Name: analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart
Uploaded: 2015-03-26T13:00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart at JoVE.com

The authors would like to thank Drs. Hilary Clay, Stephen Wilson, Anna Payne-Tobin, and James Smyth for helpful discussions. Microscopy was done at the Cardiovascular Research Institute Imaging Core at the University of California, San Francisco. This work was supported by NIH K08 HL105657 (LDW) and NIH HL65590 (SRC).

<ol>
	<li>Risebro, C. A., Riley, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formation+of+the+ventricles.">Formation of the ventricles.</a> The Scientific World Journal. 6, 1862-1880 (2006).</li><li>Ji, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+cardiac+function+during+early+mouse+embryogenesis+coincides+with+entry+of+primitive+erythroblasts+into+the+embryo+proper.">Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper.</a> Circulation research. 92, 133-135 (2003).</li><li>Bennett, P. M., Maggs, A. M., Baines, A. J., Pinder, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transitional+junction:+a+new+functional+subcellular+domain+at+the+intercalated+disc.">The transitional junction: a new functional subcellular domain at the intercalated disc.</a> Molecular biology of the cell. 17, 2091-2100 (2006).</li><li>Sparrow, J. C., Schock, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+initial+steps+of+myofibril+assembly:+integrins+pave+the+way.+Nature+reviews.">The initial steps of myofibril assembly: integrins pave the way. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 10, 293-298 (2009).</li><li>Kastner, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vitamin+A+deficiency+and+mutations+of+RXRalpha,+RXRbeta+and+RARalpha+lead+to+early+differentiation+of+embryonic+ventricular+cardiomyocytes.">Vitamin A deficiency and mutations of RXRalpha, RXRbeta and RARalpha lead to early differentiation of embryonic ventricular cardiomyocytes.</a> Development. 124, 4749-4758 (1997).</li><li>Zhang, W., Chen, H., Qu, X., Chang, C. P., Shou, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanism+of+ventricular+trabeculation/compaction+and+the+pathogenesis+of+the+left+ventricular+noncompaction+cardiomyopathy+(LVNC).">Molecular mechanism of ventricular trabeculation/compaction and the pathogenesis of the left ventricular noncompaction cardiomyopathy (LVNC).</a> American journal of medical genetics Part C, Seminars in medical genetics. 163C, 144-156 (2013).</li><li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+localization+of+alpha3beta1+integrin+isoforms+in+association+with+myofibrillogenesis+during+cardiac+myocyte+development+in+culture.">Cellular localization of alpha3beta1 integrin isoforms in association with myofibrillogenesis during cardiac myocyte development in culture.</a> Cell adhesion and communication. 7, 85-97 (1999).</li><li>Lu, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vinculin/sarcomeric-alpha-actinin/alpha-actin+nexus+in+cultured+cardiac+myocytes.">The vinculin/sarcomeric-alpha-actinin/alpha-actin nexus in cultured cardiac myocytes.</a> The Journal of cell biology. 117, 1007-1022 (1992).</li><li>Schultheiss, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+distribution+of+subsets+of+myofibrillar+proteins+in+cardiac+nonstriated+and+striated+myofibrils.">Differential distribution of subsets of myofibrillar proteins in cardiac nonstriated and striated myofibrils.</a> The Journal of cell biology. 110, 1159-1172 (1990).</li><li>Samarel, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Costameres,+focal+adhesions,+and+cardiomyocyte+mechanotransduction.+American+journal+of+physiology.">Costameres, focal adhesions, and cardiomyocyte mechanotransduction. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 289, H2291-H2301 (2005).</li><li>Sinn, H. W., Balsamo, J., Lilien, J., Lin, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+the+novel+Xin+protein+to+the+adherens+junction+complex+in+cardiac+and+skeletal+muscle+during+development.">Localization of the novel Xin protein to the adherens junction complex in cardiac and skeletal muscle during development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 225, 1-13 (2002).</li><li>Lu, S., Borst, D. E., Horowits, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=N-RAP+expression+during+mouse+heart+development.">N-RAP expression during mouse heart development.</a> Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 233, 201-212 (2005).</li><li>Hirschy, A., Schatzmann, F., Ehler, E., Perriard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+cardiac+cytoarchitecture+in+the+developing+mouse+heart.">Establishment of cardiac cytoarchitecture in the developing mouse heart.</a> Developmental biology. 289, 430-441 (2006).</li><li>Whitman, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Desmoplakin+and+talin2+are+novel+mRNA+targets+of+fragile+X-related+protein-1+in+cardiac+muscle.">Desmoplakin and talin2 are novel mRNA targets of fragile X-related protein-1 in cardiac muscle.</a> Circulation research. 109, 262-271 (2011).</li><li>Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+embryonic+development+in+a+serum-free+whole+embryo+culture+system.">Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2014).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9, 676-682 (2012).</li><li>Schmid, B., Schindelin, J., Cardona, A., Longair, M., Heisenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high-level+3D+visualization+API+for+Java+and+ImageJ.">A high-level 3D visualization API for Java and ImageJ.</a> BMC. 11, 274 (2010).</li><li>Swope, D., Cheng, L., Gao, E., Li, J., Radice, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+cadherin-binding+proteins+beta-catenin+and+plakoglobin+in+the+heart+leads+to+gap+junction+remodeling+and+arrhythmogenesis.">Loss of cadherin-binding proteins beta-catenin and plakoglobin in the heart leads to gap junction remodeling and arrhythmogenesis.</a> Molecular and cellular biology. 32, 1056-1067 (2012).</li><li>Riedl, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lifeact+mice+for+studying+F-actin+dynamics.">Lifeact mice for studying F-actin dynamics.</a> Nature. 7, 168-169 (2010).</li><li>Shi, S. R., Shi, Y., Taylor, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antigen+retrieval+immunohistochemistry:+review+and+future+prospects+in+research+and+diagnosis+over+two+decades.">Antigen retrieval immunohistochemistry: review and future prospects in research and diagnosis over two decades.</a> The journal of histochemistry and cytochemistry : official journal of the Histochemistry Society. 59, 13-32 (2011).</li><li>North, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seeing+is+believing?+A+beginners'+guide+to+practical+pitfalls+in+image+acquisition.">Seeing is believing? A beginners' guide to practical pitfalls in image acquisition.</a> The Journal of cell biology. 172, 9-18 (2006).</li><li>Risebro, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prox1+maintains+muscle+structure+and+growth+in+the+developing+heart.">Prox1 maintains muscle structure and growth in the developing heart.</a> Development. 136, 495-505 (2009).</li><li>Ehler, E., Rothen, B. M., Hammerle, S. P., Komiyama, M., Perriard, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myofibrillogenesis+in+the+developing+chicken+heart:+assembly+of+Z-disk,+M-line+and+the+thick+filaments.">Myofibrillogenesis in the developing chicken heart: assembly of Z-disk, M-line and the thick filaments.</a> Journal of cell science. 112 (Pt 10), 1529-1539 (1999).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

इष्टतम ऊतक निर्धारण तकनीक और कमजोर पड़ने के अनुभव से प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए। हमारे हाथ में, स्नैप-ठंड S-α-actinin, β-catenin, β1-Integrin, tropomyosin, Talin () नहीं दिखाया और एन cadherin सहित कई cardiomyocyte एंटीजन, के लिए पीएफए ​​निर्धारण करने के लिए बेहतर है; इसके विपरीत, पीएफए ​​निर्धारण फोकल आसंजन काइनेज के लिए बेहतर परिणाम पैदावार () नहीं दिखाया। पीएफए ​​द्वारा गठित प्रोटीन crosslinks epitopes और सीमा एंटीबॉडी बाध्यकारी मुखौटा हो सकता है; प्रतिजन पुनर्प्राप्ति ऐसे मामलों में आवश्यक हो सकता है, और प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के लिए तरीकों कहीं और 20 से पाया जा सकता है। पीएफए ​​एकाग्रता या निर्धारण की लंबाई अनुभव से प्रत्येक एंटीबॉडी के लिए और प्रत्येक विकास के चरण में निर्धारित इष्टतम शर्तों के साथ, मिलान मास्किंग कम करने के लिए कम किया जा सकता है। प्राथमिक एंटीबॉडी नियंत्रण के रूप में पूर्व प्रतिरक्षा सीरम और एक &quot;कोई प्राथमिक एंटीबॉडी&quot; सह सहित एक नई एंटीबॉडी या हृदय उत्परिवर्ती, निस्र्पक जब उचित नकारात्मक नियंत्रण इस्तेमाल किया जाना चाहिएntrol। पीटा चूहों का प्रयोग एक आदर्श नकारात्मक नियंत्रण है लेकिन जल्दी मारक यहां अध्ययन जीन उत्पादों के कई के लिए उनके उपयोग को रोकता है। पर्याप्त संस्करणों का प्रयोग पूरी तरह से एक ही इम्यूनोफ्लोरेसेंस अवरुद्ध, एंटीबॉडी में प्रयोगात्मक और नियंत्रण स्लाइड डूब, और समाधान करने के लिए वर्गों की वर्दी प्रदर्शन सुनिश्चित करने के लिए ऊष्मायन के दौरान स्लाइड्स की कोमल कमाल था के रूप में धोने के समाधान के लिए महत्वपूर्ण था। यह दृष्टिकोण एक प्रयोग के भीतर वर्गों और स्लाइड के बीच धुंधला में तकनीकी परिवर्तनशीलता कम से कम। लागत एंटीबॉडी समाधान मात्रा को सीमित करता है, जब ऊतक वर्गों से परे समाधान के प्रवाह को सीमित करने और लंबे समय incubations के दौरान एक humidified कक्ष में स्लाइड्स रखने के लिए एक पैप कलम का उपयोग करें। एक मोनोक्लोनल माउस प्राथमिक एंटीबॉडी हैं - और इसलिए एक विरोधी माउस माध्यमिक एंटीबॉडी - इस्तेमाल किया जा रहा है, अंतर्जात माउस इम्युनोग्लोबुलिन कवर करने के लिए एक दूसरे अवरुद्ध कदम अविशिष्ट पृष्ठभूमि संकेत कम करने के लिए आवश्यक (3.4 कदम) हो जाएगा। उपयुक्त माइक्रोस्कोपी और छवि प्रसंस्करण तकनीकों जैविक रूप से सटीक जानकारी 21 प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण हैं। प्रत्येक रंग के लिए - (एक 16-बिट छवि के लिए 65535 का स्तर 0) तीव्रता हिस्टोग्राम प्रत्येक तीव्रता के स्तर पर पिक्सल के वितरण इंगित करता है। पृष्ठभूमि, चमक, और इसके विपरीत हिस्टोग्राम शिखर flanks कि एक तीव्रता प्रदर्शन रेंज की स्थापना से समायोजित किया जा सकता है; स्थितियों के बीच वैध तुलना करने के लिए, नियंत्रण और प्रयोगात्मक शर्तों के बीच एक ही सेटिंग्स का उपयोग किया जाना चाहिए। इस प्रोटोकॉल देशी भ्रूण माउस दिल में cardiomyocyte परिपक्वता और विकास का विश्लेषण करने के लिए एक विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है। Cardiomyocyte-विशिष्ट प्रोटीन की इम्यूनोफ्लोरेसेंस अक्सर विकास के दौरान cardiomyocytes चिह्नित करने के लिए प्रयोग किया जाता है, वहीं कुछ अध्ययनों उच्च संकल्प myofibril संरचना का विश्लेषण और intercalated डिस्क और costameres 12-14,22,23 के उद्भव की अनुमति है कि तकनीक को रोजगार। इस तकनीक वी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैसंरचनात्मक असामान्यताओं के तंत्र पर प्रकाश डाला सकता है कि cardiomyocyte परिपक्वता में परिवर्तन की पहचान करने का एक साधन के रूप में, विकासात्मक दिल दोषों का कारण है कि परिवर्तन के इवो आकलन।

Cardiomyocytes midline की ओर पलायन और रैखिक दिल ट्यूब 1,2 फार्म के बाद विकास के दौरान, दिल संकुचन जल्द ही शुरू करते हैं। sarcomere cardiomyocyte भीतर बुनियादी सिकुड़ा इकाई है; इस बेहद संगठित cytoskeletal संरचना sarcomeric α-actinin (S-α-actinin) और एम लाइन के लिए लंगर मायोसिन फाइबर (चित्रा 1) द्वारा जेड-डिस्क के लिए लंगर एक्टिन तंतु होते हैं। Cardiomyocyte परिपक्व होती है, sarcomeres सेल भर में विस्तार है कि myofibrils फार्म करने के लिए श्रृंखला में इकट्ठा। Myofibrils intercalated डिस्क से cardiomyocyte के छोर तक संचालन कर रहे हैं, इस तरह के एस-α-actinin 3, adherens के रूप में जेड-डिस्क तत्वों का एक सबसेट के साथ एक संक्रमणकालीन जंक्शन जिसमें सेल सेल junctional संरचना ऐसी एन cadherin के रूप में जंक्शन प्रोटीन और β catenin, अंतर जंक्शन प्रोटीन, और desmosomes (चित्रा 1) 4। अनुदैर्ध्य झिल्ली, भी परिधीय myofibrils के Z-डिस्क के साथcostameres के माध्यम से कोशिका झिल्ली को देते हैं; इन विशेष फोकल adhesions (चित्रा 1) 4 myofibril, प्लाज्मा झिल्ली, और cardiomyocyte करने के लिए अतिरिक्त संरचनात्मक समर्थन प्रदान करने के लिए बाह्य मैट्रिक्स के बीच एक लंगर प्रदान करते हैं। प्रारंभिक दिल के विकास में, cardiomyocytes निलय अंतरिक्ष में फैलाना और अपेक्षाकृत परिपक्व myofibrils 5 होते हैं कि trabeculae रूप में जाना जाता उंगली की तरह अनुमानों में व्यवस्थित कर रहे हैं। दिल के विकास के रूप में आय, उप एपिकार्डियल क्षेत्र में cardiomyocytes निलय दीवारों शामिल हैं, लेकिन sarcomere और myofibril विधानसभा घरनदार मायोकार्डियम 5,6 के साथ तुलना में देरी कर रहे हैं कि कॉम्पैक्ट मायोकार्डियम फार्म करने के लिए पैदा करना। Sarcomere और myofibril विधानसभा के मॉडल सुसंस्कृत सीधा कर रहे हैं लेकिन एक तीन आयामी वातावरण, रक्त प्रवाह की कमी है जो cardiomyocytes 7-10, और अन्य हृदय सेल के साथ संपर्क पर इम्यूनोफ्लोरेसेंस अध्ययन से काफी हद तक आविवो में मौजूद है। माउस भ्रूण दिल में immunofluorescence का उपयोग उच्च संकल्प संरचनात्मक पढ़ाई तकनीकी रूप से चुनौती दे रहे हैं, और कुछ अध्ययनों माउस हृदय विकास के दौरान intercalated डिस्क और costameres के उद्भव का पता लगाया है। catenin β adherens जंक्शन प्रोटीन भ्रूण दिन से intercalated डिस्क (ई) 17.5 11, एन cadherin प्रसव के बाद दिन 0 13 बनाम E18.5 12 से intercalated डिस्क का प्रतिनिधित्व कर सकते हैं कि रैखिक संरचनाओं के लिए localizes, और costameres में पाया गया है करने के लिए स्थानीय बनाना प्रतीत होता है E18.5 14 है, लेकिन इन प्रोटीनों पहले विकासात्मक समय अंक 11-13 में फैलाना और अधिक निरंतर झिल्ली वितरण प्रदर्शित करते हैं। यहाँ, हम intercala के उद्भव सहित myofibril और cardiomyocyte विकास के विस्तृत विश्लेषण के लिए अनुमति देता है कि immunostaining और sectioned माउस भ्रूण दिलों की प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए एक सीधा और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का वर्णनटेड के रूप में जल्दी E12.5 और E16.5 पर नवजात costameres के रूप में डिस्क। इस प्रोटोकॉल sarcomere गठन के साथ ही myofibril और cardiomyocyte परिपक्वता पर परिवर्तन के प्रभाव की जांच के लिए उपयोगी हो सकता है।

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="946">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:167px;">Company</td>
			<td style="width:160px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:335px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Cryomold, Disposable Base Mold, 7x7 mm</td>
			<td style="width:167px;">Richard-Allen Scientific</td>
			<td style="width:160px;">58949</td>
			<td style="width:335px;">This size not available from Fisher Scientific</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Cryomold, Disposable Base Mold, 15x15 mm</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">22-050-159</td>
			<td style="width:335px;">Also available from Richard-Allen Scientific, catalog number 58950</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Tissue-Tek Optimal Cutting Temperature (OCT) medium 4583</td>
			<td style="width:167px;">VWR</td>
			<td style="width:160px;">25608-930</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">2-methyl butane</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">M32631</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">T353-500</td>
			<td style="width:335px;">Use fresh 4% solution in 1X PBS, pH 7.2-7.4.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Sucrose</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">S0389</td>
			<td style="width:335px;">Use 15% and 30% solutions in 1X PBS.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Disposable transfer pipette</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">S30467-1</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:285px;">Superfrost Plus slides</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">12-550-15</td>
			<td style="width:335px;">&#34;Plus&#34; indicates positively-charged coating and is critical for maintaining tissue adherence to the slide.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Acetone</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">179124</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">X100</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:285px;">Western Blocking Agent</td>
			<td style="width:167px;">Roche</td>
			<td style="width:160px;">11921673001</td>
			<td style="width:335px;">Blocking buffer for immunofluorescence, when secondary antibodies are from different species. Dilute to 1X in PBS.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Tween 20</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">P9416</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Donkey Anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment</td>
			<td style="width:167px;">Jackson ImmunoResearch</td>
			<td style="width:160px;">715-007-003</td>
			<td style="width:335px;">Goat Anti-mouse IgG (H+L) also available. For blocking endogenous immunoglobulins.</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:285px;">Anti-s-a-actinin antibody</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">A7811</td>
			<td style="width:335px;">Mouse monoclonal, clone EA53. Dilute 1:400 for snap-frozen/acetone-fixed sections, dilute 1:300 for PFA-fixed sections. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Anti-bcatenin antibody</td>
			<td style="width:167px;">Cell Signaling</td>
			<td style="width:160px;">9587s</td>
			<td style="width:335px;">Rabbit polyclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:400.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:285px;">Anti-b1 integrin antibody</td>
			<td style="width:167px;">R&#38;D</td>
			<td style="width:160px;">AF2405</td>
			<td style="width:335px;">Goat polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:285px;">Anti-tropomyosin antibody</td>
			<td>Developmental Studies Hybridoma Bank, University of Iowa</td>
			<td style="width:160px;">CH1</td>
			<td style="width:335px;">Mouse monoclonal. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:285px;">Anti-N-cadherin antibody</td>
			<td style="width:167px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:160px;">sc-7939</td>
			<td style="width:335px;">Rabbit polyclonal. Dilute 1:200. Snap-frozen/acetone-fixed tissue staining is superior to PFA-fixed tissue.</td>
		</tr>
		<tr height="105">
			<td height="105" style="height:105px;width:285px;">Anti-talin antibody</td>
			<td style="width:167px;">Sigma</td>
			<td style="width:160px;">T3287</td>
			<td style="width:335px;">Mouse monoclonal, clone 8d4. Requires snap-freezing/acetone fixation. Dilute 1:200. Before incubation on mouse tissue, block endogenous mouse immunoglobulins with anti-mouse IgG (H+L) monovalent Fab fragment.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Anti-phosphotyrosine 397 focal adhesion kinase antibody</td>
			<td style="width:167px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:160px;">700255</td>
			<td style="width:335px;">Rabbit monoclonal antibody. Requires PFA fixation. Dilute 1:500.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:160px;">A-21202</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Alexa Fluor 568 Donkey Anti-Rabbit IgG Antibody</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:160px;">A10042</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:160px;">A-11001</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)Antibody</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:160px;">A-11011</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Hoechst 33342 dye</td>
			<td style="width:167px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:160px;">H3570</td>
			<td style="width:335px;">Nuclear stain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Vectashield</td>
			<td style="width:167px;">Vector labs</td>
			<td style="width:160px;">H-1000</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Coverslips</td>
			<td style="width:167px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:160px;">12-548-5M</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">MLC 400B Monolithic Laser Combiner Laser box</td>
			<td style="width:167px;">Keysight (formerly Agilent)</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Clara Interline CCD camera</td>
			<td style="width:167px;">Andor</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Eclipse Ti inverted microscope</td>
			<td style="width:167px;">Nikon</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">CSU-X1 Spinning disk confocal scanner unit</td>
			<td style="width:167px;">Yokogawa</td>
			<td style="width:160px;"></td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:285px;">CFI Plan Apochromat 4X air objective</td>
			<td style="width:167px;">Nikon&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Numerical aperture (NA) 0.2, Working distance (WD) 15.7 mm</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:285px;">CFI Plan Apochromat VC 60x oil immesion objective (MRD01602)</td>
			<td style="width:167px;">Nikon&#160;&#160;</td>
			<td style="width:160px;">NA 1.4, WD 0.13 mm</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:285px;">NIS Elements Imaging Software</td>
			<td style="width:167px;">Nikon</td>
			<td style="width:160px;">http://nikon.com/products/instruments/lineup/bioscience/img_soft/index.htm</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Image analysis software</td>
			<td style="width:167px;">Fiji</td>
			<td style="width:160px;">http://fiji.sc/Fiji</td>
			<td style="width:335px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of cardiomyocyte development using immunofluorescence in embryonic mouse heart

दिल के विकास के दौरान, दौरे-विशिष्ट संरचनात्मक और कार्यात्मक sarcomeres, सिकुड़ा myofibrils, intercalated डिस्क सहित इकाइयों, और costameres की पीढ़ी समय और अंतरिक्ष में कई घटकों के समन्वित विधानसभा की आवश्यकता है। इन घटकों के विधानसभा में व्यवधान विकासात्मक दिल दोषों की ओर जाता है। Immunofluorescent धुंधला तकनीक myofibril परिपक्वता की जांच के लिए सुसंस्कृत cardiomyocytes में आमतौर पर इस्तेमाल किया जाता है, लेकिन इस पूर्व vivo दृष्टिकोण myocytes पूरी तरह से endocardial cues के संस्कृति, सामान्य में विवो मैकेनिकल आदानों की कमी है, और अनुपस्थिति में अलग होगा करने के लिए किस हद तक सीमित है। माउस दिल के विकास का अध्ययन करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस तकनीक के इस्तेमाल के लिए वांछनीय है, लेकिन अधिक तकनीकी रूप से चुनौती दे रहा है, और विधियों अक्सर दिल के विकास के प्रारंभिक दौर में sarcomeres कल्पना करने के लिए पर्याप्त संवेदनशीलता और संकल्प की कमी है। यहाँ, हम म्यू-immunostain सह करने के लिए एक मजबूत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य विधि का वर्णनएकाधिक प्रोटीन या करने के लिए भ्रूण माउस दिल में Immunofluorescent धुंधला के साथ एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन सह-कल्पना और विकासशील myofibrils, intercalated डिस्क, और costameres का विश्लेषण करने के लिए इस विधि का उपयोग करें। इस विधि के आगे विकास के हृदय दोष है कि नेतृत्व परिवर्तन की वजह से cardiomyocyte संरचनात्मक परिवर्तनों का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart at JoVE.com

Analysis of Cardiomyocyte Development using Immunofluorescence in Embryonic Mouse Heart

Mutations that lead to congenital heart defects benefit from in vivo investigation of cardiac structure during development, but high-resolution structural studies in the mouse embryonic heart are technically challenging. Here we present a robust immunofluorescence and image analysis method to assess cardiomyocyte-specific structures in the developing mouse heart.

भ्रूण माउस दिल में immunofluorescence का उपयोग cardiomyocyte विकास का विश्लेषण

During heart development, the generation of myocardial-specific structural and functional units including sarcomeres, contractile myofibrils, intercalated ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

Transcriptional विश्लेषण के लिए बड़े पैमाने पर Zebrafish भ्रूण दिल विच्छेदन

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

Culture of Embryonic Mouse Cochlear Explants and Gene Transfer by Electroporation

Electroporation द्वारा भ्रूण माउस Cochlear explants की संस्कृति और जीन स्थानांतरण

Auditory hair cells located within the mouse organ of Corti detect and transmit sound information to the central nervous system. The mechanosensory hair ...

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

Transcriptome Profiling of In-Vivo Produced Bovine Pre-implantation Embryos Using Two-color Microarray Platform

के Transcriptome प्रोफाइलिंग<em&gt; इन विवो</em&gt; उत्पादित गोजातीय पूर्व आरोपण भ्रूण दो रंग माइक्रोएरे प्लेटफार्म का उपयोग

Early embryonic loss is a large contributor to infertility in cattle. Moreover, bovine becomes an interesting model to study human preimplantation embryo ...

Assessing Cardiomyocyte Subtypes Following Transcription Factor-mediated Reprogramming of Mouse Embryonic Fibroblasts

Cardiomyocyte Subtypes आकलन माउस भ्रूणीय fibroblasts की ट्रांसक्रिप्शन फैक्टर की मध्यस्थता के बाद Reprogramming

Direct reprogramming of one cell type into another has recently emerged as a powerful paradigm for regenerative medicine, disease modeling, and lineage ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

मात्रात्मक पूरे-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस माउस भ्रूण में कार्डियक जनक आबादी का विश्लेषण

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Gastrulating माउस में नोड और Notochordal प्लेट visualizing इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी और पूरे माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस का उपयोग कर भ्रूण

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Microinjection-आधारित प्रणाली के लिए Vivo में भ्रूण Cardiomyocytes के प्रत्यारोपण में एवियन भ्रूण

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Analysis of Cardiac Chamber Development During Mouse Embryogenesis Using Whole Mount Epifluorescence

पूरे माउंट Epifluorescence का उपयोग कर माउस Embryogenesis के दौरान कार्डिएक चैंबर विकास का विश्लेषण

The goal of this protocol is to describe a method for the dissection of mouse embryos and visualization of embryonic mouse ventricular chambers during ...

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

माउस भ्रूण कोशिकाओं के मल्टीप्लेक्स एकल सेल mRNA अनुक्रमण विश्लेषण

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Analysis of Congenital Heart Defects in Mouse Embryos Using Qualitative and Quantitative Histological Methods

गुणात्मक और मात्रात्मक हिस्टोलॉजिकल तरीकों का उपयोग कर माउस भ्रूण में जन्मजात हृदय दोषों का विश्लेषण

Congenital heart defects (CHD) are the most common type of birth defect in humans, affecting up to 1% of all live births. However, the underlying causes ...