Name: methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche
Uploaded: 2015-03-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche at JoVE.com

Disse undersøgelser blev finansieret dels ved tilskud fra Alternative forskning og udvikling Foundation (107.588), National Institute of Health (1U54CA136465-04S1), og California Breast Cancer Research Program (201B-0141). Vi takker Drs. Andrew Wilber og R. Scott McIvor for den generøse donation af deres <pkt2 lubig=""> transponson og PK / hUbiC-SB11 transposasesekvenser plasmider. Vi takker John Tamaresis, Ph.D. for rådgivning om statistiske metoder, Timothy Brown til udførelse flowcytometri, Georgette Henrich for rådgivning om migrations assays, og Nancy Bellagamba for at lette indsamling af THR prøver. </pkt2>

Femurhoveder blev indsamlet fra patienter, der gennemgår elektiv THR kirurgi i Ortopædkirurgisk Afdeling på Stanford University School of Medicine. Alle væv blev indsamlet som de identificerede fælder i overensstemmelse med reglerne i Stanford University Research compliancefunktion. 1. Valg af en brystcancercellelinie (s) <ol><li> Opnå eller transficere den ønskede brystcancer-cellelinie (r) med en luciferase-GFP reporter konstrukt. De følgende eksperimenter blev udført under anvendelse af MDA-MB-231 ...

Mehra et al. Har tidligere beskrevet obduktion indsamling og analyse af knogle prøver fra metastatisk prostatacancer patienter høstet på tidspunktet for obduktion, afslørende kvalitet væv høje og validering af anvendelsen af menneskelige knogle prøver at studere den metastatiske proces 47. Her har vi beskrevet protokoller til indsamling, bearbejdning og anvendelse af humane knogle væv fragmenter opnået fra kasserede femurhoveder efter THR kirurgi i en kortsigtet co-kultur for at studere brys...

Tumoren mikromiljø er bredt anerkendt som en kritisk faktor for kræft celle opførsel under brystkræft progression og metastatisk spredning 1-3. Målet med fremgangsmåden fremlagt her er at lette undersøgelsen af brystcancerceller i mikromiljøet af humant knoglevæv, den hyppigste sted for brystkræft metastase 4-6. Bone består af mineraliseret og marv rum 7-9, som begge huser celler og secernerede faktorer impliceret i metastatisk progression 10,11. Selvom meget udbredt i vivo musemodeller lette systemiske undersøgelser af den metastatiske proces 12-15, celle interaktioner inden skelettet er ikke let tilgængelige for observation og direkte forstyrrelse. Modelsystemer til at studere og dyrkning mus knoglevæv og mus marv celler giver bedre adgang og har givet mange indsigter om krydstale og mekanismer der ligger til grund brystkræft celle metastasis af det murine skelet 16-22. Men undersøgelser har antydet, at der kan være artsspecifikke mønstre af osteotropism for knoglevæv 23,24. Disse mønstre kan afspejle iboende artsspecifikke forskelle i knoglevæv egenskaber, forskelle som følge af ændrede knoglemarv befolkninger i immun-mangel mus 11, og / eller den relativt unge alder af mus anvendes til forsøg, som alle er sandsynlige determinanter for knoglen mikromiljø. In vitro fremgangsmåder til at studere brystcancerceller i humane knogler co-kulturer har typisk fokuseret på specifikke knogle celletyper såsom marvafledte osteoblaster eller stromale celler dyrket som monolag eller inden manipulerede 3-dimensionel model systemer 25-35. Selvom 2-dimensional cellekulturmodeller har dannet grundlaget for in vitro metoder til kræftforskning, har det længe været anerkendt, at celle adfærd fundamentalt ændres hos monolayer dyrkningssystemer 18,36,37. Dette har ført til udvikling af manipulerede mikromiljøer, som efterligner kompleksiteten af ​​3-dimensionelle levende væv, herunder matrix- og scaffold-baserede modeller sammensat af naturlige materialer såsom collagen, eller syntetiske polymerer podet med specifikke celletyper til at skabe vævslignende mikromiljøer 36-41. Udviklet tilgange har også brugen af bioreaktor platforme til at kontrollere og studere hormonale miljø i mikromiljø 18,19,41-43. Selv biomimetiske modeller og bioreaktorer giver mange elementer af et komplekst væv mikromiljø i en kontrolleret indstilling, og er blevet anvendt med held til at fremme studiet af brystkræft metastase til knogle 18,19,35,42,43, behøver konstruerede modelsystemer generelt ikke optage det fulde spektrum af celletyper og ekstracellulære matrixbestanddele til stede i det native knogle miljø. Indtil for nylig, brystcancerceller er ikke blevet undersøgt i det native, intakte, 3-dimensionelle mikromiljø humane knoglevæv. Vi har for nylig rapporteret udvikling af en co-kultur model ved hjælp af menneskelige knogle vævsfragmenter isoleret fra total hoftealloplastik (THR) kirurgi prøver 44. Disse prøver havnen både de mineraliserede og marv rum, der er nødvendige for at studere mekanismerne bag mikro-metastaser på kort sigt kultur. I tidligere arbejde etablerede vi proof-of-principle for brug af bioluminescens imaging (BLI) til at overvåge udbredelsen af luciferase-udtrykkende brystkræftceller (MDA-MB-231-Fluc) co-dyrket med knoglerester 44. Her præsenterer vi detaljerede forsøgsprotokoller til at studere brystkræft celle kræft proliferation, kolonisering, og migration inden for rammerne af den native mikromiljø ved anvendelse af human knogle vævseksplantater. Først præsenterer vi en protokol for co-dyrkning brystkræftceller støder op til knoglerester til at måle brystcelleproliferation ved hjælp BLI. I dette afsnit er bryst-suspensioner seedet som celle pletter i 6-brønds plader støder op til knoglerester, som er immobiliseret ved stykker af knogle voks. Kontrolbrønde indeholder knoglevoks, men ingen knogle fragment. Når celle spots vedhæfte tilsættes medium og pladen dyrkes i 24 timer, hvorefter bioluminescerende signal intensitet (associeret med celle nummer) måles med BLI. I det næste trin præsenteres metoder til co-dyrkning af brystcancerceller podet direkte på knoglerester at studere kolonisering og proliferation. Her bryst cellesuspensioner pipetteres direkte på knoglevævet fragmenter, som overvåges i kultur ved BLI og fluorescensmikroskopi tiden at spore kolonisering og celleantal. Ved denne fremgangsmåde kan marven rum skylles fra knoglerester på ethvert tidspunkt til analyse af koloniserede brystcancerceller ved flowcytometri eller marv levedygtighed assays. Derudover har vi deaktiveresScribe to forskellige tilgange til måling brystkræft celle migration. Ved den første metode er skitseret trin til måling af migrering til knoglevæv kultursupernatanter. I denne protokol brystcancercellerne podes på den indre, øvre overflader af Transwell indsætte membraner med en 8 um porestørrelse (som vist i figur 1A). Skærene bliver derefter anbragt i en modtager plade med brønde indeholdende knoglevæv supernatant eller kontrol medie. I løbet af en 20 timers inkubationsperiode lille antal brystcancerceller migrerer gennem indsatsen membraner ned i de nedre vævskulturbrønde hvor de er tilsluttet til påvisning af BLI. I den anden overførselsmetode brystcancercellerne podes på de nedre, ydre overflader af Transwell insert membraner. Bone vævsfragmenter anbringes i insert bægre og brystcancerceller migrerer op gennem membranerne til at kolonisere knoglerester (som vist i figur 1B), somderefter filmede med BLI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16600-082</td>
			<td>Supplement all McCoy&#39;s&#160; with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillen Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blastocidin (10 mgl/ml)</td>
			<td>InvivoGen&#160;</td>
			<td>ant-bl</td>
			<td>Supplement media used for transfected cell lines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 &#956;m pore size)</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*</td>
			<td>Invitrogen Detection Technologies</td>
			<td>L-3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A18967-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16021-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wax</td>
			<td>Surgical Specialties Corporation</td>
			<td>903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS 50 Imaging Platform</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software Program&#160;</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td>133026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Version 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 680 EX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>Clone (AE1/AE3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche

Bone er den mest almindelige sted for brystkræft metastaser. Selv om det er almindeligt accepteret, at mikromiljø påvirker kræft celle adfærd, er lidt om brystkræft celle egenskaber og adfærd inden for native mikromiljø af humant knoglevæv. Vi har udviklet metoder til at spore, kvantificere og modulerer humane brystkræftceller i mikromiljø dyrkede humane knogle vævsfragmenter isoleret fra kasserede femurhoveder efter total hoftealloplastik operationer. Brug af brystkræftceller manipuleret for luciferase og forbedrede grønt fluorescerende protein (EGFP) udtryk, er vi i stand til at reproducerbart kvantificere migration og spredning mønstre ved hjælp af bioluminescens imaging (BLI), spor celleinteraktioner inden knoglerester ved hjælp af fluorescens mikroskopi, og evaluere brystceller efter kolonisering med flowcytometri. De vigtigste fordele ved denne model omfatter: 1) en indfødt, arkitektonisk intakt væv microenvironment der omfatter relevante humane celletyper, og 2) direkte adgang til mikromiljø, hvilket letter hurtig kvantitativ og kvalitativ overvågning og forstyrrelse af bryst og ben celle egenskaber, adfærd og samspil. En primær begrænsning, på nuværende tidspunkt, er det endelige levedygtighed vævsfragmenter, der begrænser vinduet i studiet til kortsigtet kultur. Anvendelser af modelsystemet omfatter studere den grundlæggende biologi brystkræft og andre knogle-søger maligniteter i metastatisk niche, og udvikle terapeutiske strategier til effektivt målrettet brystkræftceller i knoglevæv.

Isolering vævsfragmenter fra femurhoveder Femurhoveder blev indsamlet fra lige mange mandlige og kvindelige patienter (44-90 år), der gennemgår elektiv total hoftealloplastik i Ortopædkirurgisk Afdeling på Stanford University School of Medicine. Hver kasseret lårbenshovedet indeholder en lille del af den øvre lårben, som huser trabekulære knoglevæv sammensat af mineraliserede spikler og marv. Dette væv er tilgængelige gennem kirurgisk eksponeret tværsnit af akslen (figur...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche at JoVE.com

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Protokoller er beskrevet til at studere brystcancercelle migration, proliferation og kolonisering i et humant knoglevæv eksplantatet modelsystem.

Metoder til dyrkning menneskelige femur vævseksplantater at studere Breast Cancer Cell kolonisering af metastatisk Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Humane Neuroendokrine tumorcellelinier som en tredimensional model for studiet af den menneskelige Neuroendokrine Tumor Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Anvendelse af omvendt fase-protein Arrays (RPPA) at udforske Protein Expression Variation i de enkelte renalcellecarcinom Kræft

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Indledning af metastatisk brystkræft karcinom ved Målretning af Duktalt epitel med Adenovirus-Cre: A Novel transgene mus Model for brystkræft

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Profilering af østrogen-regulerede MicroRNA i brystkræftceller

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Tredimensionelle Cultures: Et værktøj til at studere Normal Acinar Architecture vs malign transformation af brystkræft celler

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Ortotopisk Injektion af brystkræft celler i brystfedtpuden af ​​mus til at studere tumorvækst.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Model til Uddannelse hormonvirkning i Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Mammosphere Dannelse Assay fra human brystkræft væv og cellelinier

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...