Name: probe-based real-time pcr approaches for quantitative measurement of micrornas
Uploaded: 2015-04-14T15:00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs at JoVE.com

Все авторы признают инфраструктуры поддержки от NHMRC КТК, Университет Сиднея, в отношении несовершеннолетних диабета исследовательский фонд (JDRF), Австралии и Ребекка Купер фонда, Австралия. Это исследование было профинансировано за счет субсидий из Научного Совета Австралии (FT110100254) и JDRF, Австралия (CRN201314), чтобы ааа WW, RJF и MVJ осуществляется мокрым лаборатории эксперименты, ASJ проведен анализ данных. WW написал первый проект. AAH планируется исследование и анализ данных. Все авторы читали и соглашались на финальной версии рукописи, рисунки и рабочие, представленных для публикации.

<ol>
	<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+animal+microRNAs.">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li><li>Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+functions+in+animal+development+and+human+disease.">MicroRNA functions in animal development and human disease.</a> Development. 132, 4653-4662 (2005).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li><li>Joglekar, M. V., Wei, C., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+estimation+of+multiple+miRNAs+and+mRNAs+from+a+single+cell.">Quantitative estimation of multiple miRNAs and mRNAs from a single cell.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, pdb prot5478 (2010).</li><li>Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet-specific+microRNAs+in+pancreas+development,+regeneration+and+diabetes.">Islet-specific microRNAs in pancreas development, regeneration and diabetes.</a> Indian J Exp Biol. 49, 401-408 (2011).</li><li>Farr, R. J., Joglekar, M. V., Taylor, C. J., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+non-coding+RNAs+as+biomarkers+of+beta+cell+death+in+diabetes.">Circulating non-coding RNAs as biomarkers of beta cell death in diabetes.</a> Pediatr Endocrinol Rev. 11, 14-20 (2013).</li><li>Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+islet-specific+microRNAs+during+human+pancreatic+development.">Expression of islet-specific microRNAs during human pancreatic development.</a> Gene Expr Patterns. 9, 109-113 (2009).</li><li>Iorio, M. V., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+in+ovarian+cancer.">MicroRNA profiling in ovarian cancer.</a> Methods Mol Biol. 1049, 187-197 (2013).</li><li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection.">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 10513-10518 (2008).</li><li>Mattie, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+high-throughput+microRNA+expression+profiling+provides+novel+biomarker+assessment+of+clinical+prostate+and+breast+cancer+biopsies.">Optimized high-throughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies.</a> Mol Cancer. 5, 24 (2006).</li><li>Zhu, W., Qin, W., Atasoy, U., Sauter, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+breast+cancer+and+healthy+subjects.">Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects.</a> BMC Res Notes. 2, 89 (2009).</li><li>Zhu, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+suitable+reference+genes+for+qRT-PCR+analysis+of+circulating+microRNAs+in+hepatitis+B+virus-infected+patients.">Identification of suitable reference genes for qRT-PCR analysis of circulating microRNAs in hepatitis B virus-infected patients.</a> Mol Biotechnol. 50, 49-56 (2012).</li><li>Yamada, H., Itoh, M., Hiratsuka, I., Hashimoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+autoimmune+thyroid+diseases.">Circulating microRNAs in autoimmune thyroid diseases.</a> Clin Endocrinol (Oxf). , (2014).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+MicroRNA+Expression+Profile+as+a+Biomarker+in+the+Diagnosis+and+Prognosis+of+Pancreatic+Cancer.">Serum MicroRNA Expression Profile as a Biomarker in the Diagnosis and Prognosis of Pancreatic Cancer.</a> Clinical Chemistry. 58, 610-618 (2012).</li><li>Gilad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+microRNAs+are+promising+novel+biomarkers.">Serum microRNAs are promising novel biomarkers.</a> PLoS One. 3, e3148 (2008).</li><li>Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Mehta, S., Bhonde, R. R., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+of+developing+and+regenerating+pancreas+reveal+post-transcriptional+regulation+of+neurogenin3.">MicroRNA profiling of developing and regenerating pancreas reveal post-transcriptional regulation of neurogenin3.</a> Dev Biol. 311, 603-612 (2007).</li><li>Hardikar, A. A., Farr, R. J., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs:+understanding+the+limits+for+quantitative+measurement+by+real-time+PCR.">Circulating microRNAs: understanding the limits for quantitative measurement by real-time PCR.</a> J Am Heart Assoc. 3, e000792 (2014).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+and+Prognostic+Implications+of+a+Serum+miRNA+Panel+in+Oesophageal+Squamous+Cell+Carcinoma.">Diagnostic and Prognostic Implications of a Serum miRNA Panel in Oesophageal Squamous Cell Carcinoma.</a> PLoS One. 9, e92292 (2014).</li><li>McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+microRNA+profiling+of+exosomes+derived+from+blood+and+culture+media.">Purification and microRNA profiling of exosomes derived from blood and culture media.</a> J Vis Exp. , e50294 (2013).</li><li>Joglekar, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-30+family+microRNAs+confer+epithelial+phenotype+to+human+pancreatic+cells.">The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells.</a> Islets. 1, 137-147 (2009).</li><li>Genda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA+changes+in+the+dorsal+horn+of+the+spinal+cord+of+rats+with+chronic+constriction+injury:+A+TaqMan(R)+Low+Density+Array+study.">microRNA changes in the dorsal horn of the spinal cord of rats with chronic constriction injury: A TaqMan(R) Low Density Array study.</a> Int J Mol Med. 31, 129-137 (2013).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+three+microRNA+profiling+platforms:+microarray,+beads+array,+and+quantitative+real-time+PCR+array.">Systematic evaluation of three microRNA profiling platforms: microarray, beads array, and quantitative real-time PCR array.</a> PLoS One. 6, e17167 (2011).</li><li>Cuk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+plasma+as+early+detection+markers+for+breast+cancer.">Circulating microRNAs in plasma as early detection markers for breast cancer.</a> Int J Cancer. 132, 1602-1612 (2013).</li><li>Morrison, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+high+throughput+quantitative+PCR.">Nanoliter high throughput quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 34, e123 (2006).</li><li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+microarray+profiling,+real-time+PCR,+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression.">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16, 991-1006 (2010).</li><li>Benes, V., Castoldi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+of+microRNA+using+real-time+quantitative+PCR,+how+to+use+it+and+what+is+available.">Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available.</a> Methods. 50, 244-249 (2010).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR.">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).</li><li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA.">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44, 31-38 (2008).</li><li>Kodani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+TaqMan+low-density+arrays+for+simultaneous+detection+of+multiple+respiratory+pathogens.">Application of TaqMan low-density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens.</a> J Clin Microbiol. 49, 2175-2182 (2011).</li><li>Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereirae Cotta, ., V, M., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+measurement+of+noncoding+RNA+in+human+serum.">A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum.</a> Exp Diabetes Res. 2012, 168368 (2012).</li><li>Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+extracellular+circulating+microRNA.">Characterization of extracellular circulating microRNA.</a> Nucleic Acids Res. 39, 7223-7233 (2011).</li><li>Li, Y., Kowdley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples.">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal Biochem. 431, 69-75 (2012).</li></ol>

Статья расходы обработки / публикации были покрыты Life Technologies, после принятия этой рукописи для публикации.

Критические шаги внутри зонда на основе протоколов КПЦР для получения точных и воспроизводимых результатов, чтобы убедиться, 1) такой же объем и концентрация RT-продукта загружается в каждой реакции КПЦР, 2) правильные отношения и объемы компонентов, необходимых для Реакция КПЦР подготовлены и хорошо перемешивают, 3) правильное и последовательное объемы добавляются к каждой реакции КПЦР, и 4) подготовка и загрузка каждого образца и реакционной смеси завершается в кратчайшие сроки, как это возможно, в то же время помнить о выше важные шаги уже упоминалось ранее. В микрофлюидики массива карты необходимо соответствующее центрифуги и конкретные ведра. Каждый ковш может вмещать до 3 карт (загружается / пустой). Всегда убедитесь, что все 3 слота из ведра заняты, а ведро уравновешивается размещения подобное ведро (это ведро должен также содержать 3 карты, либо пустыми, либо полными) в противоположном слот центрифуги. При размещении карту в Buckeт держатель, убедитесь, что 8 резервуаров проекта вверх и Лунки сталкиваются наружную стенку центрифуги. Спин карты на 331 мкг в течение 1 мин при комнатной температуре. После первого спина, откройте центрифуги и визуально убедиться Реакционная смесь была подаваться через 384 скважин. Повторите вращение в одинаковых параметров для более 1 раза. Извлеките карту из ковша и обеспечить, чтобы уровень реакционной смеси в каждой из 8 резервуаров равномерна. Любые несоответствия в жидких объемов, оставленные в резервуары делают карты нецелесообразно использовать в дальнейшем. Чтобы иметь такую ​​же концентрацию в RT-продукта, так же, концентрация входного РНК добавляли в каждую реакцию RT. Общая концентрация РНК измеряется с помощью микро-volumespectrophotometer. Наблюдаемое отношение 260/280 может быть как 1,3 для РНК, выделенной из плазмы / сыворотки; это, кажется, не имеют эффекта на последующий процесс КПЦР или косвенно связанные с данных, полученных 30. Кроме того, отношение 260/280образцы РНК проверенные здесь были между 1,3-1,7 без каких-либо аномальных эффектов в кПЦР наблюдается. При использовании низкие образцы содержания РНК, такие как те, от biofluids, это может быть трудно определить количественно РНК перед обработкой. Мы рекомендуем использование синтетических шип из-за пределов выделения РНК, а также обратные этапы транскрипции. По нашему опыту, Arabidopsis THALIANA микроРНК кандидатов (ATH-Мир-159A и ATH-Мир-172A) являются предпочтительными по сравнению Caenorhabditis Элеганс микроРНК (например, чел-МИР-39 или чел-МИР-54), который в нашем опыте, может иметь более гомологии, чем от A. THALIANA. Использование такой стадии конкретных шип-ин может объяснить для нормализации данных микроРНК на нескольких образцах, проанализированных в разное время. Использование фиксированного объема ввода РНК для реакции синтеза кДНК также рекомендуется 32,33. Три протокола зонда основе для микроРНК количественного описано здесь требуют различное количествоот общего ввода РНК, различных технологических процессов и затрат. Каждый из рабочих процессов предназначены для удовлетворения различных пропускных зависимости от количества мишеней микроРНК и количества анализируемых образцов. С увеличением пропускной способности (96 RXN 384 RXN 3072 RXN), стоимость реакции уменьшается с увеличением количества данных, полученных за единицу времени. Поскольку все эти платформы используют TaqMan химия, качество данных, полученных может быть как ожидается, будет похож. TaqMan КПЦР является хорошо признанным методом для выявления обилие микроРНК в образцах сыворотки / плазмы 9,11,27. Хотя эти три платформы, обсуждаемые здесь, одни и те же химию, уменьшение реакционного объема приводит к уменьшению динамического диапазона обнаружения транскрипта (Farr RJ и др., Неопубликованные данные). 96-а платформа КПЦР является меньшая пропускная, но платформа высокая чувствительность и, на наш взгляд, &quot;золотым стандартом&quot; для всех зонда на основе (или краситель на основе) ПЦР платформ. Тем не менее, это можетне может быть наиболее экономичный или эффективную платформу, если несколько сотен или тысяч образцов в настоящее время анализируют и для нескольких микроРНК. Microfluidics (TLDA) и нанофлюидики (ОА) платформы платформы с высокой пропускной способностью / контент разработана, чтобы позволить приобретение больших данных за более короткое время. Хотя пакетные различия наблюдались в картах TLDA, это может быть сведено к минимуму путем запроса TLDA карты из той же партии. Заметим, что TLDA платформа (Рисунок 3) показали значительное изменение в 17% Средний уровень - низкие микроРНК изобилия при тестировании с использованием того же образца на различных партий TLDA карт. Поэтому мы рекомендуем использовать одни и те же номера партий для анализа с использованием TLDA карты. Это изменение может быть также из-за технической изменчивости с учетом всех возможных погрузки и пипеток ошибок. Тем не менее, мы рекомендуем заказывать / запрос ту же самую партию TLDA карт. Нет существенные различия партия не наблюдалось на ОА платформы. Несмотря на это, TaqMan основе экспериментальТаль КПЦР подходы обеспечивают простоту измерение содержания микроРНК в образцах плазмы / сыворотки. Низкого, среднего и высокую пропускную способность подходы, обсуждаемые здесь предлагают гибкость, чтобы проанализировать целый ряд образцов и микроРНК с использованием высокоэффективной, воспроизводимый и чистый (низкий фоновый шум) химию.

Микро (микроРНК) составляют ~ 22 нуклеотидов некодирующая (NC) РНК, функционирует в качестве регуляторов экспрессии генов 1-3. Большинство микроРНК у животных функционировать через последовательности конкретных спаривания оснований с мРНК, ориентированные на 3 &#39;UTR, что приводит к негативной регуляции экспрессии гена 2-4. Это обычно происходит путем ингибирования трансляции мРНК или рибосомальной высадки. микроРНК в обращении, как было показано, чтобы быть новых биомаркеров в клинических исследований и полей для различных заболеваний, таких как диабет, яичников 5-7 8, 9 простаты и рака молочной железы 10,11, гепатит В и 12 других аутоиммунных заболеваний 13. Исследование было проведено, чтобы определить обильные микроРНК в различных клеток или тканей, а также в обращении из человеческой плазмы и образцы сыворотки, который является более доступным и менее инвазивным 9,11-15. Различные методы микроРНК количественного были электроннойукреплены с помощью нескольких платформ, таких как стандарт 96-луночного планшета платформы 4,12,16-18, в микрофлюидики Карточная платформа 12,18-23 и нанофлюидики массива платформы 17,24. Количественный ПЦР в реальном времени (КПЦР) предоставляет возможность для измерения относительного или абсолютного числа транскриптов с использованием нескольких (dye- или зонда на основе) химические. Зонд на основе ПЦР в реальном времени химии предлагает преимущество низкой фоновой флуоресценции и высокой чувствительностью обнаруживать одну копию транскрипта. Это относительно Экономичность, простота в использовании и высокую воспроизводимость, что делает его излюбленным методом для количественной оценки и определения микроРНК выражение 25. Зонд-метод, основанный КПЦР как правило, включает в себя два этапа: с обратной транскрипцией (RT) и КПЦР 4,26,27. RT, где грунт Шпилька РТ гибридизуют со зрелой первичной или молекулы микроРНК и преобразуется в комплементарной (с) ДНК. Количественное определение кДНК продукт затем проводят с использованием микроРНК-специфической ПЦР праймеры26-28. Принцип зонда на основе количественной ПЦР основан на обнаружении комплементарной нити расширения в режиме реального времени, который включает гидролиз флуоресцентно-меченый зонд. Эти зонды предназначены для размещения флуоресцентный репортер и гаситель, которые только друга, чтобы FRET (флуоресцентного резонанса передачи энергии). Обнаружение излучения флуоресценции репортера (эмиттер) маскируется непосредственной близости от молекулы гасителя. При Taq-полимеразы (Pol) проходит от верхнего праймера и достигает вилку (5&#39;-конца зонда), Taq-Pol экзонуклеазную активность гидролизует зонд, что приводит к физической диссоциации / разделения флуоресцентного эмиттера от гасителя. Этот релиз из одной молекулы флуоресцентного излучателя регистрировались детектором и представлены в качестве дополнительных увеличению сигнала флуоресценции от этой же / реакции. Увеличение флуоресценции пропорциональна количеству продукта ПЦР, генерируемого, что позволяет точную Куantification усиленного целевой 26,28. С увеличением спроса на микроРНК количественного, от средней до высокой пропускной технологий были разработаны, чтобы позволить большее количество образцов, подлежащих обработке в течение короткого периода времени. TaqMan низкой плотности массива (TLDA) является средней пропускной инновационной Микрожидкостных конструкции на основе зонда на основе КПЦР химии предлагает увеличение числа микроРНК анализируемых на одной пластине. TLDA включать использование предварительно заданного пула RT-праймеров, используемых для синтеза кДНК. Эти кДНК затем прядут настроенной 384 и микро-жидкостный карты, чтобы определить выражение нескольких микроРНК с использованием КПЦР 22,26,29. Каждая лунка Карточка содержит сушат праймеры и зонды для амплификации конкретной микроРНК (ы), поэтому до 384 реакций могут быть обработаны в один TLDA карты 26. Массив нанофлюидики является высокой пропускной платформа, которая используется для обнаружения генных транскриптов <sup&gt; 24, используя тот же химический состав зонда основе. Он использует собственный матрицу предлагает гидрофобные гидрофильной-взаимодействий для облегчения загрузки в 33 нанолитровых реакционной смеси в массив 3072 сквозных отверстий на слайде из нержавеющей стали 24. Эта статья посвящена демонстрации того, как эти методы для количественного микроРНК в сыворотке / плазме выполняются и критические факторы, которые необходимо учитывать при выполнении и интерпретации таких данных. Взятые на счет, их индивидуальные преимущества и ограничения будут рассмотрены в этой статье.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well-platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Assays INV SM&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4427975</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 
			The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4366597 or 4366596</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 
			The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For qPCR run on a 96-well platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4367846</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 
			The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on&#160; the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4346907</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics platform (TLDA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399966</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444281</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>OR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444750</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 
			The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4391128 or 4488593</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 
			The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444303</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399233</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE Buffer (100 mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12090-015</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product 
			The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444913</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofluidics platform (OpenArray)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel)</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4470187</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4469576</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray 384-well Sample Plates&#160;&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4406947</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4462159</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray AccuFill System Tips&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4457246</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129117</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probe-based real-time pcr approaches for quantitative measurement of micrornas

Зонд на основе количественной ПЦР (КПЦР) является выступает способ измерения транскрипта изобилие, так как он является одним из наиболее чувствительных методов обнаружения, что обеспечивает точный и воспроизводимый анализ. Зонд на основе химии предлагает наименьшее фоновой флуоресценции по сравнению с другими (на основе красителя) химии. В настоящее время существует несколько платформ, доступных, что химия использование зонда на основе для количественного стенограмму изобилие. КПЦР в 96-луночный планшет является наиболее обычно используемый метод, однако, только максимум 96 образцов или микроРНК могут быть проверены за один проход. Это занимает много времени и утомительным, если большое количество образцов / микроРНК должны быть проанализированы. Высокая пропускная способность зонда на основе платформ, таких как микрофлюидики (например, TaqMan Массив Card) и нанофлюидики массивов (например, OpenArray) обеспечивают простоту воспроизводимо и эффективно обнаружить обилие нескольких микроРНК в большом количестве образцов в течение короткого времени. Здесь мы демонстрируем Экспериментальная установкай протокол для микроРНК количественного из сыворотки или образцов плазмы с ЭДТА, используя химию зонда на основе и три различных платформ (96-луночный планшет, Microfluidics и нанофлюидики массивы), которые предлагают повышение уровня производительности.

Watch this Scientific Journal Video about Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs at JoVE.com

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Циркуляционные микроРНК недавно появились в перспективных и новых биомаркеров различных видов рака и других заболеваний. Цель этой статьи является обсуждение трех различных зондов на основе реального времени платформы и методы, которые доступны для количественной оценки и определить содержание циркулирующих микроРНК ПЦР.

Зонд на основе ПЦР в реальном времени подходов к количественному измерению микроРНК

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Research

JoVE Journal

Biology

Experimental Approaches to Tissue Engineering

Экспериментальные подходы к тканевой инженерии

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Количественный ПЦР в реальном времени использованием Thermo Scientific Solaris КПЦР Пробирной

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Анализ экспрессии генов в Борер Изумрудный Эш ( Agrilus planipennis) С использованием количественных Real Time PCR-

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Профилирование Предварительно микро-РНК и микроРНК с использованием количественных ПЦР в реальном времени (КПЦР) Массивы

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Определение генетических профилей выражения в С. Элеганс Использование Microarray и ПЦР в реальном времени

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET микроскопии для мониторинга в реальном времени сигнальных событий в живых клетках Использование Мономолекулярные Биосенсоры

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

Количественные, в режиме реального времени анализ базы активность репарации в клеточных лизатов Использование Поражение конкретные молекулярные маяки

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Автономно Биолюминесцентный клетках млекопитающих для непрерывных и мониторинга в реальном времени цитотоксичности

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Профилирования Индивидуальный человеческих эмбриональных стволовых клеток путем количественного RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag анализ - Высокая пропускная способность, ПЦР в реальном времени Анализ на Sc2.0 Генотипирование

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...