Name: probe-based real-time pcr approaches for quantitative measurement of micrornas
Uploaded: 2015-04-14T15:00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs at JoVE.com

Samtliga författare erkänna det stöd infrastrukturen från NHMRC CTC, University of Sydney, Juvenile Diabetes Research Foundation (JDRF), Australien och Rebecca Cooper Foundation, Australien. Denna forskning har finansierats genom bidrag från svenska forskningsrådet (FT110100254) och JDRFEN, Australien (CRN201314) att Aah WW, RJF och MVJ utfört alla våta lab experiment, ASJ utfört dataanalys. WW skrev det första utkastet. AAH planerade studien och analyserade data. Alla författare läst och godkänt på den slutliga versionen av manuskriptet, siffror och kalkylblad som lämnats för publicering.

<ol>
	<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+animal+microRNAs.">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li><li>Alvarez-Garcia, I., Miska, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+functions+in+animal+development+and+human+disease.">MicroRNA functions in animal development and human disease.</a> Development. 132, 4653-4662 (2005).</li><li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116, 281-297 (2004).</li><li>Joglekar, M. V., Wei, C., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+estimation+of+multiple+miRNAs+and+mRNAs+from+a+single+cell.">Quantitative estimation of multiple miRNAs and mRNAs from a single cell.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, pdb prot5478 (2010).</li><li>Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet-specific+microRNAs+in+pancreas+development,+regeneration+and+diabetes.">Islet-specific microRNAs in pancreas development, regeneration and diabetes.</a> Indian J Exp Biol. 49, 401-408 (2011).</li><li>Farr, R. J., Joglekar, M. V., Taylor, C. J., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+non-coding+RNAs+as+biomarkers+of+beta+cell+death+in+diabetes.">Circulating non-coding RNAs as biomarkers of beta cell death in diabetes.</a> Pediatr Endocrinol Rev. 11, 14-20 (2013).</li><li>Joglekar, M. V., Joglekar, V. M., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+islet-specific+microRNAs+during+human+pancreatic+development.">Expression of islet-specific microRNAs during human pancreatic development.</a> Gene Expr Patterns. 9, 109-113 (2009).</li><li>Iorio, M. V., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+in+ovarian+cancer.">MicroRNA profiling in ovarian cancer.</a> Methods Mol Biol. 1049, 187-197 (2013).</li><li>Mitchell, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+as+stable+blood-based+markers+for+cancer+detection.">Circulating microRNAs as stable blood-based markers for cancer detection.</a> P Natl Acad Sci USA. 105, 10513-10518 (2008).</li><li>Mattie, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+high-throughput+microRNA+expression+profiling+provides+novel+biomarker+assessment+of+clinical+prostate+and+breast+cancer+biopsies.">Optimized high-throughput microRNA expression profiling provides novel biomarker assessment of clinical prostate and breast cancer biopsies.</a> Mol Cancer. 5, 24 (2006).</li><li>Zhu, W., Qin, W., Atasoy, U., Sauter, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+breast+cancer+and+healthy+subjects.">Circulating microRNAs in breast cancer and healthy subjects.</a> BMC Res Notes. 2, 89 (2009).</li><li>Zhu, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+suitable+reference+genes+for+qRT-PCR+analysis+of+circulating+microRNAs+in+hepatitis+B+virus-infected+patients.">Identification of suitable reference genes for qRT-PCR analysis of circulating microRNAs in hepatitis B virus-infected patients.</a> Mol Biotechnol. 50, 49-56 (2012).</li><li>Yamada, H., Itoh, M., Hiratsuka, I., Hashimoto, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+autoimmune+thyroid+diseases.">Circulating microRNAs in autoimmune thyroid diseases.</a> Clin Endocrinol (Oxf). , (2014).</li><li>Liu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+MicroRNA+Expression+Profile+as+a+Biomarker+in+the+Diagnosis+and+Prognosis+of+Pancreatic+Cancer.">Serum MicroRNA Expression Profile as a Biomarker in the Diagnosis and Prognosis of Pancreatic Cancer.</a> Clinical Chemistry. 58, 610-618 (2012).</li><li>Gilad, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+microRNAs+are+promising+novel+biomarkers.">Serum microRNAs are promising novel biomarkers.</a> PLoS One. 3, e3148 (2008).</li><li>Joglekar, M. V., Parekh, V. S., Mehta, S., Bhonde, R. R., Hardikar, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+profiling+of+developing+and+regenerating+pancreas+reveal+post-transcriptional+regulation+of+neurogenin3.">MicroRNA profiling of developing and regenerating pancreas reveal post-transcriptional regulation of neurogenin3.</a> Dev Biol. 311, 603-612 (2007).</li><li>Hardikar, A. A., Farr, R. J., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs:+understanding+the+limits+for+quantitative+measurement+by+real-time+PCR.">Circulating microRNAs: understanding the limits for quantitative measurement by real-time PCR.</a> J Am Heart Assoc. 3, e000792 (2014).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+and+Prognostic+Implications+of+a+Serum+miRNA+Panel+in+Oesophageal+Squamous+Cell+Carcinoma.">Diagnostic and Prognostic Implications of a Serum miRNA Panel in Oesophageal Squamous Cell Carcinoma.</a> PLoS One. 9, e92292 (2014).</li><li>McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+microRNA+profiling+of+exosomes+derived+from+blood+and+culture+media.">Purification and microRNA profiling of exosomes derived from blood and culture media.</a> J Vis Exp. , e50294 (2013).</li><li>Joglekar, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+miR-30+family+microRNAs+confer+epithelial+phenotype+to+human+pancreatic+cells.">The miR-30 family microRNAs confer epithelial phenotype to human pancreatic cells.</a> Islets. 1, 137-147 (2009).</li><li>Genda, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=microRNA+changes+in+the+dorsal+horn+of+the+spinal+cord+of+rats+with+chronic+constriction+injury:+A+TaqMan(R)+Low+Density+Array+study.">microRNA changes in the dorsal horn of the spinal cord of rats with chronic constriction injury: A TaqMan(R) Low Density Array study.</a> Int J Mol Med. 31, 129-137 (2013).</li><li>Wang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+evaluation+of+three+microRNA+profiling+platforms:+microarray,+beads+array,+and+quantitative+real-time+PCR+array.">Systematic evaluation of three microRNA profiling platforms: microarray, beads array, and quantitative real-time PCR array.</a> PLoS One. 6, e17167 (2011).</li><li>Cuk, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+microRNAs+in+plasma+as+early+detection+markers+for+breast+cancer.">Circulating microRNAs in plasma as early detection markers for breast cancer.</a> Int J Cancer. 132, 1602-1612 (2013).</li><li>Morrison, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+high+throughput+quantitative+PCR.">Nanoliter high throughput quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 34, e123 (2006).</li><li>Git, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+comparison+of+microarray+profiling,+real-time+PCR,+and+next-generation+sequencing+technologies+for+measuring+differential+microRNA+expression.">Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression.</a> RNA. 16, 991-1006 (2010).</li><li>Benes, V., Castoldi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+profiling+of+microRNA+using+real-time+quantitative+PCR,+how+to+use+it+and+what+is+available.">Expression profiling of microRNA using real-time quantitative PCR, how to use it and what is available.</a> Methods. 50, 244-249 (2010).</li><li>Chen, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+quantification+of+microRNAs+by+stem-loop+RT-PCR.">Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR.</a> Nucleic Acids Res. 33, e179 (2005).</li><li>Schmittgen, T. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+PCR+quantification+of+precursor+and+mature+microRNA.">Real-time PCR quantification of precursor and mature microRNA.</a> Methods. 44, 31-38 (2008).</li><li>Kodani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+TaqMan+low-density+arrays+for+simultaneous+detection+of+multiple+respiratory+pathogens.">Application of TaqMan low-density arrays for simultaneous detection of multiple respiratory pathogens.</a> J Clin Microbiol. 49, 2175-2182 (2011).</li><li>Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereirae Cotta, ., V, M., Joglekar, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+measurement+of+noncoding+RNA+in+human+serum.">A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum.</a> Exp Diabetes Res. 2012, 168368 (2012).</li><li>Turchinovich, A., Weiz, L., Langheinz, A., Burwinkel, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+extracellular+circulating+microRNA.">Characterization of extracellular circulating microRNA.</a> Nucleic Acids Res. 39, 7223-7233 (2011).</li><li>Li, Y., Kowdley, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+microRNA+isolation+from+clinical+serum+samples.">Method for microRNA isolation from clinical serum samples.</a> Anal Biochem. 431, 69-75 (2012).</li></ol>

Artikel kostnader bearbetning / publicerings täcktes av Life Technologies, efter godkännande av detta manuskript för publicering.

De kritiska steg inom probbaserade qPCR protokoll för att få exakta och reproducerbara resultat är att se till att 1) ​​samma volym och koncentration av RT-produkt är laddat i varje qPCR reaktion, 2) rätt nyckeltal och volymer av komponenterna som behövs för qPCR reaktion bereds och blandas väl, 3) korrekta och konsekventa volymer läggs till varje qPCR reaktion, och 4) förberedelse och lastning av varje prov och reaktionsblandning är klar på kortast tid som möjligt, men ändå medveten om ovanstående kritiska stegen nämnde tidigare. De mikrofluidik array korten behöver lämplig centrifug och specifika hinkar. Varje hink kan innehålla upp till 3 kort (lastad / tom). Se alltid till att alla 3 platser i en hink är ockuperat och skopan balanseras genom att placera liknande skopa (denna hink bör även innehålla 3 kort, antingen tomma eller fulla) i motsatt slits centrifugen. Medan placera kortet i Bucket hållare, se till att de åtta reservoarer skjuter uppåt och reaktionsbrunnar möter yttervägg centrifug. Snurra korten på 331 xg under 1 min vid rumstemperatur. Efter första spin, öppnar centrifugen och visuellt se reaktionsblandningen har dispense igenom de 384 brunnarna. Upprepa spinn på samma inställningar för mer 1 gång. Ta ut kortet ur hinken och se till att nivån på reaktionsblandningen i varje av de åtta reservoarer är jämn. Eventuella inkonsekvenser i de flytande volymer kvar i behållarna gör kortet olämpligt att använda ytterligare. Att ha samma koncentration av RT-produkten, är samma ingångskoncentration av RNA sattes in i varje RT-reaktion. Den totala RNA-koncentrationen mäts med en mikro volumespectrophotometer. Den observerade 260/280 förhållandet kan vara så låg som 1,3 för RNA isolerats från plasma / serum; Detta verkar inte ha en effekt på nedströms qPCR relaterad process eller data genererade 30. Likaså 260/280 förhållandet avRNA testade häri prover var mellan 1,3-1,7 utan onormala effekter i qPCR observerade. Vid användning av låga innehåll prover RNA, såsom de från Biofluids, kan det vara svårt att kvantifiera RNA före behandling. Vi rekommenderar användning av syntetiska spik in på RNA isolering samt omvänd transkription stegen. Enligt vår erfarenhet Arabidopsis thaliana miRNA kandidater (ATH-MIR-159A och ath-MIR-172a) är att föredra framför Caenorhabditis elegans miRNA (såsom cel-MIR-39 eller cel-MIR-54), vilket enligt vår erfarenhet kan ha högre homologi än de från A. thaliana. Användningen av en sådan skedesspecifik spike-in kan svara för en normalisering av miRNA data över flera prover analyserades vid olika tidpunkter. Med hjälp av en fast ingångsvolym RNA för cDNA-syntes reaktion rekommenderas också 32,33. De tre sondbaserade protokoll för miRNA kvantifiering beskrivs här kräver varierande mängderav total RNA-ingång, olika arbetsflöden och kostnader. Var och en av arbetsflöden är utformade för att tillgodose olika genomströmningar baserade på antalet miRNA mål och antalet prover som skall analyseras. Med ökande genomströmningen (96 rxn 384 rxn 3072 rxn), kostnaden per reaktion minskar med en ökning av mängden data som erhålls under en tidsenhet. Eftersom alla dessa plattformar utnyttjar TaqMan kemi, kan förväntas kvaliteten på data som erhållits för att vara liknande. TaqMan qPCR är en väletablerad metod för att identifiera överflödet av miRNA i serum / plasmaprover 9,11,27. Fastän de tre plattformar som diskuteras här har samma kemi, en minskning av reaktionsvolymen leder till en minskning av dynamiskt intervall av transkriptet detektering (Farr RJ et al., Opublicerade data). Den 96-väl qPCR plattformen är en lägre genomströmning, men hög känslighet plattform och i våra ögon, den &quot;gyllene standarden&quot; för alla sondbaserade (eller färgämne baserat) PCR-plattformar. Detta kan dockinte vara det mest ekonomiska eller effektiv plattform om flera hundra eller tusen prover som analyseras och för flera mikroRNA. Mikrofluidik (TLDA) och nanofluidik (OA) plattformar är hög genomströmning / innehållsplattformar som syftar till att möjliggöra förvärv av större uppgifter på kortare tid. Även sats skillnader har observerats i TLDA korten, kan detta minimeras genom att begära TLDA kort från samma parti. Vi observerar att TLDA plattform (Figur 3) visade signifikant variation i 17% av mitten - låga överflöd miRNA vid testning med hjälp av samma prov på olika partier av TLDA kort. Vi rekommenderar därför att använda samma batchnummer för analys med hjälp TLDA kort. Denna variation kan också bero på den tekniska variabilitet inklusive eventuella lastnings- och pipetteringsfel. Vi rekommenderar dock beställning / begär samma parti TLDA kort. Ingen signifikant batch variation observerades på OA-plattformen. Trots detta TaqMan baserade experimental qPCR närmar erbjudande lätthet att mäta förekomsten av miRNA i plasma / serumprover. De metoder genomströmning låg, medium och hög diskuteras här erbjuder den flexibilitet för att analysera en rad prover och miRNA använder en mycket effektiv, reproducerbar och ren (lågt bakgrundsljud) kemi.

MicroRNAs (miRNA) är ~ 22 nukleotid icke-kodande (nc) RNA, som fungerar som regulatorer av genuttryck 1-3. De flesta miRNA hos djur fungerar genom sekvensspecifik basparning med ett mRNA, med inriktning på 3 &#39;UTR, vilket leder till negativ reglering av genuttryck 2-4. Detta sker oftast via hämning av mRNA translation eller genom ribosomal drop-off. miRNA i omlopp har visat sig vara nya biomarkörer inom forskning och kliniska områden för en mängd olika sjukdomar, såsom diabetes 5-7, äggstocks 8, prostata 9 och bröstcancer 10,11, hepatit B 12 och andra autoimmuna sjukdomar 13. Forskning har utförts för att identifiera rikliga miRNA i olika celler eller vävnader, samt i omlopp från human plasma och serumprov, som är mer tillgänglig och mindre invasiv 9,11-15. Olika metoder för miRNA kvantifiering har established använder flera plattformar, såsom standard 96-brunnar plattform 4,12,16-18, den mikrofluidik kortplattform 12,18-23 och nanofluidik arrayen plattformen 17,24. Kvantitativ realtids-PCR (qPCR) erbjuder möjligheten att mäta relativa eller absoluta antalet utskrifter med hjälp av multipel (dye- eller probbaserad) kemi. Sondbaserad realtids-PCR kemi erbjuder fördelen av låg bakgrundsfluorescens och hög känslighet för att detektera en enda transkript kopia. Det är relativt kostnadseffektivt, enkelt att använda och mycket reproducerbar, vilket gör det en gynnad metod för att kvantifiera och bestämma miRNA uttryck 25. Sondbaserad qPCR metod involverar i allmänhet två steg: omvänd transkription (RT) och qPCR 4,26,27. RT är där stammen loop RT primer hybridiseras till en mogen eller primär miRNA molekyl och omvandlas till kompletterande (c) DNA. Kvantifiering av cDNA-produkten genomförs sedan med användning av miRNA-specifika PCR-primrar26-28. Principen för sondbaserad qPCR är baserad på detektion av komplementär sträng förlängning i realtid, vilket innebär hydrolys av fluorescent-märkta proben. Dessa sönder är utformade för att innehålla en fluorescerande reporter och en utsläckare som är bara från varandra för att tillåta FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). Detektion av emissionen från fluorescens reportern (emitter) är maskerat av närheten av släckningsmolekylen. När Taq-polymeras (pol) sträcker sig från den uppströms primern och når en gaffel (5&#39;-änden av sonden), hydrolyserar Taq Pol-exonukleasaktivitet sonden, vilket leder till en fysisk dissociering / separation av den fluorescerande emittern från släckningsenheten. Denna frisättning av en enda molekyl av fluorescens emitter registreras av detektorn och presenteras som en inkrementell ökning av fluorescenssignal från det väl / reaktion. Ökningen i fluorescens är proportionell mot mängden av PCR-produkt som genererats, vilket möjliggör en noggrann quantification av den amplifierade mål 26,28. Med ökande efterfrågan i miRNA kvantifiering, har medium till teknik med hög kapacitet utvecklats för att möjliggöra ett större antal prover som ska behandlas på kort tid. TaqMan Low Density Array (TLDA) är en medel genomströmning innovativ mikroflödes design baserad på sondbaserad qPCR kemi som erbjuder en ökning av antalet miRNA analyserade på en platta. TLDA involverar användningen av en fördefinierad pool av RT-primrar som används för att syntetisera cDNA. Dessa cDNA sedan spinns till en anpassad 384 väl mikrofluid kort för att bestämma uttrycket av flera miRNA använder qPCR 22,26,29. Varje brunn av kortet innehåller torkade primers och prober för att förstärka specifika miRNA (s), alltså upp till 384 reaktioner kan behandlas i singel TLDA kort 26. Den nanofluidik array är en hög genomströmning plattform som används för detektion av gentranskript <sup&gt; 24 med användning av samma prob-baserad kemi. Det använder en egenutvecklad matris som erbjuder hydrofoba-hydrofila interaktioner för att underlätta enkel lastning av 33 nanoliter reaktionsblandningen in i en matris av 3072 genomgående hål på ett objektglas 24 rostfritt stål. Denna artikel fokuserar på att visa hur dessa metoder för att kvantifiera miRNA i serum / plasma utföras och de kritiska faktorer som måste beaktas när du utför och tolkning av sådana uppgifter. Taken till kontot, kommer deras individuella fördelar och begränsningar diskuteras i denna artikel.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96 well-platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Assays INV SM&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4427975</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975 
			The assays comes as a pack of RT primers and PCR primer.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4366597 or 4366596</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596 
			The TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit is the same kit used for reverse transcription in all the threeTaqMan platform- 96-well platform, TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For qPCR run on a 96-well platform</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix, no AmpErase UNG&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4367846</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846 
			The 2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix is used for qPCR on&#160; the two TaqMan platforms-96-well platform and TLDA.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Optical Adhesive Film</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4311971</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroAmp Fast Optical 96-Well Reaction Plate, 0.1 mL&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4346907</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics platform (TLDA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399966</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool A v2.1 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444281</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281 
			The Megaplex RT Primers, Human Pool B v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>OR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444750</td>
			<td>http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750 
			The Megaplex Primer Pools, Human Pools Set v3.0 is used for RT on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan PreAmp Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4391128 or 4488593</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 or http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593 
			The TaqMan PreAmp Master Mix is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4444303</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool B v3.0 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4399233</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233 
			The Megaplex PreAmp Primers, Human Pool A v2.1 is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X TE Buffer (100 mL)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>12090-015</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product 
			The 1X TE Buffer is used for pre-amplification of qPCR on&#160; the two TaqMan platforms- TLDA and OpenArray.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the 384 well microfluidics (TLDA) card</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan Array Human MicroRNA A+B Cards Set v3.0&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4444913</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanofluidics platform (OpenArray)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Reverse transcription</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to 96-well platform TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit kit (4366597 or 4366596) (as shown above).</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>For Pre-amplification</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Refer to TLDA pre-amplification reagents (as shown above)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>To load and run the slides</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Human MicroRNA Panel, QuantStudio 12K Flex (1 panel)</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4470187</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QuantStudio 12K Flex OpenArray Accessories Kit&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4469576</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray 384-well Sample Plates&#160;&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4406947</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TaqMan OpenArray Real-Time PCR Master Mix</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4462159</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OpenArray AccuFill System Tips&#160;</td>
			<td>Applied Biosystems 
			&#160;</td>
			<td>4457246</td>
			<td>https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Others</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>129117</td>
			<td>http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

probe-based real-time pcr approaches for quantitative measurement of micrornas

Probe-baserade kvantitativ PCR (qPCR) är en gynnad metod för att mäta avskrift överflöd, eftersom det är en av de mest känsliga detektionsmetoder som ger en exakt och reproducerbar analys. Sond-baserad kemi ger det minsta bakgrundsfluorescens jämfört med andra (färgbaserat) kemier. För närvarande finns det flera plattformar tillgängliga att använda sondbaserad kemi för att kvantifiera transkriptet överflöd. qPCR i en 96 brunnar är det mest rutinmässigt använt metoden, men bara högst 96 prover eller miRNA kan testas i en enda körning. Detta är tidskrävande och tröttande, om ett stort antal prover / miRNA skall analyseras. Hög kapacitet sondbaserade plattformar som mikrofluidik (t.ex. TaqMan Array kort) och nanofluidik kedjor (t.ex. OpenArray) erbjudande lätthet att reproducerbart och effektivt upptäcka överflödet av flera mikroRNA i ett stort antal prover på kort tid. Här visar vi den experimentella uppställningen ennd protokoll för miRNA kvantifiering från serum eller plasma-EDTA prover, med hjälp av sond baserad kemi och tre olika plattformar (96 brunnar, mikrofluidik och nanofluidik arrayer) erbjuder ökande genomströmning.

Den rekommenderade volymen för en miRNA sond-baserad analys qPCR reaktion är 20 pl. OBS: Vi har bekräftat att en reaktionsvolym på 5 ^ kan producera liknande resultat som uppnås med hjälp av 20 il volym 4,7,30. Sänkning av reaktionsvolymen till 5 pl möjliggör en 75% minskning av reagenskostnaderna, utan nämnvärd förlust i känslighet. Som visas i Figur 2, reaktionsvolymer av 20 pl och 5 ^ visar en stark samarbets förhållande fram till 39 cykler (med r2 0,92, p = 0,0002). Mikrofluidik array ger ett verktyg för att få uppgifter om 754 miRNA som uttrycks i ett prov på cirka 5 timmar (för kort A och kort B), vilket är ett mer effektivt sätt att analysera flera prover jämfört med konventionella platta med 96 brunnar PCR. Vi jämförde miRNA mikrofluidik array kort för samma prov (prov A och Prov En upprepning) Figur 3A -. B visar en Bland-Altman plot (&lt;strong&gt; 3A) och Korrelation plot (3B) för samtliga 754 miRNA testas för dessa prover. Det finns 3 olika kontroll miRNA (U6, RNU44 och RNU48) placerade slumpmässigt på båda korten (kort A och B) på flera platser. När U6 cykeltröskel (CT) värden jämförs mellan de två körningar, inte vi observera signifikanta skillnader mellan de värden (Tabell 4). Det är också viktigt att notera här att U6 uttrycks vid högre förekomst (lägre Ct-värde) i provet bedömas. Vi jämförde sedan alla miRNA som har Ct-värden mellan 0 till 19,99 i båda körningarna (n = 150), som hade liknande uttryck av miRNA övergripande med en koefficient på bestämning av 98% (figur 3C-D). Av alla de 277 miRNA som har Ct-värden mellan 20 och 29.99 i båda körningarna, 16 Mirs skilde sig signifikant mellan de ursprungliga och upprepa körningar (Figur 3E - F) Antalet miRNA med signifikant skillnad betwee.n körningarna ökat (89 av 327) när Ct-värden valdes mellan 30-40 för båda körningarna (Figur 3G - H). Den nanofluidik array plattform tillhandahåller data för 754 miRNA från varje prov serum / plasma testade, som representeras i figur 4A Det är viktigt att undersöka dessa förstärkningskurvor -. Som det är med alla qPCR - att se till att resultatet är ett tecken på sann förstärkning. Var och en av de 48 subsystem (Figur 1) innehåller också en analys för de tre mest populära &quot;hushållning&quot; ncRNAs:. U6, RNU44 och RNU48 Figur 4B illustrerar en typisk klustring av U6 replikerar från ett enda prov. Dessa replikat visa låg standardavvikelse (SD &lt;0,5) och så är en indikator på tillförlitlighet. Alternativt Figur 4C visar ökad variabilitet U6 replikat (SD&gt; 0,5) i ett andra prov. Detta upphäver inte giltigheten of resterande analyser, även om det gör kräver en mer grundlig kritik. U6, som med de flesta &quot;housekeeping&quot; miRNA i biologiska vätskor, kan ha en variabel uttryck. Det bör noteras att en av de prover, som beskrivs i Figur 4C, visar 4 gånger mindre U6 innehåll än den som presenteras i Figur 4B. Eftersom nivån av U6 i prov presenteras i 4C är 75% mindre att börja med än den som presenteras i panel 4B, är större teknisk variabilitet förväntas på grund av Poisson fördelningen av transkript, som förvärras av den lilla reaktionsvolymen 17. Ett annat viktigt redskap är de Kvalitetskontroll (QC) bilder, tillgängliga för export när körningen är klar. Ett urval av dessa använder fluorescens av ROX, den passiva färgämne som finns i qPCR reagensblandning, för att bekräfta att varje genomgående hål har laddats korrekt (Figur 5). Ett genomgående hål, eller faktiskt en sv<html> däck subanordningen, inte kan lasta på grund av otillräcklig provvolym, avdunstning, bubblor närvarande i brunnarna i 384 brunnar provplatta, underlåtenhet att helt ta bort provplattan tätningen, eller defekter inom Accufill systemet eller dess tips. Varje lossas genomgående hål måste identifieras för att undvika märkning miRNA som &quot;omätbara&quot;, när det i själva verket analysen aldrig laddad. Om detta problem uppstår, bekräftar att minst 5 l av prov / mastermix laddas in varje brunn på 384 brunnar provplatta provet plattan ordentligt centrifug före lastning, är folietätningen helt bort, och laddade OpenArray glid förseglas och köras inom den tilldelade tiden för alla efterföljande körningar. Om last frågor kvarstår, kan dessa mer sannolikt avseende specifika partiet eller sändningen av matriser eller relaterade förbruknings och ytterligare assistans bör begäras via tillverkaren. &quot;Src =&quot; / filer / ftp_upload / 52.586 / 52586fig1.jpg &quot;/&gt; Figur 1: Layout av prover för nanofluidik Array arbetsflöde: (A) Varje 384-väl provplatta kan hålla prover för upp till 8 nanofluidik arrayer. (B) efter utspädning, är pre-förstärkt cDNA placeras i åtta brunnar (2 kolumner med 4 rader), med pool A och Pool B i angränsande 8 brunnar grupper. Varje cirkel representerar en brunn. (C) Varje brunn i provplattan kommer att laddas in i en subanordningen av nanofluidik arrayen. Varje liten kvadrat representerar en subanordningen. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig2.jpg" /> Figur 2: Co-relation analys för konventionella 96 brunnar PCR plattformar: Co-förhållande mellan 20 pl och 5 pl reaktionsvolym på TaqMan realtid qPCR med en vanlig 96-brunnar plattform i CT-värden (39 cykler). Vi jämförde fyra olika mikroRNA (MIR-375, MIR-30c miR-30d och MIR-7) i fyra olika humana serum- och plasmaprover. Endast 11 datapunkter plottas sedan de andra var omöjlig att upptäcka. R 2 = 0,92, p = 0,0002. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig3.jpg" /> . Figur 3: Cirkulerande miRNA profilering använder mikrofluidik array kort Använda 2 mikrofluidik kort (kort A och kort-B), är en profil av 754 miRNA genereras (A - B). Som visas här, använde vi samma prov för 2 mikrofluidik array går att kontrollera reproducerbarhet mikrofluidik kortresultaten. Vi observerade en liknande uttryck för miRNA övergripande, med Ct-värden mellan 0 till 19,99 (C - D). Det finns få miRNA (16 av 277) med Ct-värden mellan 20-29,99 och betydande skillnader mellan upprepade körningar (E - F). Åttio nio av 327mikroRNA med högre Ct-värden (30-40) uppvisade signifikanta skillnader mellan de båda körningarna (G - H). &#160; Data analyseras med parade T-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig3large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig4.jpg" /> Figur 4: Representant Profil för PCR Produkt Amplification Kurvor: Är en representativ siffra på de kombinerade (A) förstärkning kurvor för alla miRNA mål för en människa plasmaprov. En analys för U6 (en gemensam styr ncRNA) placeras i varje undergrupp. Provet i (B) visar låg variabilitet (SD &lt;0,5) medan (C) visar hög standardavvikelse (SD&gt; 0,5) inom U6 replikerar. Båda proven är total RNA isolerad från human plasma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52586/52586fig4large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52586/52586fig5.jpg" /> Figur 5: QC Analys av nanofluidik arrayer: Kvalitetskontroll (QC) bilder av en korrekt laddat nanofluidik array (till vänster) och en felaktigt laddade nanofluidik array (höger). Den passiva färgämne, ROX (ingår i qPCR reagensblandning), fluorescerar att indikera en korrekt laddat genomgående hål. Arrayen till höger har flera subsystem / genomgående hål som inte läses in med qPCR reagensblandning och dessa bör identifieras som falskt negativa PCR-reaktioner. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Komponenter </td><td> Volym per 5 pl reaktion (pl) </td></tr&gt; <tr><td> RT-buffert (10 x) </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td> dNTP (100 mM) </td><td> 0,05 </td></tr><tr><td> RNas-inhibitor </td><td> 0,6 </td></tr><tr><td> Nukleasfritt vatten </td><td> 1,39 </td></tr><tr><td> Reverse Transcriptase </td><td> 0,33 </td></tr><tr><td> Total volym </td><td> 2,33 </td></tr></tbody></table> Tabell 1A: RT reagensblandningskomponenter i en 5 | il RT-reaktions förberedelse för TaqMan realtid qPCR med en vanlig 96-brunnar plattform. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Komponenter </td><td> Volym per 5 pl reaktion (pl) </td><td> Volym per 20 pl reaktion (pl) </td></tr><tr><td> Snabb PCR mastermix (2x) </td><td> 2,5 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> TaqMan qPCR analys (20x) * </td><td> 0,25 </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Nukleasfrittvatten </td><td> 1,45 </td><td> 5,8 </td></tr><tr><td> Total volym: </td><td> 4,2 </td><td> 16,8 </td></tr></tbody></table> * Analys del baserad på den valda miRNA testade. Tabell 1B: qPCR reagensblandningskomponenter i en 5 eller 20 | il qPCR reaktions förberedelse för TaqMan realtid qPCR med en vanlig 96-brunnar plattform. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Komponenter </td><td> Volym per reaktion (pl) </td></tr><tr><td> Megaplex RT-primrar (10x) </td><td> 0,8 </td></tr><tr><td> dNTP med dTTP (100 mM) </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> Multiscribe Reverse Transcriptase (50 U / | il) </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> 10X RT Buffer </td><td> 0,8 </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 0,9 </td></tr><tr><td> RNas Inhibitor &amp; #<html> 160; (20 U / | il) </td><td> 0,1 </td></tr><tr><td> Nukleasfritt vatten </td><td> 0,2 </td></tr><tr><td> Totalt </td><td> 4,5 </td></tr></tbody></table> Tabell 2A: RT reagens mix komponenter i en 5 pl RT reaktion förberedelse för TLDA miRNA panelen. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Komponenter </td><td> Volym per reaktion (pl) </td></tr><tr><td> TaqMan Förstärkarnivå Mastermix (2x) </td><td> 12,5 </td></tr><tr><td> Megaplex Preamp Primers (10x) </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> Nukleasfritt vatten </td><td> 7,5 </td></tr><tr><td> Totalt </td><td> 22,5 </td></tr></tbody></table> Tabell 2B: Preamp reagens mix komponenter i en 25 ^ pre-amplifiering reaktion förberedelse för TLDA miRNA panelen. &quot;Cellspacing =&quot; 0 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Komponenter </td><td> Volym per reaktion (pl) </td></tr><tr><td> Megaplex RT-primrar (10x) </td><td> 0,75 </td></tr><tr><td> dNTP med dTTP (100 mM) </td><td> 0,15 </td></tr><tr><td> Multiscribe Reverse Transcriptase (50 U / | il) </td><td> 1,5 </td></tr><tr><td> 10X RT Buffer </td><td> 0,75 </td></tr><tr><td> MgCl2 (25 mM) </td><td> 0,9 </td></tr><tr><td> RNas-inhibitor (20 U / | il) </td><td> 0,09 </td></tr><tr><td> Nukleasfritt vatten </td><td> 0,35 </td></tr><tr><td> Totalt </td><td> 4,5 </td></tr></tbody></table> Tabell 3A: RT reagens mix komponenter i en 5 pl RT reaktion förberedelse för sondbaserade nanofluidik miRNA panel. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Komponents </td><td> Volym per reaktion (pl) </td></tr><tr><td> TaqMan Förstärkarnivå Mastermix (2x) </td><td> 12,5 </td></tr><tr><td> Megaplex Preamp Primers (10x) </td><td> 2,5 </td></tr><tr><td> Nukleasfritt vatten </td><td> 7,5 </td></tr><tr><td> Totalt </td><td> 22,5 </td></tr></tbody></table> Tabell 3B:. Preamp reagens mix komponenter i en 25 ^ pre-amplifiering reaktion förberedelse för sondbaserade nanofluidik miRNA panel OBS: Den interaktiva tilläggs excel kalkylblad föreskrivs de tre plattformarna, redan står för tillsättning 5% för att kompensera för pipettering fel. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Prov A </td><td> Prov A upprepning </td></tr><tr><td> 15,535 </td><td> 16,156 </td></tr><tr><td> 15,471 </td><td> 15,652 </td></tr><tr><td> 15.623 </td><td> 16,063 </td></tr><tr><td> 15,963 </td><td> 15,889 </td></tr><tr><td> 14,006 </td><td> 13,993 </td></tr><tr><td> 14,502 </td><td> 14,623 </td></tr><tr><td> 14,907 </td><td> 14,384 </td></tr><tr><td> 13,732 </td><td> 14,946 </td></tr></tbody></table> Tabell 4: Cirkulerande miRNA U6 profilering använder mikrofluidik array-kort. Använda två mikrofluidik array kort (A och B). Ct-värden på U6 kontroll miRNA från Prov A (totalt = 8). Konsekvent U6 kontroll miRNA överflöd observerats mellan körningarna.

Watch this Scientific Journal Video about Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs at JoVE.com

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Cirkulerande mikroRNA har nyligen dykt upp som lovande och nya biomarkörer för olika cancerformer och andra sjukdomar. Målet med denna artikel är att diskutera tre olika probbaserad realtids-PCR-plattformar och metoder som finns tillgängliga för att kvantifiera och avgöra överflödet av cirkulerande mikroRNA.

Probe-baserade Real-time PCR Approaches för kvantitativ mätning av mikroRNA

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

Research

JoVE Journal

Biology

Experimental Approaches to Tissue Engineering

Experimentella metoder för att Tissue Engineering

Quantitative Real-Time PCR using the Thermo Scientific Solaris qPCR Assay

Kvantitativa realtids-PCR med Thermo Scientific Solaris qPCR analys

The Solaris qPCR Gene Expression Assay is a novel type of primer/probe set, designed to simplify the qPCR process while maintaining the sensitivity and ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Analys av genuttryck i Emerald Ash tillväxtborr ( Agrilus planipennis) Med kvantitativa realtid-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR (qPCR) Arrays

Profiling of Pre-micro RNAs and microRNAs using Quantitative Real-time PCR qPCR Arrays

Profilering av Pre-mikro-RNA och mikroRNA hjälp av kvantitativ realtids-PCR (qPCR) Arrays

Quantitative real-time PCR (QPCR) has emerged as an accurate and valuable tool in profiling gene expression levels.  One of its many advantages is a lower ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Fastställande genuttryck profiler i C. elegans Använda Microarray och Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

FRET Microscopy for Real-time Monitoring of Signaling Events in Live Cells Using Unimolecular Biosensors

FRET mikroskopi för realtidsövervakning av signalering händelser i levande celler Använda unimolekylära Biosensorer

F&ouml;rster resonance energy transfer (FRET) microscopy  continues to gain increasing interest as a technique for real-time monitoring  of biochemical ...

Quantitative, Real-time Analysis of Base Excision Repair Activity in Cell Lysates Utilizing Lesion-specific Molecular Beacons

Kvantitativ Real-time Analysis of Base excision reparation aktivitet i cellysat Produkten bygger på sårspecifik Molecular Beacons

We describe a method for the quantitative, real-time measurement of DNA glycosylase and AP endonuclease activities in cell nuclear lysates using base ...

Autonomously Bioluminescent Mammalian Cells for Continuous and Real-time Monitoring of Cytotoxicity

Autonomt Bioluminescent däggdjursceller för kontinuerlig och övervakning i realtid av cytotoxicitet

Mammalian  cell-based in vitro assays have been  widely employed as alternatives to animal testing for toxicological studies but  have been limited due to ...

Profiling Individual Human Embryonic Stem Cells by Quantitative RT-PCR

Profilering individuella mänskliga embryonala stamceller genom kvantitativ RT-PCR

Heterogeneity of stem cell population hampers detailed understanding of stem cell biology, such as their differentiation propensity toward different ...

qPCRTag Analysis - A High Throughput, Real Time PCR Assay for Sc2.0 Genotyping

qPCRTag Analys - En hög genomströmning, Realtid PCR-analys för Sc2.0 Genotypning

The Synthetic Yeast Genome Project (Sc2.0) aims to build 16 designer yeast chromosomes and combine them into a single yeast cell. To date one synthetic ...