Name: methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche
Uploaded: 2015-03-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche at JoVE.com

Disse studiene ble finansiert delvis med tilskudd fra Alternativ Research and Development Foundation (107 588), National Institute of Health (1U54CA136465-04S1), og den California Breast Cancer Research Program (201B-0141). Vi takker legene. Andrew Wilber og R. Scott McIvor for den generøse donasjon av deres <pkt2 lubig=""> transponson og pK / hUbiC-SB11 transposase plasmider. Vi ønsker å takke for John Tamaresis, Ph.D. for råd om statistiske metoder, Timothy Brown for å utføre flowcytometri, Georg Henrich for råd om vandringer analyser, og Nancy Bellagamba for å lette innsamling av THR prøver. </pkt2>

Femoral hoder ble samlet inn fra pasienter som gjennomgår elektiv THR kirurgi ved Institutt for ortopedisk kirurgi ved Stanford University School of Medicine. Alle vev ble samlet som avidentifiserte prøver i henhold til forskrifter om Stanford University Research Compliance Office. 1. Velge en Breast Cancer Cell linje (r) <ol><li> Innhente eller transfektere den ønskede brystkreft-cellelinje (r) med en luciferase-GFP reporter-konstruksjonen. De følgende eksperimenter ble utført ved anvendelse av MDA-MB-23...

Mehra et al., Har tidligere beskrevet en postmortem innsamling og analyse av prøver fra beinmetastatisk prostata kreftpasienter høstet ved tidspunktet for autopsi, avslører høykvalitets vev og validere anvendelse av humane ben prøver for å studere den metastatiske prosess 47. Her har vi beskrevet protokoller for innsamling, bearbeiding og bruk av menneskelige bein vev fragmenter hentet fra kasserte femoral hoder følgende THR kirurgi i et kortsiktig co-kultur system for å studere bryst celle m...

Svulsten mikromiljøet er anerkjent som en kritisk faktor for kreft celle oppførsel under brystkreft progresjon og metastatisk spre 1-3. Målet med fremgangsmåten presentert her er å forenkle studiet av brystkreftceller i mikromiljøet av humant benvev, den hyppigste stedet for brystkreft metastase 4-6. Bein består av mineralisert og marg avdelinger 7-9, som begge bærer på celler og skilles faktorer involvert i metastatisk progresjon 10,11. Selv om mye brukt in vivo musemodeller lette systemiske studier av metastatisk prosess 12-15, celle interaksjoner innenfor skjelettet er ikke lett tilgjengelig for observasjon og direkte forstyrrelse. Modellsystem for å studere og dyrking mus bein vev og mus marg cellene gi bedre tilgang og har gitt mange innsikt om crosstalk og mekanismene bak brystkreft celle metastasis i muse skjelett 16-22. Men studier har antydet at det kan være artsspesifikke mønstre av osteotropism for benvev 23,24. Disse mønstrene kan reflektere iboende artsspesifikke forskjeller i beinvevet egenskaper, forskjeller som følge av endrede benmargs populasjoner i immun-mangelfull mus 11, og / eller den relativt ung alder av mus brukt i eksperimenter, som alle er sannsynlige faktorer som bestemmer beinet mikromiljøet. In vitro tilnærminger for å studere brystkreft celler i menneskelige bein co-kulturer har vanligvis fokusert på bestemte bein celletyper som marg-avledet osteoblaster eller stromale celler dyrket som monolayers eller innen utviklet tre-dimensjonale modellsystemer 25-35. Selv om to-dimensjonale cellekultur modeller har dannet bærende for in vitro tilnærminger for kreftforskning, har det lenge vært kjent at celle atferd er fundamentalt endret på monolayer kultursystemer 18,36,37. Dette har ført til utvikling av konstruerte mikromiljøer som etterligner kompleksiteten av 3-dimensjonale levende vev, inkludert matrise- og stillabaserte modeller sammensatt av naturlige materialer slik som kollagen eller syntetiske polymerer podet med spesifikke celletyper for å lage vev-lignende microenvironments 36-41. Konstruert tilnærminger har også omfattet bruk av bioreaktor plattformer for å kontrollere og studere den hormonelle miljøet av mikromiljøet 18,19,41-43. Selv biomimetic modeller og bioreaktorer gi mange elementer av en kompleks vev mikromiljøet i et kontrollert miljø, og har blitt brukt til å fremme studiet av brystkreft metastaser til bein 18,19,35,42,43, trenger konstruerte modellsystemer generelt ikke innlemme det fulle spektrum av celletyper og ekstracellulære matriks-komponenter som er tilstede i naturlig ben miljø. Inntil nylig, brystkreftceller har ikke blitt studert innenfor de innfødte, intakt, 3-dimensjonal mikromiljøet av menneskelige bein vev. Vi har nylig rapportert utviklingen av en co-kultur modell ved hjelp av menneskelige bein vevfragmenter isolert fra total hofteprotese (THR) kirurgi eksemplarer 44. Disse prøvene havna både mineralisert og marg avdelinger er nødvendig for å studere mekanismene bak mikrometastaser i kort sikt kultur. I tidligere arbeid etablerte vi proof-of-prinsippet for å bruke Bioluminescens imaging (BLI) for å overvåke spredning av luciferase-uttrykke brystkreftceller (MDA-MB-231-Fluc) co-dyrket med bein fragmenter 44. Her presenterer vi detaljerte eksperimentelle protokoller for å studere bryst celle kreft spredning, kolonisering, og migrasjon innenfor rammen av den opprinnelige mikromiljøet ved hjelp av menneskelig benvev eksplantater. Først presenterer vi en protokoll for co-dyrking brystkreftceller som grenser til bein fragmenter å måle brystcelleproliferasjon bruker BLI. I denne delen er bryst cellesuspensjoner seeded som celle flekker i seks-brønns plater i tilknytning til bein fragmenter, som er immobilisert av biter av bein voks. Kontrollbrønner inneholder ben voks, men ingen benfragment. Når celle flekker feste, er medium tilsatt og platen blir dyrket i 24 timer, hvoretter bioluminescent signalintensitet (assosiert med cellenummer) måles med BLI. I det neste trinn presenteres fremgangsmåter for co-dyrkning av brystkreftceller sådd direkte på beinfragmenter for å studere kolonisering og proliferasjon. Her brystcellesuspensjoner blir pipettert direkte på benvevet fragmenter, som overvåkes i kultur av BLI og fluorescensmikroskopi over tid for å spore kolonisering og cellenummeret. I denne metoden, kan margen rommet spyles fra benfragmentene som helst punkt for analyse av koloniserte brystcancerceller ved strømningscytometri, eller marg levedyktighet assays. I tillegg har vi deskriftlærd to ulike tilnærminger for å måle brystkreft celle migrasjon. I den første metoden trinnene er beskrevet for måling av migrering mot benvev kultursupernatanter. I denne protokoll brystkreftcellene sådd ut på den indre, øvre overflater av Transwell sette membraner med 8 um porestørrelse (som vist i figur 1A). Innsatsene blir deretter plassert inn i en mottaker plate med brønner inneholdende benvev supernatant eller kontrollmedium. I løpet av en 20-timers inkuberingsperiode, små antall av brystkreft celler migrerer gjennom innsatsen membraner ned i de lavere vevs kulturbrønner hvor de fester for deteksjon av BLI. I den andre overføringsmetode brystkreftcellene sådd ut på den nedre, ytre overflater av Transwell insert membraner. Benvev fragmenter plasseres i innsatsen kopper og brystkreft celler migrerer opp gjennom membranene til å kolonisere benfragmentene (som vist på figur 1B), hvilkeblir deretter avbildes med BLI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16600-082</td>
			<td>Supplement all McCoy&#39;s&#160; with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillen Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blastocidin (10 mgl/ml)</td>
			<td>InvivoGen&#160;</td>
			<td>ant-bl</td>
			<td>Supplement media used for transfected cell lines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 &#956;m pore size)</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*</td>
			<td>Invitrogen Detection Technologies</td>
			<td>L-3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A18967-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16021-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wax</td>
			<td>Surgical Specialties Corporation</td>
			<td>903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS 50 Imaging Platform</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software Program&#160;</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td>133026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Version 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 680 EX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>Clone (AE1/AE3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche

Bone er den mest vanlige område av brystkreft metastase. Selv om det er allment akseptert at mikromiljøet påvirker kreftcelle atferd, er lite kjent om brystkreft celle egenskaper og atferd innenfor den opprinnelige mikromiljøet av menneskelig benvev. Vi har utviklet metoder for å spore, kvantifisere og modulerer menneskelige brystkreft celler innenfor mikromiljøet av dyrkede humane bein vevfragmenter isolert fra kasserte femoral hoder følgende totale hip erstatning surgeries. Ved hjelp av brystkreft celler konstruert for luciferase og forbedrede grønt fluorescerende protein (EGFP) uttrykk, er vi i stand til reproduserbart quantitate migrasjon og spredning mønstre ved hjelp Bioluminescens bildebehandling (BLI), spor celle interaksjoner innenfor bein fragmenter som bruker fluorescens mikroskopi, og evaluere bryst celler etter kolonisering med flowcytometri. De viktigste fordelene med denne modellen inkluderer: 1) en innfødt, arkitektonisk intakt vev microenvironment som inkluderer relevante humane celletyper, og 2) direkte tilgang til mikromiljøet, som muliggjør hurtig kvantitativ og kvalitativ overvåking og forstyrrelse av bryst og bein celle egenskaper, atferd og interaksjoner. En primær begrensning, i dag, er den endelige levedyktighet av vevfragmenter som begrenser vinduet i studien til korttidskultur. Anvendelser av modellsystemet omfatter å studere den grunnleggende biologi av brystkreft og andre bein-søkende maligniteter i metastatisk nisje, og utvikling av terapeutiske strategier for effektivt å målrette brystkreftceller i benvev.

Isolere Tissue Fragmenter fra Lårarterier Heads Femoral hoder ble samlet inn fra like mange mannlige og kvinnelige pasienter (44-90 år) som gjennomgår elektiv total hofteprotesekirurgi ved Institutt for ortopedisk kirurgi ved Stanford University School of Medicine. Hver kastes lårbenshodet inneholder en liten del av det øvre lårbenet, som havner trabekulært ben vev sammensatt av mineralisert spicules og marg. Dette vev er tilgjengelig gjennom kirurgisk eksponert tverrsnitt av skaftet ...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche at JoVE.com

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Protokoller er beskrevet for å studere brystkreft cellemigrering, proliferasjon og kolonisering i en human bone vevseksplantatet modellsystem.

Metoder for dyrking Menneskelig Femur Tissue eksplantater å studere Breast Cancer Cell Kolonisering av metastatisk nisje

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Menneskelige Nevroendokrine tumorcellelinjer som en tredimensjonal modell for studiet av menneskelig nevroendokrin svulst Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Bruk av omvendt fase Protein Arrays (RPPA) til Explore Protein Expression Variasjon innen Individuelle nyre celle kreft

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Innvielse av metastatisk brystkreft ved målretting av Ductal Epitel med Adenovirus-Cre: A Novel transgene mus modell av brystkreft

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Profilering av Østrogen-regulerte MicroRNAs i brystkreftceller

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Tredimensjonal kulturer: Et verktøy for å studere Normal acinar Arkitektur vs malign transformasjon av brystkreft celler

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Orthotopic Injeksjon av brystkreft celler inn i Mammary Fat Pad av mus å studere tumorvekst.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modell for å studere Hormone Handling i Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Mammosphere Formation analysen fra Menneskelig Breast Cancer Vev og cellelinjer

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...