Name: methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche
Uploaded: 2015-03-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche at JoVE.com

מחקרים אלו מומנו, בין שאר, על ידי מענקים מהאלטרנטיביים למחקר ופיתוח (107,588), המכון הלאומי לבריאות (1U54CA136465-04S1), ותכנית לחקר סרטן שד קליפורניה (201B-0141). אנו מודים בני הזוג. אנדרו וילבר ור &#39;סקוט McIvor לתרומתם הנדיבה שלהם <pkt2 lubig=""> פלסמידים transposase transponson וPK / hUbiC-SB11. הכרת תודה אנו מודים ג&#39;ון Tamaresis, Ph.D. לקבלת ייעוץ על שיטות סטטיסטיות, טימותי בראון לביצוע cytometry זרימה, ג&#39;ורג&#39;ט היינריך לקבלת ייעוץ על מבחני הגירה, וננסי Bellagamba להקלה על האוסף של דגימות THR. </pkt2>

ראש עצם הירך נאסף מחולים שעברו ניתוח THR בחירה במחלקה לכירורגיה אורטופדיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד. כל הרקמות נאספו כדגימות זוהתה de בהתאם לתקנות של משרד Compliance מחקר באוניברסיטת סטנפורד. 1. בחירת שורת תאי סרטן השד (ים) <ol style=";text-al...

Mehra et al. תיאר בעבר את אוסף הנתיחה שלאחר המוות וניתוח של דגימות עצם של חולי סרטן ערמונית גרורתי שנקטפו בעת הנתיחה שלאחר המוות, חושף רקמות באיכות גבוהות ואימות של השימוש בדגימות עצמות אדם ללמוד את התהליך גרורתי 47. כאן יש לנו תארנו פרוטוקולים לאיסוף, עיבוד ושימ...

מייקרו-הסביבה של הגידול להכרה רחבה כקובע קריטי של תאים סרטניים התנהגות במהלך התקדמות סרטן השד גרורתי והתפשטה 1-3. המטרה של השיטה שהוצגה כאן היא להקל על המחקר של תאי סרטן השד במייקרו-הסביבה של רקמת עצם אנושי, האתר השכיח ביותר לגרורות סרטן השד 4-6. עצם מורכב מתאי mineralized ומח 7-9, אשר שניהם נמל תאים וגורמים מופרשים מעורבים בהתקדמות גרורתי 10,11. למרות שימוש נרחב במודלים של עכברי vivo להקל על מחקרים מערכתיים של התהליך גרורתי 12-15, אינטראקציות תא בתוך השלד אינן נגישים לתצפית והפרעות ישירות. מערכות מודל ללימוד וculturing רקמות עצם עכבר ותאי מח העכבר לספק גישה טובה יותר והניבו תובנות רבות לגבי crosstalk ומנגנונים מ &#39;תאי סרטן שדetastasis של השלד העכברי 16-22. עם זאת, המחקרים הראו כי ייתכן שיש מינים ספציפיים דפוסי osteotropism לרקמת עצם 23,24. דפוסים אלה יכולים לשקף מינים ספציפיים הגלומים הבדלים במאפייני רקמת עצם, הבדלים הנובעים מאוכלוסיות מח העצם שינו בעכברי חיסון לקוי 11, ו / או גיל צעיר יחסית של עכברים המשמש בניסויים, שכולן עשויים גורמים של העצם מייקרו-סביבה. במבחנה גישות ללימוד תאי סרטן השד בשיתוף תרבויות עצם אנושיות התמקד בדרך כלל על סוגי תאי עצם ספציפיים כגון osteoblasts-נגזר מח עצם או תאי סטרומה מתורבתים כמו monolayers או בתוך מערכות מודל 3 ממדים מהונדסים 25-35. למרות שמודלי תרבית תאים 2 ממדים יצרו עמוד התווך של במבחנה גישות לחקר סרטן, זה כבר זמן רב הכיר בכך שהתנהגות התא משתנה מן היסוד במ &#39;onolayer מערכות תרבות 18,36,37. זה הוביל לפיתוח של מייקרו-סביבות מהונדסות המחקות את המורכבות של רקמות חיות 3 ממדים, כולל מטריצה ​​ומודלים מבוססי פיגום המורכב מחומרים טבעיים כמו קולגן, או פולימרים סינטטיים שנזרעו עם סוגי תאים מסוימים ליצירת מייקרו-סביבות כמו רקמה- 36-41. גם גישות מהונדסות כללו שימוש בפלטפורמות bioreactor לשלוט וללמוד את הסביבה ההורמונלית של מייקרו-הסביבה 18,19,41-43. למרות שמודלים וbioreactors biomimetic לספק אלמנטים רבים של מייקרו-סביבת רקמה מורכבת בסביבה מבוקרת, ויושמו בהצלחה על מנת לקדם את המחקר של גרורות סרטן השד לעצם 18,19,35,42,43, מערכות מודל מהונדסות בדרך כלל אינן לשלב הספקטרום המלא של סוגי תאים ורכיבי מטריצה ​​תאיים הנוכחיים בסביבת עצם הילידים. עד לאחרונה, סרטן השדתאים לא נחקרו במייקרו-הסביבה המקומית, שלם, 3 ממדים של רקמות עצם אנושיות. לאחרונה דיווחו על ההתפתחות של מודל שיתוף תרבות באמצעות שברי רקמה אנושיים עצם מבודד מסך החלפת מפרק ירך ניתוח (THR) דגימות 44. דגימות אלה נמל שני תאי mineralized ומח הצורך ללמוד מנגנוני מיקרו-גרורות בתרבות טווח קצרה. בעבודה קודמת הקמנו הוכחה של עיקרון לשימוש בהדמית פליטת אור (BLI) כדי לפקח על ההתפשטות של תאים (מד&quot;א MB-231-fLuc) שיתוף תרבותי עם שברי עצמות 44 להביע לוציפראז סרטן השד. כאן אנו מציגים מפורטים פרוטוקולי ניסוי ללימוד התפשטות תאי סרטן שד, קולוניזציה, והגירה בהקשר של מייקרו-הסביבה המקומית באמצעות explants רקמת עצם אנושי. ראשית אנו מציגים פרוטוקול לתאי סרטן שד שיתוף culturing סמוכים לברי עצמות למדוד שדהתפשטות תאים באמצעות BLI. בסעיף זה, השעיות תא שד הם זורעים ככתמי תא 6 צלחות גם בסמוך לברי עצמות, שהם משותקים על ידי חתיכות של שעוות עצם. בארות בקרה מכילות שעוות עצם, אך לא שבר עצם. ברגע שכתמי תא לצרף, בינוני הוא הוסיף את הצלחת היא בתרבית למשך 24 שעות, לאחר שעוצמת אות bioluminescent (הקשורים במספר תא) נמדדת עם BLI. בשלב הבא אנו מציגים שיטות לתאי סרטן שד culturing-שיתוף זרע ישירות על גבי שברי עצמות ללמוד קולוניזציה ושגשוג. כאן השעיות תא השד pipetted ישירות על גבי שברי רקמת העצם, שנמצאים תחת פיקוח בתרבות על ידי BLI ומיקרוסקופ פלואורסצנטי לאורך זמן כדי לעקוב אחר קולוניזציה ומספר תא. בשיטה זו, תא מוח יכול להיות סמוק מברי עצמות בכל נקודה לניתוח של תאי סרטן השד יישבו על ידי זרימת זמן cytometry, או מבחני כדאיות מח. בנוסף, אנו מבטליםסופר שתי גישות שונות למדידת נדידת תאי סרטן השד. בשיטה הראשונה צעדים מפורטים למדידת הגירה כלפי supernatants תרבית רקמת עצם. בפרוטוקול זה תאי סרטן השד הם זורעים על גבי המשטחים הפנימיים, העליונים של Transwell להכניס קרומים עם גודל נקבובית 8 מיקרומטר (כפי שמוצגים באיור 1 א). לאחר מכן מוסיף ממוקמים לתוך צלחת מקלט עם בארות המכילות supernatant רקמת עצם או בינוני שליטה. במהלך תקופת דגירה 20 שעות, מספר קטן של תאי סרטן השד להעביר דרך הממברנות להכניס לתוך בארות תרבית הרקמה הנמוכות שבו הם מייחסים לגילוי על ידי BLI. בשיטה השנייה הגירת תאי סרטן השד הם זורעים על גבי המשטחים התחתונים, החיצוניים של קרומים להוסיף Transwell. שברי רקמת עצם ממוקמים לתוך הכוסות להוסיף ותאי סרטן השד להעביר דרך ממברנות ליישב את שברי עצמות (כפי שמוצגים באיור 1), שלאחר מכן צילם באמצעות BLI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16600-082</td>
			<td>Supplement all McCoy&#39;s&#160; with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillen Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blastocidin (10 mgl/ml)</td>
			<td>InvivoGen&#160;</td>
			<td>ant-bl</td>
			<td>Supplement media used for transfected cell lines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 &#956;m pore size)</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*</td>
			<td>Invitrogen Detection Technologies</td>
			<td>L-3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A18967-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16021-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wax</td>
			<td>Surgical Specialties Corporation</td>
			<td>903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS 50 Imaging Platform</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software Program&#160;</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td>133026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Version 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 680 EX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>Clone (AE1/AE3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche

עצם הוא האתר הנפוץ ביותר של גרורות סרטן השד. למרות שזה מקובל שסרטן השפעות מייקרו-סביבת התנהגות התא, מעט מאוד ידוע על מאפייני סרטן שד תא והתנהגויות בתוך מייקרו-הסביבה המקומית של רקמת עצם אנושית. פיתחנו גישות כדי לעקוב אחר, לכמת ולווסת את תאי סרטן השד אנושיים במייקרו-הסביבה של שברים בתרבית רקמת עצם אנושיים מבודדים מראשי הירך הושלכו הבאים כולל ניתוחי החלפת מפרק ירך. שימוש בתאי סרטן השד מהונדס ללוציפראז ומשופר חלבון פלואורסצנטי ביטוי ירוק (EGFP), אנו יכולים לכמת reproducibly דפוסי הגירה והתפשטות שימוש בהדמית פליטת אור (BLI), אינטראקציות תא מסלול בתוך שברי העצמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ולהעריך את תאי שד לאחר קולוניזציה עם cytometry זרימה. היתרונות העיקריים של מודל זה כוללים: 1) microe ילידים, ארכיטקטוני שלם רקמהnvironment הכולל סוגי תאים אנושיים רלוונטיים, ו- 2) גישה ישירה למייקרו-הסביבה, המאפשר כמותית מהירה וניטור איכותי והפרעות של נכסי שד ותאי עצם, התנהגויות ואינטראקציות. מגבלה העיקרית, כיום, היא הכדאיות סופית של שברי הרקמות, אשר מגביל את החלון של מחקר לתרבות לטווח קצר. יישומים של מערכת המודל כוללים מחקר על הביולוגיה הבסיסית של סרטן השד וגידולים ממאירים המבקש עצם אחרים בתוך הנישה גרורתי, ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות למקד ביעילות תאי סרטן השד ברקמות עצם.

בידוד ברי רקמה מראשי הירך ראש עצם הירך נאסף ממספר שווה של גברים ונשים חולים (44-90 שנים) שעבר ניתוח להחלפת מפרק ירך בחירה במחלקה לכירורגיה אורטופדיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד. כל ראש עצם הירך הושלך מכיל חלק קטן של עצם ה...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche at JoVE.com

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

פרוטוקולים מתוארים ללימוד הגירה של תאי סרטן השד, התפשטות והתנחלות במערכת מודל explant רקמת עצם אנושית.

שיטות לExplants רקמות Culturing עצם ירך האדם ללמוד התיישבות תאי סרטן השד גרורתי של הנישה

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

שיטה לפיתוח נגד סרטן רומן והתרופות באמצעות Explants גידול של דגימות כירורגי


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

במבחנה מערכת לחקר תרדמת גידול ואת החלף ל גידול גרורתי

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

האדם תאים סרטניים נוירואנדוקריניים קווים כמו מודל תלת ממדי לחקר הטיפול האנושי גידול נוירואנדוקריניים

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

השימוש במערכי חלבון שלב הפוכים (RPPA) לחקור וריאצית ביטוי חלבון בתוך הסרטן של תאי כליה בודד

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

חניכה של סרטן השד גרורתי על ידי מיקוד של האפיתל ductal עם Adenovirus-Cre: דגם רומן מהונדס עכבר של סרטן השד

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

שלוש תרבויות ממדים: כלי ללמוד רגיל אדריכלות acinar לעומת שינוי ממאיר של תאי שד

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

הזרקת orthotopic של תאי סרטן השד לחלב שומן Pad של עכברים לחקר התפתחות גידול.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

<em&gt; Ex vivo</em&gt; דגם לחקר הורמוני פעולה בשד האדם

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Assay גיבוש Mammosphere משד אדם סרטן רקמות וקווים סלולריים

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...