Name: detection of mirna targets in high-throughput using the 3'life assay
Uploaded: 2015-05-25T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay at JoVE.com

We thank Stephen Blazie, Karen Anderson, Josh LaBaer for advice and discussion. Karen Anderson, John Chaput, and Josh LaBaer for sharing reagents and instrumentation, Michael Gaskin and Andrea Throop for technical advise and protocols. Justin Wolter is a Maher scholar and thanks the Maher family for their generous support.

<html> 1.細胞培養（トランスフェクション前に24〜48時間） <ol><li>トランスフェクション前の種子に対して24〜48時間、96ウェルプレートの数に基づいて、HEK293T細胞の十分な量は、トランスフェクトされます。 注：一貫性のあるトランスフェクションのために、十分な密度でプレート細胞は急速な分裂を優先するように、まだトランスフェクションの時点で以上70〜90％の集密度になりませ?...

<ol>
	<li>Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs:+genomics,+biogenesis,+mechanism,+and+function.">MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function.</a> Cell. 116 (2), 281-297 (2004).</li><li>Pasquinelli, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Conservation+of+the+sequence+and+temporal+expression+of+let-7+heterochronic+regulatory+RNA.">Conservation of the sequence and temporal expression of let-7 heterochronic regulatory RNA.</a> Nature. 408 (6808), 86-89 (2000).</li><li>Reinhart, B. J., Weinstein, E. G., Rhoades, M. W., Bartel, B., Bartel, D. 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S., Behm, M., Lagergren, J., Ohman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A-to-I+editing+of+microRNAs+in+the+mammalian+brain+increases+during+development.">A-to-I editing of microRNAs in the mammalian brain increases during development.</a> Genome Res. 22 (8), 1477-1487 (2012).</li><li>Fu, Y., Dominissini, D., Rechavi, G., He, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+regulation+mediated+through+reversible+m(6)A+RNA+methylation.">Gene expression regulation mediated through reversible m(6)A RNA methylation.</a> Nat Rev Genet. 15 (5), 293-306 (2014).</li><li>Zhou, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large-scale+screens+of+miRNA-mRNA+interactions+unveiled+that+the+3'UTR+of+a+gene+is+targeted+by+multiple+miRNAs.">Large-scale screens of miRNA-mRNA interactions unveiled that the 3'UTR of a gene is targeted by multiple miRNAs.</a> Plos One. 8 (7), e68204 (2013).</li><li>Dyer, B. W., Ferrer, F. A., Klinedinst, D. K., Rodriguez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+noncommercial+dual+luciferase+enzyme+assay+system+for+reporter+gene+analysis.">A noncommercial dual luciferase enzyme assay system for reporter gene analysis.</a> Anal Biochem. 282 (1), 158-161 (2000).</li><li>Seiler, C. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNASU+plasmid+and+PSI:Biology-Materials+repositories:+resources+to+accelerate+biological+research.">DNASU plasmid and PSI:Biology-Materials repositories: resources to accelerate biological research.</a> Nucleic Acids Res. , (2013).</li><li>Baek, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microRNAs+on+protein+output.">The impact of microRNAs on protein output.</a> Nature. 455 (7209), 64-71 (2008).</li><li>Ebert, M. S., Sharp, P. 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3&#39;LIFEアッセイは、高スループットでの3&#39;UTR中の機能のmiRNAのターゲットを識別します。このアッセイは、実験的に興味のあるmiRNAのための推定上の多数のターゲットを特定したい研究者のために有用です。アッセイがmiRNAの標的の機能的尺度を提供し、単一のmiRNAに対する3&#39;UTR ::シングルレポーターのバイナリテストが自信を持って取り組むことができるという点で、3&#39;LIFEアッセイ?...

この方法の全体的な目標は、検出し、正確に高スループットでマイクロRNA（miRNAの）ターゲットをマッピングすることです。 miRNAは、長さが約22ヌクレオチドの内因性の非コードRNAです。転写および処理に続いて、成熟miRNAは、タンパク質複合体中に組み込まれる（RISC）、複雑なRNA誘導サイレンシングと呼ばれます。各miRNAは、翻訳抑制またはmRNA切断1のいずれかで得られた、主にメッセンジャーRNAの3 &#39;非翻訳領域（3&#39;UTRを）（mRNAを）に位置要素を標的とするためにRISCを誘導します。 miRNAは、標準的なワトソン - クリックしてGに基づいて、標的部位を認識する：Uは、塩基対形成をウォブルし、本質的に縮重している、複数のミスマッチ塩基対を含有し、領域を膨らみました。多くのmiRNAが広く、彼らは生物学的役割の多様な範囲を再生する人間2,3に植物から保存されています。後生動物ではmiRNAは、細胞運命の決定4、発生のタイミング5を含む複数の生物学的プロセスに影響を与えることができます</sup&gt;、および頻繁に組織特異的な発現パターン6,7を示します。誤発現のmiRNAは、標的遺伝子の機能のみに基づいて細胞の挙動に大きな影響を持つことができ、異常な遺伝子調節をもたらすことができます。このように、miRNAは、神経変性8,9、糖尿病10及び11を含む癌疾患の広範囲に連結されています。バイオインフォマティクスとウェットベンチアプローチは各miRNAは、ハイスループットまたはゲノムワイドアプローチは潜在的な相互作用のこの大きなプールをプローブするために必要であることを示している、別個のmRNA 12-14の千数百人を標的にすることが可能であり得ることを示唆しています。 標的遺伝子を同定することは機構的に定義するmiRNAの機能の重要なコンポーネントであり、そうするために研究者が大規模に目標を明らかにすることができなければなりません。いくつかのアプローチは、バイオインフォマティクスの予測アルゴリズムを含む、miRNAの標的を同定するためのハイスループットシークエンシングが開発されていますターゲットとするmRNA、およびレポーターに基づくアッセイの。これらのアプローチのそれぞれが固有の長所と短所を持っています。 miRNAのターゲティングは、配列特異性によって案内されることを考えると、最も特にmiRNAのヌクレオチド2~6の、いくつかのアルゴリズムは、多くの生物のゲノム全体のmiRNA標的を予測するために開発されてきた（シード領域と呼ばれます）。これらのアルゴリズムは、検証済みのmiRNA標的の観察された塩基対形成のモチーフを使用して訓練し、頻繁にこのような厳しいシードのペアリング、サイトの保全、および/ ​​または熱力学的安定性15などのパラメータを利用しています。これらのフィルタは唯一の信頼度の高いターゲットに十分な相補性を有する推定多数のターゲットを絞り込みながら、彼らは、最近の証拠は16-24普及している示唆している種特異的および非標準のmiRNA標的部位を、除外することができます。また、これらの予測は、このような代替ポリアデニル化などのmiRNA標的部位を除外mRNAプロセシングのための仕組み、に取ることはありません25、26 RNA 編集 、RNAのメチル化27、及び協同的結合。このように、高い偽陽性および偽陰性率は、多くのアルゴリズム22,24,28のために報告されています。これらのアルゴリズムは、その後の実験的検証のための候補miRNAの標的を同定するのに有用であるが、これらの高いエラー率が系統的miRNA標的の検出のためのバイオインフォマティクスアプローチの有効性を制限します。 体系的に与えられたmiRNAの間の相互作用および潜在的標的と3&#39;UTRを探索するために、我々はの3&#39;UTR（3&#39;LIFE）24での機能要素の蛍光同定と呼ばれるハイスループットアッセイを開発しました。このアッセイは、直接的な相互作用およびデュアルルシフェラーゼレポーターシステムを使用してクエリのmiRNAによる試験3&#39;UTRの翻訳抑制。この系において、目的の遺伝子の3&#39;UTRは、ホタルルシフェラーゼ（Fluc細胞）レポーターリーディングフレームの下流にクローニングされます。レポーター短所tructは、HEK293T細胞内のクエリのmiRNAで共トランスフェクトされます。 miRNAのターゲティングは、試験Fluc細胞:: 3&#39;UTRレポーターおよび第非特異的ウミシイタケルシフェラーゼレポーターの間の相対的な変化を測定することによって決定されます。重要なのは、ルシフェラーゼアッセイは、レポーターの翻訳出力に影響を与える機能のmiRNA / mRNAの相互作用を検出します。このことは、これは3&#39;UTR基づく規制の独立したタンパク質の存在量のmRNAの分解や翻訳抑制の違いだけでなく、変化を迂回するには、そのようなRT-qPCRのやウェスタンブロットなどのmiRNA調節を検出する従来の方法に比べて重要な利点です。 ルシフェラーゼアッセイは、広く、それらの相対的な単純性と感度の直接のmiRNAの標的を検証するために利用されている、まだハイスループットスクリーニングにおけるそれらの使用は、高い消耗品試薬に関連するコスト、公共の情報源からの3&#39;UTRライブラリーの欠如、および存在しないことによって制限されています標準化されたルシフェラーゼのprotのocols、複数のデータセット全体での機能抑制を比較する際に困難をもたらします。 3&#39;LIFEアッセイの使用を容易にするために、我々は定期的に更新して展開され3&#39;UTRライブラリを作成、実験デザイン、非商業的なトランスフェクション24、ルシフェラーゼ試薬29の利用の簡素化に重点を置いて、を介して利用できました公共プラスミドリポジトリ30。 3&#39;LIFEアッセイのスケーラビリティは、バイオインフォマティクス同定された遺伝子の方の画面にバイアスをかけることなく、与えられたmiRNAによって標的化するための大きな3&#39;UTRライブラリーのスクリーニングを可能にします。標準的な予測の相互作用を試験することに加えて、この体系的なアプローチは、非標準および/または種特異的な相互作用を介して駆動される新規標的の同定を可能にします。重要なことは、タンパク質の産生を対象miRNAの効果は、一般的に控えめな翻訳抑制15,31 &lt;をもたらすことが理解されています/ SUP&gt;、miRNA調節の主な役割は、タンパク質の出力を微調整し、遺伝子発現の異常なレベルから保護し、細胞の特定のプログラム32,33にロバスト性を提供することであることを示唆しています。 3&#39;LIFE画面における負のmiRNA / mRNAの相互作用の本質的に多数と組み合わせルシフェラーゼアッセイの感度は、多数の遺伝子に標的化miRNAの微妙な効果の検出を可能にし、その遺伝子ネットワークの複数のコンポーネントの識別与えられたmiRNA 24によって規制されています。 ここでは、3&#39;LIFEプロトコルを記述し、275人の3&#39;UTRを（ 図1）のパネルに対して2つの十分に特徴付けられたmiRNA、 のmiR-10Bおよびlet-7cとをスクリーニングすることによって、それが実現可能だ実証します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="406">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Reagents</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">glycylglycine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1127-25G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Kx PO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P2222</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EGTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E3889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ATP</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">FLAAS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DTT</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">MgSO4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M7506</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CoA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C4282</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">luciferin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L9504</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S7653</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2EDTA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">E0399</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">K H2 P O4</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1551139</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">BSA</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A2153</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaN3</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">S2002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Coelenterazine</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">C3230</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS/HEPES</td>
			<td style="width:71px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">21-040-CV</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">D5546</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FBS</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">F2442</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Pennicilin/Streptomicin</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">P4333</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;">T2600000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Consumables</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MaxiPrep Kit</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">A2392</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well miniprep plate</td>
			<td style="width:71px;">Pall</td>
			<td>8032</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well shuttle plates</td>
			<td style="width:71px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">V4SP-2096</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">5x Lysis Buffer</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td>E1941&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;"></td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Instruments</td>
			<td style="width:71px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well GloMax Plate Reader</td>
			<td style="width:71px;">Promega</td>
			<td style="width:119px;">E9032</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Biomech FX Liquid Handler Robot</td>
			<td style="width:71px;">Beckmann</td>
			<td style="width:119px;">A31842</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">4D-Nucleofector Core Unit</td>
			<td style="width:71px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">AAF-1001</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">96-well Shuttle System</td>
			<td style="width:71px;">Lonza</td>
			<td style="width:119px;">AAM-1001</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Cell Counter Countess</td>
			<td style="width:71px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C10227</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of mirna targets in high-throughput using the 3'life assay

の3&#39;UTR中の機能要素の発光識別（3&#39;LIFE）は、照会の3&#39;UTRの何百もの配列内の特定のmiRNAの標的の迅速な同定を可能にします。標的の同定は、miRNAが標的との機能的読み出しを与え、翻訳出力を測定することによって、mRNAレベルでの結合を検出するデュアルルシフェラーゼアッセイに基づいています。 3&#39;LIFEが可能でコスト効率のゲノムワイドな画面を作り、非独占バッファーと試薬、および公的に利用可能なレポーターライブラリを使用しています。 3&#39;LIFEは、標準的な実験室の設定のいずれかで行うか、液体処理ロボットや他の高スループットの計測器を使用してスケールアップすることができます。私たちは人間の96ウェルプレート中でクローニングの3&#39;UTR、および2つのテストのmiRNAのデータセットを使用してのアプローチを例示し、及びmiR-10B-7Cてみましょう 。我々は、96ウェルフォーマットにおいてDNAの調製、トランスフェクション、細胞培養およびルシフェラーゼアッセイを行い、データのためのツールを提供する方法を示し分析。結論3&#39;LIFEで体系的、迅速、高い再現性であり、かつ高い信頼性目標を識別します。

照度計の出力ファイルには、ホタルおよびウミシイタケルシフェラーゼタンパク質の両方の生の測定値が含まれています。と- MangoneラボのWebサイト（から入手可能な「3&#39;LIFE多分析」スプレッドシート-この生の形式は、「単板分析3&#39;LIFE」と互換性があり<a href="http://www.mangonelab.com">www.mangonelab.com</a> ）。単板解析スプレッドシートを自動的にホタル/ ウミシイタケ比を計算し、...

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Detection of miRNA Targets in High-throughput Using the 3'LIFE Assay

Luminescent identification of functional elements in 3&#8217; untranslated regions (3&#8217;UTRs) (3&#8217;LIFE) is a technique to identify functional regulation in 3&#8217;UTRs by miRNAs or other regulatory factors. This protocol utilizes high-throughput methodology such as 96-well transfection and luciferase assays to screen hundreds of putative interactions for functional repression.

3&#39;LIFEアッセイを用いた高スループットにおけるmiRNA標的の検出

Luminescent Identification of Functional Elements in 3&#8217;UTRs (3&#8217;LIFE) allows the rapid identification of targets of specific miRNAs within an ...

Research

JoVE Journal

Biology

High-throughput Saccharification Assay for Lignocellulosic Materials

リグノセルロース系材料のためのハイスループット糖化アッセイ

Polysaccharides that make up plant lignocellulosic biomass can be broken down to produce a range of sugars that subsequently can be 
used in establishing ...

生物学

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ミッションターゲットIDのライブラリを使用してmiRNAのターゲットのゲノムワイドスクリーン

The Target ID Library is designed to assist in discovery and identification of microRNA (miRNA) targets. The Target ID Library is a plasmid-based, ...

High-throughput Crystallization of Membrane Proteins Using the Lipidic Bicelle Method

脂質Bicelle法を用いた膜タンパク質のハイスループット結晶化

Membrane proteins (MPs) play a critical role in many physiological processes such as pumping specific molecules across the otherwise impermeable membrane ...

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

自動化を使用して染色体のハイスループット物理マッピング<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

Genome-wide Gene Deletions in Streptococcus sanguinis by High Throughput PCR

ゲノムワイドな遺伝子欠失で<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;ハイスループットPCRによる

Transposon  mutagenesis and single-gene deletion are two methods applied in genome-wide  gene knockout in bacteria 1,2. Although transposon mutagenesis is ...

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High-throughput Functional Screening using a Homemade Dual-glow Luciferase Assay

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We present a rapid and inexpensive high-throughput screening protocol to identify transcriptional regulators of alpha-synuclein, a gene associated with ...

High-throughput Screening for Chemical Modulators of Post-transcriptionally Regulated Genes

転写後調節される遺伝子の化学モジュレーターのためのハイスループットスクリーニング

Both transcriptional and post-transcriptional regulation have a profound impact on genes expression. However, commonly adopted cell-based screening assays ...

Identification of Kinase-substrate Pairs Using High Throughput Screening

ハイスループットスクリーニングを使用したキナーゼ基質ペアの同定


We have developed a screening platform to identify dedicated human protein kinases for phosphorylated substrates which can be used to elucidate novel ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

高スループット<em&gt;ゼブラフィッシュ</em&gt;エネルギー消費アッセイ

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...