr approaches for quantitative measurement of micrornas
Uploaded: 2015-04-14T15:00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs at JoVE.com

Todos os autores agradecem o apoio de infra-estrutura do NHMRC CTC, da Universidade de Sydney, a Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF), Austrália e Cooper Fundação Rebecca, Austrália. Esta pesquisa foi financiada através de doações do Conselho Australiano de Investigação (FT110100254) eo JDRF, Austrália (CRN201314) para AAH WW, RJF e MVJ realizada toda a experimentação laboratório molhado, ASJ realizada análise dos dados. WW escreveu o primeiro rascunho. AAH planejou o estudo e análise dos dados. Todos os autores leram e aprovaram a versão final do manuscrito, figuras e planilhas submetidos para publicação.

<ol>
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Artigo custos de processamento / publicação foram cobertos pela Life Technologies, na sequência da aceitação do manuscrito para publicação.

Os passos críticos dentro dos protocolos de qPCR à base de sondas para obter resultados precisos e reprodutíveis são certificar-se 1) o mesmo volume e concentração de RT-produto é carregado em cada reacção qPCR, 2) as proporções correctas e volumes dos componentes necessários para reação qPCR são preparados e bem misturado, 3) os volumes corretos e coerentes são adicionados a cada reação qPCR, e 4) a preparação e carregamento de cada mistura de amostra e reação se completa no menor espaço de tempo possível, enquanto ainda consciente de as etapas críticas acima mencionado anteriormente. Os cartões de matriz microfluidos precisa centrífuga adequado e baldes específicos. Cada balde pode conter até 3 cartões (carregado / vazio). Sempre garantir que todos os 3 slots de um balde são ocupados eo balde é equilibrado, colocando balde semelhante (esta balde também deve conter três cartões, vazios ou cheios) no slot oposto da centrífuga. Além de colocar o cartão no bucketitular t, certifique-se de que os oito reservatórios projetar para cima e poços de reacção enfrentar a parede externa da centrífuga. Rodar as placas a 331 xg durante 1 min à temperatura ambiente. Após a primeira rodada, abra a centrífuga e visualmente garantir a mistura de reacção foi distribuída através dos 384 poços. Repita o spin em mesmas configurações para mais uma vez. Remova a placa do balde e assegurar que o nível de mistura de reacção em cada um dos 8 reservatórios é uniforme. Qualquer inconsistência nos volumes líquidos deixados nos reservatórios fazer o cartão inapropriado usar mais. Para ter a mesma concentração do produto de RT, mesma concentração de entrada de ARN é adicionado em cada reacção de RT. A concentração de ARN total é medido usando um micro-volumespectrophotometer. A relação observada 260/280 pode ser tão baixo como 1.3 para o ARN isolado a partir de plasma / soro; isto não parece ter um efeito sobre o processo relacionados com qPCR jusante ou dados gerados 30. Da mesma forma, a razão de 260/280as amostras de ARN foram testadas aqui entre 1,3-1,7 com nenhuns efeitos anormais no qPCR observados. Quando o conteúdo de RNA usando amostras baixos, tais como aqueles a partir de fluidos biológicos, pode ser difícil de quantificar o ARN antes do processamento. Recomendamos o uso de sintéticos spike-in no isolamento do RNA, bem como as etapas de transcrição reversa. Em nossa experiência, os candidatos Arabidopsis thaliana miRNA (ATH-miR-159A e ATH-miR-172a) têm preferência sobre Caenorhabditis elegans miRNAs (como cel-miR-39 ou cel-miR-54), que, em nossa experiência pode ter maior homologia do que aqueles a partir de A. thaliana. O uso de tais específicos do estágio spike-in pode ser responsável pela normalização dos dados de miRNA em múltiplas amostras testadas em momentos diferentes. Utilizando um volume de entrada fixa de ARN para a reacção de síntese de ADNc também é recomendado 32,33. Os três protocolos baseados sonda para miRNA quantificação descrito aqui requerem quantidades variáveisdo total de entrada de RNA, diferentes fluxos de trabalho e custos. Cada um dos fluxos de trabalho são concebidos para atender a diferentes processamentos com base no número de alvos de miARN e o número de amostras a serem analisadas. Com aumento da taxa de transferência (96 rxn 384 rxn 3072 rxn), o custo por reacção diminui com um aumento na quantidade de dados obtidos através de uma unidade de tempo. Uma vez que todas estas plataformas utilizar TaqMan química, a qualidade dos dados obtidos pode ser esperado que seja semelhante. TaqMan qPCR é um método bem estabelecido para identificação da abundância de miARNs em amostras de soro / plasma 9,11,27. Embora as três plataformas discutidos aqui partilham a mesma composição química, uma diminuição no volume de reacção conduz a uma diminuição da gama dinâmica de detecção de transcrição (RJ Farr et ai., Dados não publicados). A 96 poços plataforma qPCR é um rendimento mais baixo, mas plataforma de alta sensibilidade e, em nossa opinião, o &quot;padrão ouro&quot; para todos (ou corante base) à base de sonda plataformas de PCR. No entanto, isso podenão ser a plataforma mais econômica ou eficiente se várias centenas ou milhares de amostras estão sendo analisadas e para vários microRNAs. Microfluídica (TLDA) e nanofluidics plataformas (OA) são plataformas de alto rendimento / conteúdos projetados para permitir a aquisição de dados maior em um tempo menor. Embora as diferenças de lote foram observadas nas placas de TLDA, isto pode ser minimizado pela requerente TLDA cartões do mesmo lote. Observa-se que a plataforma TLDA (Figura 3) mostrou variação significativa em 17% dos mid - miRNAs de baixa abundância, quando testado utilizando a mesma amostra em diferentes lotes de TLDA cartões. Recomendamos, portanto, usando os mesmos números de lote para análise utilizando TLDA cartões. Essa variação também pode ser devido à variabilidade técnica, incluindo quaisquer erros de carga e de pipetagem potenciais. No entanto, recomendamos ordenação / solicitando o mesmo lote de TLDA cartões. Não houve variação significativa lote foi observada na plataforma OA. Apesar disso, TaqMan experimen basetal qPCR abordagens oferecem facilidade para medir a abundância de miRNAs em amostras de plasma / soro. As abordagens de rendimento baixo, médio e alto discutidos aqui oferecem a flexibilidade para analisar uma série de amostras e miRNAs usando um (baixo ruído de fundo) química altamente eficiente, reprodutível e limpo.

Os microRNAs (miRNAs) são ~ 22 nucleotídeos não-codificante (NC) RNAs, funcionando como reguladores da expressão gênica 1-3. A maioria dos animais em miARNs funcionar através específica da sequência emparelhamento de bases com um mRNA, tendo como alvo a UTR 3 &#39;, o que conduz a regulação negativa da expressão do gene 2-4. Isso geralmente ocorre através da inibição da tradução do mRNA ou por ribossômica drop-off. miARNs em circulação têm sido mostrados para ser novos biomarcadores em campos clínicos e de pesquisa para uma variedade de doenças, tais como diabetes 5-7, 8 ovário, próstata e cancro da mama 9 10,11, hepatite B e 12 outras doenças auto-imunes 13. A investigação foi conduzida para identificar miARNs abundantes em diferentes células ou tecidos, bem como em circulação a partir do plasma humano e amostras de soro, o que é mais acessível e menos invasiva 9,11-15. Diferentes métodos de quantificação foram miARN eriado usando várias plataformas, como a plataforma padrão em placas de 96 poços 4,12,16-18, a plataforma de cartão de microfluídica 12,18-23 ea plataforma matriz nanofluidics 17,24. -PCR quantitativo em tempo real (qPCR) oferece a capacidade de medir números relativos ou absolutos de transcrições usando múltipla (dye- ou à base de sonda) químicas. Baseada em sonda em tempo real química PCR oferece a vantagem de baixa fluorescência de fundo e elevada sensibilidade para detectar uma única cópia de transcrição. É relativamente eficientes, simples de usar e altamente reprodutível, tornando-se um método preferido para a quantificação e determinação miRNA expressão 25. QPCR método baseia-sonda geralmente envolve dois passos: transcrição (RT) e qPCR 4,26,27 reversa. RT é onde o iniciador de haste-laçada RT é hibridado com uma molécula de miARN madura ou primário e convertido em (c) ADN complementar. A quantificação do produto de cDNA é então levada a cabo usando iniciadores de PCR específicos de miARN26-28. O princípio baseia-qPCR de sonda baseia-se na detecção da extensão de cadeia complementar, em tempo real, o que envolve a hidrólise da sonda fluorescente marcada com. Estas sondas são concebidas para conter um repórter fluorescente e um extintor que são apenas para além de permitir TERF (transferência de energia de fluorescência de ressonância). Detecção da emissão do repórter de fluorescência (emissor) é mascarada pela proximidade da molécula de extintor. Quando a Taq polimerase (pol) estende-se desde o iniciador a montante e chega a uma bifurcação (extremidade 5? Da sonda), a actividade de exonuclease de pol Taq hidrolisa a sonda, o que leva a uma dissociação física / separação do emissor do quencher fluorescente. Esta libertação de uma única molécula de fluorescência emissor é registado pelo detector e apresentado como um aumento gradual no seu sinal de fluorescência a partir desse bem / reacção. O aumento de fluorescência é proporcional à quantidade de produto de PCR gerado, permitindo que um qu precisasantification do alvo amplificado 26,28. Com o aumento da procura de miARN quantificação, médio e tecnologias de elevado rendimento têm sido desenvolvidos para permitir que um maior número de amostras a ser processado em um curto espaço de tempo. TaqMan matriz de Baixa Densidade (TLDA) é uma concepção inovadora de microfluidos de médio rendimento com base em baseada em sonda qPCR química oferecendo um aumento no número de miARNs analisadas sobre um prato. TLDA envolvem a utilização de uma piscina predefinido de RT-iniciadores que são utilizados para sintetizar o ADNc. Estes ADNc são depois girado em um cartão personalizado 384 bem micro-fluídico para determinar a expressão de vários miARNs utilizando qPCR 22,26,29. Cada poço da placa contém seca iniciadores e sondas para amplificar miARN (s) específico, até 384, por conseguinte, as reacções podem ser transformados em cartão único TLDA 26. A matriz nanofluidics é uma plataforma de alto rendimento, que é utilizado para a detecção de transcritos do gene <sup&gt; 24 usando a mesma química à base de sonda. Ele utiliza uma matriz de propriedade oferecendo interacções hidrofóbicas-hidrófila para facilitar o carregamento da mistura de reacção de 33 nanolitros em uma matriz de 3072 por meio de furos de passagem sobre uma lâmina de aço inoxidável 24. Este artigo centra-se na demonstração de como esses métodos de quantificação miRNAs no soro / plasma são realizados e os fatores críticos que devem ser considerados quando se realizar e interpretar esses dados. Levado para a conta, seus benefícios e limitações individuais será discutido neste artigo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well-platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Assays INV SM&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4427975</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 
			The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4366597 or 4366596</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 
			The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For qPCR run on a 96-well platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4367846</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 
			The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on&#160; the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4346907</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics platform (TLDA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399966</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444281</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>OR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444750</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 
			The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4391128 or 4488593</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 
			The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444303</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399233</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE Buffer (100 mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12090-015</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product 
			The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444913</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofluidics platform (OpenArray)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel)</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4470187</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4469576</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray 384-well Sample Plates&#160;&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4406947</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4462159</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray AccuFill System Tips&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4457246</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129117</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probe-based real-time pcr approaches for quantitative measurement of micrornas

Baseada em sonda de PCR quantitativa (qPCR) é um método preferido para medir a abundância de transcritos, uma vez que é um dos métodos de detecção mais sensíveis que fornece uma análise precisa e reprodutível. Química baseada em sonda oferece a menor fluorescência de fundo em comparação com outros (à base de corantes) químicos. Atualmente, existem várias plataformas disponíveis que a química baseada em uso de sonda para quantificar abundância transcrição. qPCR em uma placa de 96 poços é o método mais utilizada de rotina, no entanto, apenas um máximo de 96 amostras ou miARN pode ser testada num único ensaio. Isto é muito demorado e fastidioso se um grande número de amostras / miARNs estão a ser analisados. Plataformas baseadas em sonda de alto rendimento, como microfluídica (por exemplo, cartão matriz TaqMan) e matrizes nanofluidics (por exemplo OpenArray) oferecem facilidade para reprodutível e eficiente detectar a abundância de vários microRNAs em um grande número de amostras em um curto espaço de tempo. Aqui, demonstramos a uma configuração experimentalnd miARN protocolo para a quantificação de amostras de soro ou plasma com EDTA, usando produtos químicos à base de sonda e três plataformas diferentes (placa de 96 poços, e matrizes de microfluidos nanofluidics) oferecendo níveis crescentes de rendimento.

O volume recomendado para uma reacção qPCR ensaio à base de miARN sonda é de 20 ul. NOTA: Confirmou-se que um volume de reacção de 5 ul é capaz de produzir resultados semelhantes aos obtidos usando 20 ul de volume 4,7,30. Diminuindo o volume de reacção para 5 ul permite uma redução de 75% nos custos de reagentes sem perda significativa de sensibilidade. Como apresentado na Figura 2, os volumes de reacção de 20 ul e 5 ul mostram uma forte correlação até 39 ciclos (com r 2 de 0,92, p = 0,0002). Microfluidics matriz fornece uma ferramenta para a obtenção de dados sobre 754 miRNAs expressos em uma amostra em cerca de 5 horas (para o cartão e um cartão B), que é uma forma mais eficiente de analisar amostras múltiplas em comparação com 96 PCRs placa convencionais bem. Comparamos miRNA cartões matriz microfluídica para a mesma amostra (amostra A e amostra A repetição) Figura 3A -. B mostra um gráfico de Bland-Altman (&lt;strong&gt; 3A) e curva de correlação (3B) para todos os 754 miRNAs testados para estas amostras. Há 3 miRNAs de controle diferentes (U6, RNU44 e RNU48) colocadas aleatoriamente em ambos os cartões (CARD A e B) em vários locais. Quando os valores de limite de ciclo U6 (TC) são comparados entre as duas corridas, não observamos diferenças significativas entre os valores (Tabela 4). É também importante notar aqui que U6 é expressa em maior abundância (menor valor de Ct) na amostra avaliada. Em seguida, comparou todas miARNs que têm valores de Ct entre 0-19,99 em ambas as passagens (n ​​= 150), que tinham de expressão semelhante miARNs global com um coeficiente de determinação de 98% (Figura 3C-D). De todos os 277 miRNAs que têm valores Ct entre 20 e 29,99 em ambas as corridas, 16 miRs diferiu significativamente entre os originais e repita runs (Figura 3E - F) O número de miRNAs com diferença significativa betwee.n as corridas aumentou (89 de 327), quando foram selecionados os valores Ct entre 30-40 para ambas as corridas (Figura 3G - H). A plataforma matriz nanofluidics fornece dados para miARNs 754 de cada amostra de soro / plasma testado, tal como representado na Figura 4A É importante examinar estas curvas de amplificação -. Tal como acontece com todos qPCR - para assegurar que o resultado é indicativo da verdadeira amplificação. Cada um dos 48 subarrays (Figura 1) contém também um ensaio para as três mais populares &quot;limpeza&quot; ncRNAs:. U6, RNU44 e RNU48 Figura 4B ilustra um agrupamento típico da U6 replica a partir de uma única amostra. Essas repetições exibir baixo desvio-padrão (SD &lt;0,5) e por isso são um indicador de confiabilidade. Alternativamente, Figura 4C demonstra o aumento da variabilidade de repetições U6 (DP&gt; 0,5) em uma segunda amostra. Isso não nega a validade of os ensaios restantes, embora não necessitam de uma crítica mais aprofundada. U6, como acontece com a maioria dos miRNAs &quot;limpeza&quot; em fluidos biológicos, pode ter uma expressão variável. Deve notar-se que uma das amostras, descritas na Figura 4C exibe, 4 vezes menos do que o conteúdo U6 apresentado na Figura 4B. Uma vez que o nível de U6 em amostra apresentada na 4C é 75% menos do que começar com o apresentado no painel 4B, uma maior variabilidade técnica é esperado devido à distribuição de Poisson de transcritos, que é agravada pelo pequeno volume de reacção 17. Outra ferramenta útil é as imagens de controle de qualidade (QC), disponíveis para a exportação uma vez que o prazo foi concluída. Uma selecção destes usa a fluorescência de ROX, o corante passiva encontrado na mistura reagente qPCR, para confirmar que cada orifício foi colocado correctamente (Figura 5). A-buraco através, ou mesmo uma casa<html> pneu sub-disposição, não pode carregar em função do volume de amostra insuficiente, evaporação, bolhas presentes nos poços da placa de amostra de 384 poços, a incapacidade de remover completamente a junta da placa de amostra, ou defeitos no interior do sistema Accufill ou suas pontas. Qualquer descarregado orifícios devem ser identificados para evitar miRNAs rotulagem como &quot;indetectável&quot;, quando na realidade o ensaio nunca foi carregado. Se este problema é encontrada, confirmam que, pelo menos, 5 ul de amostra / mastermix é carregado em cada poço da placa de amostra de 384 poços, a placa de amostra é centrifugada adequadamente antes do carregamento, a folha de vedação é completamente removido, e o OpenArray carregado deslizante é vedado e executado dentro do tempo estipulado para todas as corridas sucessivas. Se os problemas de carregamento ainda persistem, estes podem ser mais propensos pertencente ao lote específico ou lote das matrizes ou consumíveis relacionados e mais assistência deve ser procurada através do fabricante. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 52586 / 52586fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Esquema de amostras para o fluxo de trabalho da Matriz Nanofluidics: (A) Cada placa de amostra de 384 poços pode conter amostras para até 8 matrizes nanofluidics. (B) Diluído, cDNA pré-amplificada é colocado em 8 poços (2 colunas por 4 linhas), com tanque e Pool B em grupos de 8 poços adjacentes. Cada círculo representa um poço. (C) A cada poço da placa de amostra irá ser carregado em um sub-disposição da matriz nanofluidics. Cada pequeno quadrado representa um subarray. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig2.jpg" /> Figura 2: A análise de co-relação de 96 poços convencionais plataformas de PCR: A co-relação entre 20 ul e 5 ul em volumes de reacção de TaqMan qPCR em tempo real, utilizando uma plataforma padrão em placas de 96 poços em valores de CT (39 ciclos). Foram comparados quatro microRNAs diferentes (miR-375, miR-30c, 30d e miR-miR-7) em 4 amostras de soro e plasma humanos diferentes. Apenas os 11 pontos de dados estão representados graficamente uma vez que os outros eram indetectáveis. R 2 = 0,92, p = 0,0002. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig3.jpg" /> . Figura 3: Circulação miRNA profiling usando cartões de matriz microfluidics Usando 2 cartões microfluidics (cartão-A e cartão-B), um perfil de 754 miRNAs é gerado (A - B). Como mostrado aqui, usamos mesma amostra para 2 matriz microfluidics corre para verificar a reprodutibilidade dos resultados de cartão de microfluídica. Observou-se uma expressão similar de miRNAs no geral, com valores Ct entre 0-19,99 (C - D). Há poucos miRNAs (16 de 277) com valores Ct entre 20-29,99 e significativas diferenças entre repetição runs (E - F). Oitenta e nove de 327microRNAs com valores mais elevados de Ct (30-40) apresentaram diferenças significativas entre os dois runs (G - H). &#160; Os dados são analisados ​​por meio do teste T pareado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig3large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig4.jpg" /> Figura 4: Perfil Representante da Curves PCR amplificação do produto: é uma figura representativa das curvas (A) de amplificação combinados de todos os alvos miRNA para uma amostra de plasma humano. Um ensaio para U6 (a controle comum ncRNA) é colocado em cada subarray. A amostra em (B) demonstra baixa variabilidade (SD &lt;0,5), enquanto que (C) mostra alto desvio padrão (SD&gt; 0,5) dentro U6 replica. Ambas as amostras são total RNA isolado a partir de plasma humano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig4large.jpg" target="_blank">Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig5.jpg" /> Figura 5: Análise do QC Nanofluidics Arrays: controle de qualidade (QC) imagens de uma matriz nanofluidics carregado corretamente (esquerda) e uma matriz nanofluidics carregado incorretamente (à direita). O corante passiva, ROX (presente na mistura reagente qPCR), fluorescência para indicar um carregado corretamente através de buracos. A matriz da direita tem vários subarrays / furos de passagem que não são carregados com a mistura reagente qPCR e estes devem ser identificados como reações de PCR falso-negativos. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componentes </td><td> Volume por reacção 5 ul (uL) </td></tr&gt; <tr><td> Tampão RT (10x) </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> dNTPs (100 mM) </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> RNase inibidor </td><td> 0,6 </td></tr><tr><td> Água livre de nuclease </td><td> 1,39 </td></tr><tr><td> Transcriptase Reversa </td><td> 0.33 </td></tr><tr><td> O volume total </td><td> 2.33 </td></tr></tbody></table> Tabela 1A: RT componentes da mistura reagente em 5 ul de uma reacção de RT preparação para TaqMan qPCR em tempo real, utilizando uma plataforma padrão placa de 96 poços. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componentes </td><td> Volume por reacção 5 ul (uL) </td><td> Volume por reacção de 20 ul (uL) </td></tr><tr><td> Rápido mastermix PCR (2x) </td><td> 2,5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Ensaio TaqMan qPCR (20x) * </td><td> 0,25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Livre de nucleaseágua </td><td> 1,45 </td><td> 5,8 </td></tr><tr><td> Volume Total: </td><td> 4.2 </td><td> 16.8 </td></tr></tbody></table> * Componente de ensaio com base na miARN seleccionado testado. Tabela 1B: qPCR componentes da mistura reagente em um de 5 ou 20 uL de reacção para preparação qPCR em tempo real TaqMan qPCR utilizando uma plataforma padrão placa de 96 poços. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componentes </td><td> Volume por reacção de (l) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primers (10x) </td><td> 0,8 </td></tr><tr><td> dNTPs com dTTP (100 mM) </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> MultiScribe transcriptase inversa (50 U / ul) </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> 10X RT Tampão </td><td> 0,8 </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 0,9 </td></tr><tr><td> Inibidor de RNase &amp; #<html> 160; (20 U / ul) </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> Água livre de nuclease </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 4,5 </td></tr></tbody></table> Quadro 2A: RT componentes da mistura reagente em um 5 jul RT preparação reação para o painel TLDA miRNA. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componentes </td><td> Volume por reacção de (l) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp Mastermix (2x) </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td> Megaplex pré-amplificador Primers (10x) </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> Água livre de nuclease </td><td> 7,5 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> Quadro 2B: pré-amplificador componentes da mistura reagente em uma preparação de reacção 25 mL de pré-amplificação para o painel TLDA miRNA. &quot;Cellspacing =&quot; 0 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Componentes </td><td> Volume por reacção de (l) </td></tr><tr><td> Megaplex RT Primers (10x) </td><td> 0,75 </td></tr><tr><td> dNTPs com dTTP (100 mM) </td><td> 0,15 </td></tr><tr><td> MultiScribe transcriptase inversa (50 U / ul) </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> 10X RT Tampão </td><td> 0,75 </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 0,9 </td></tr><tr><td> Inibidor de RNase (20 U / ul) </td><td> 0,09 </td></tr><tr><td> Água livre de nuclease </td><td> 0,35 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 4,5 </td></tr></tbody></table> Tabela 3A: RT componentes da mistura reagente em um 5 jul RT preparação reação para o painel nanofluidics miRNA-base da sonda. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Componentes </td><td> Volume por reacção de (l) </td></tr><tr><td> TaqMan PreAmp Mastermix (2x) </td><td> 12.5 </td></tr><tr><td> Megaplex pré-amplificador Primers (10x) </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> Água livre de nuclease </td><td> 7,5 </td></tr><tr><td> Total </td><td> 22.5 </td></tr></tbody></table> Tabela 3B:. Pré-amplificador componentes da mistura reagente em uma preparação de reacção 25 mL de pré-amplificação para o painel nanofluidics miRNA-base sonda NOTA: O complementar interativo excel planilhas fornecidas para as três plataformas, já representa a adição de 5% para compensar a pipetagem erro. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Amostra A </td><td> Amostra A repetição </td></tr><tr><td> 15,535 </td><td> 16,156 </td></tr><tr><td> 15,471 </td><td> 15,652 </td></tr><tr><td> 15.623 </td><td> 16,063 </td></tr><tr><td> 15,963 </td><td> 15,889 </td></tr><tr><td> 14,006 </td><td> 13.993 </td></tr><tr><td> 14,502 </td><td> 14,623 </td></tr><tr><td> 14,907 </td><td> 14,384 </td></tr><tr><td> 13,732 </td><td> 14,946 </td></tr></tbody></table> Tabela 4: Circulação miRNA profiling U6 usando microfluidics cartão matriz. Usando duas placas de matriz microfluidos (A e B). Ct-valores de miRNA controle U6 da Amostra A (total = 8). Controle U6 consistente abundância miRNA observada entre as corridas.

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Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

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