Name: methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche
Uploaded: 2015-03-15T15:00:00
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이러한 연구는 대체 연구 개발 재단 (107588), 국립 보건 연구소 (1U54CA136465-04S1) 및 캘리포니아 유방암 연구 프로그램 (201B-0141)에서 보조금에 의해 부분적으로 자금을 지원했다. 우리는 박사 감사합니다. 의 관대 한 기부에 대한 앤드류 윌버와 R. 스콧 McIvor 자신의 <pkt2 lubig=""> transponson과의 pKa ​​/ hUbiC-SB11 트랜스 플라스미드. 우리는 감사 존 Tamaresis, 박사 학위를 인정 통계적 방법에 대한 조언, 티모시 브라운은 유동 세포 계측법을 수행하기위한, 마이그레이션 분석에 대한 조언을 조젯 HENRICH, 낸시 Bellagamba에 대한 THR 표본의 수집을 용이하게. </pkt2>

대퇴 머리는 스탠포드 의과 대학에서 정형 외과의학과 과목 THR 수술을받은 환자에서 수집되었다. 모든 조직은 스탠포드 대학 연​​구 준수 부서의 규정에 따라 드 확인 된 표본으로 수집 하였다. 1. 유방암 세포주 (들)을 선택 <ol><li> 구하는 루시 페라 제 또는 GFP 리포터 구성체 원하는 유방암 세포주 (들)를 형질. 이하의 실험은 슬리핑 뷰티 트랜스포존 플라스미드 pKT2 / LuBiG로 형질 ...

메라 ​​등. 이전 고품질 조직을 드러내는 전이성 프로세스 (47)을 연구하는 자가골 샘플의 사용의 유효성을 검사, 부검시 수확 전이성 전립선 암 환자의 사후 수집 및 뼈 시료 분석을 설명 하였다. 여기에 우리가 수집, 처리 및 유방암 세포의 이동, 정착 및 확산을 연구하는 단기 공동 문화 시스템에서 THR 수술 후 폐기 대퇴골에서 얻은 인간의 뼈 조직 조각을 사용하는 프로토콜을 ?...

종양 미세 환경 널리 유방암 진행성 전이성 암세포 중에 거동의 중요한 결정 인자로 인식되고 1-3 확산. 여기에 제시된 방법의 목적은 인간의 뼈 조직, 유방암 전이 4-6의 가장 빈번한 위치의 미세 환경 내에서 유방암 세포의 연구를 촉진 할 것이다. 뼈는 전이성 진행 (10, 11)에 연루 세포와 분비 요인 항구 둘 광물 및 골수 구획 7-9으로 구성되어 있습니다. 널리 생체 마우스 모델에서 사용하지만 전이 과정 12 ~ 15의 체계적인 연구를 촉진, 골격 내에서 세포 상호 작용은 관찰과 직접 섭동에 대해 쉽게 액세스 할 수 없습니다. 연구 및 마우스 골조직과 마우스 골수 세포를 배양 모델 시스템은 더 액세스를 제공하고 유방암 세포의 기초 m 많은 크로스 토크에 관한 통찰력과 메커니즘을 수득 한쥐의 골격 16-22 etastasis. 그러나, 연구는 뼈 조직 (23, 24)에 대해 osteotropism 종의 특정 패턴이있을 수 있음을 제안 하였다. 이러한 패턴은 뼈의 가능성 결정 인자 모두는 고유의 종 특이 골조직 특성의 차이, 면역 결핍 마우스 (11)에 변경된 골수 개체군 인한 차이들, 및 / 또는 실험에 사용 된 마우스의 비교적 어린 나이를 반영 할 수 미세. 시험 관내에서 통상적으로 골수 유래 골아 세포 또는 단층 배양 한 간질 세포 나 설계된 3 차원 모델 시스템 25-35 내의 특정 뼈 세포 유형에 집중 한 자가골 공동 배양에서 유방암 세포를 연구를 위해 접근한다. 2 차원 세포 배양 모델에서 시험 관내의 대들보를 형성 암 연구에 접근 하였지만, 그것은 롱 셀의 동작은 기본적으로 m에서 변경되는 것을 인식되어왔다문화 시스템 18,36,37 onolayer. 이것은 매트릭스 - 및 콜라겐 등의 천연 소재로 이루어지는 지지체 기반 모델을 포함하여 3 차원 살아있는 조직의 복잡성을 모방 설계된 미세 환경의 개발을 주도하고있다, 또는 합성 중합체는 조직 형 미세 환경을 만들기 위해 특정 유형의 세포로 시딩 36-41. 엔지니어링 접근 방법도 제어하고 미세 18,19,41-43의 호르몬 환경을 연구하는 생물 반응기 플랫폼의 사용을 포함했다. 생체 모방 모델 생물 반응기가 제어 된 환경에서 복잡한 미세 조직의 많은 요소를 제공하고, 성공적으로 뼈 18,19,35,42,43 유방암 전이 학습을 사전에 적용되었지만, 모델 설계된 시스템은 일반적으로 포함하지 않는다 뼈 네이티브 환경 내 존재하는 세포 형태 및 세포 외 기질 성분의 전체 스펙트럼. 최근까지, 유방암세포는 인간 뼈 조직의 네이티브 그대로 3 차원 미세 환경 내 연구되지 ​​않았다. 최근 우리는 (THR) 수술 44 시편 고관절 여분로부터 단리 인간 뼈 조직 단편을 사용하여 공 배양 모델의 개발을보고 하였다. 이 표본은 모두에게 단기 문화 마이크로 전이 기전을 연구하는 데 필요한 광물과 골수 구획을 항구. 이전 연구에서 우리는 뼈 조각 (44) (MDA-MB-231-fLuc) 공 배양 루시페라아제 발현 유방암 세포의 증식을 모니터링하는 생물 발광 영상 (BLI)을 사용하기위한 원칙의 증명을 수립. 여기에서 우리는 인간의 뼈 조직 이식편을 사용하여 원시 미세 환경의 컨텍스트 내에서 유방암 세포 암의 증식, 식민지 및 마이그레이션 연구를위한 실험 프로토콜을 상세하게 제시한다. 먼저 우리는 유방을 측정하는 골편에 인접한 공동 배양 유방암 세포에 대한 프로토콜을 제시BLI를 사용하여 세포 증식. 이 섹션에서는, 유방암 세포 현탁액은 뼈 왁스의 조각에 의해 고정되어 뼈 조각에 인접 6 웰 플레이트의 세포 명소​​로 씨앗을 품고있다. 제어 우물은 뼈 왁스,하지만 뼈 조각이 포함되어 있습니다. 셀 반점 부착하면 배지를 첨가하고, 플레이트를 측정한다 BLI 생물 발광 신호 강도 (셀 번호와 관련된) 24 시간 후, 배양이다. 다음 단계에서는 집락 증식을 연구하는 골편에 직접 파종 공동 배양 유방암 세포에 대한 방법을 제시한다. 여기 유방 세포 현탁액은 세포 집락 수를 추적하기 위해 시간에 걸쳐 BLI 및 형광 현미경에 의해 모니터되는 배양 골조직 단편에 직접 피펫 팅한다. 이 방법에서는, 골수 구획 유세포 식민지 유방암 세포 분석을위한 임의의 시점에서 뼈 조각에서 플러시, 골수 또는 생존력 분석 될 수있다. 또, 디유방암 세포의 이동을 측정하기위한 두 가지 접근법 스크라이브. 첫 번째 방법의 단계는 뼈 조직 배양 상청액을 향해 이동을 측정하기위한 나와있다. 없이 Transwell의 내부, 상부면이 8 ㎛의 공경을 멤브레인에 삽입 (도 1a에 도시 된 바와 같이)이 프로토콜에서 유방암 세포를 시딩 하였다. 이어서 인서트 골조직 상등액 또는 제어 매질을 포함하는 웰을 가진 수용기 판에 배치된다. 20 시간의 잠복기의 과정 동안, 유방암 세포의 작은 숫자는 아래가 BLI에 의해 검출 첨부 낮은 조직 문화의 우물에 삽입 세포막을 통해 이동한다. 두 번째 방법에서는 이주 유방암 세포없이 Transwell 인서트 막의 하부, 외부 표면 상에 시딩 하였다. 골 조직 단편을 삽입 컵에 배치되고, 유방암 세포 (도 1b에 도시 된 바와 같이) 뼈 조각에 정착하는 멤브레인을 통해 이동하는다음 BLI를 사용하여 몇 군데 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16600-082</td>
			<td>Supplement all McCoy&#39;s&#160; with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillen Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blastocidin (10 mgl/ml)</td>
			<td>InvivoGen&#160;</td>
			<td>ant-bl</td>
			<td>Supplement media used for transfected cell lines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 &#956;m pore size)</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*</td>
			<td>Invitrogen Detection Technologies</td>
			<td>L-3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A18967-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16021-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wax</td>
			<td>Surgical Specialties Corporation</td>
			<td>903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS 50 Imaging Platform</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software Program&#160;</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td>133026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Version 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 680 EX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>Clone (AE1/AE3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche

뼈 유방암 전이의 가장 흔한 위치이다. 이것은 널리 미세 영향 암세포 동작 것이 허용되어 있지만, 약간의 인간 뼈 조직의 기본 미세 환경 내에서 유방암 세포의 특성과 동작에 대해 잘 알려져있다. 우리는 추적 정량화의 미세 환경 내에서 인간 유방암 세포를 조절하는 방법을 개발했다 고관절 교체 수술을 다음 폐기 대퇴골에서 분리 배양 된 뼈 조직 조각. 유방암 세포 루시페라아제 위해 설계 및 녹색 형광 단백질 (EGFP) 식을 확장을 사용하여, 우리는 재현성 후 유방암 세포를 형광 현미경을 이용하여 뼈 조각 내에 생물 발광 영상을 이용하여 이동 및 증식 패턴 (BLI), 트랙 세포 상호 작용을 정량하고, 평가할 수있다 유동 세포 계측법과 식민지. 이 모델의 주요 장점은 다음과 같습니다 : 1) 기본, 구조적 손상 조직 microe중요한 인간 세포 유형을 포함하며, 신속한 정량적 모니터링 및 유방 및 뼈 세포 특성, 동작 및 상호 작용의 섭동을 용이하게 미세 환경, 2)에 직접 액세스 nvironment. 기본 제한은 현재의 단기 배양 연구에 윈도우를 한정 조직편, 유한의 생존이다. 모델 시스템의 애플리케이션 내 틈새 전이성 유방암 및 기타 뼈 추구 악성 종양 기초 생물학을 연구하고 효과적으로 골조직의 유방암 표적 세포 치료 전략의 개발이 포함된다.

대퇴 머리에서 조직 파편을 분리 대퇴 머리는 남성과 스탠포드 의과 대학에서 정형 외과의학과 과목 고관절 교체 수술을받은 여성 환자 (나이 44~90년) 같은 수의에서 수집 하였다. 각각의 폐기 대퇴골은 광물의 spicules 및 골수 구성 소주 뼈 조직을 품고 상부 대퇴골의 작은 부분이 포함되어 있습니다. 이 조직은 작은 조각들을 추출하는 수술을 사용 rongeur 샤프트 (도 2a)?...

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Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

프로토콜 인간 뼈 조직 이식편 모델 시스템에서 유방암 세포의 이동, 증식 및 집락 공부 설명된다.

배양 인간의 대퇴골 조직 외식하는 방법은 전이성 틈새의 유방암 세포 집락을 연구하기 위해

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

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연구

의학

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체외에서</em전이성 종양 성장에 휴면하고 스위치를 연구하기> 시스템

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Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...