Name: methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche
Uploaded: 2015-03-15T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche at JoVE.com

Dessa studier har finansierats delvis med bidrag från Alternative forskning och utveckling Foundation (107.588), National Institute of Health (1U54CA136465-04S1), och California Breast Cancer Research Program (201B-0141). Vi tackar Drs. Andrew Wilber och R. Scott McIvor för den generösa donationen av deras <pkt2 lubig=""> transponson och pK / hUbiC-SB11 transposas plasmider. Vi tackar John Tamaresis, Ph.D. för råd om statistiska metoder, Timothy Brown för att utföra flödescytometri, Georgette Henrich för råd om migrationsflöden i analyser, och Nancy Bellagamba för att underlätta insamling av THR exemplar. </pkt2>

Femurhuvuden samlades in från patienter som genomgick elektiv THR kirurgi vid institutionen för Ortopedisk kirurgi vid Stanford University School of Medicine. Alla vävnader saml som avidentifierade prover i enlighet med reglerna i Research regelefterlevnad på Stanford University. 1. Val av en bröstcancercellinje (er) <ol><li> Skaffa eller transfektera önskad bröstcancer cellinje (s) med en luciferas-GFP reporter konstruktion. Följande experiment utfördes med användning av MDA-MB-231 och MCF-7 bröstc...

Mehra et al. Har tidigare beskrivit döden insamling och analys av skelettprover från metastaserande prostatacancer patienter skördas vid obduktionen, avslöjar högkvalitativa vävnader och validera användningen av mänskliga ben prover för att studera metastaser processen 47. Här har vi beskrivit protokoll för insamling, bearbetning och användning av benvävnadsfragment mänskliga erhållits från kasse femurhuvuden efter THR kirurgi i en kortsiktig samodlingssystemet att studera bröstcellm...

Tumören mikromiljö är allmänt erkänd som en kritisk faktor för cancercell beteende under bröstcancer progression och metastasering 1-3. Målet med den metod som presenteras här är att underlätta studier av bröstcancerceller inom mikromiljön av mänsklig benvävnad, den vanligast förekommande stället för bröstcancermetastaser 4-6. Bone består av mineraliserade och märg fack 7-9, som båda hyser celler och utsöndrade faktorer inblandade i metastasutvecklingen 10,11. Även flitigt i vivo musmodeller underlättar system studier av metastaserad processen 12-15, cell interaktioner inom skelettet inte är lättillgängliga för observation och direkt störning. Modellsystem för att studera och odling musen benvävnad och mus benmärgsceller ger bättre åtkomst och har gett många insikter om överhörning och mekanismerna bakom bröstcancer cell metastasis av den murina skelettet 16-22. Men studier har antytt att det kan finnas artspecifika mönster osteotropism för benvävnaden 23,24. Dessa mönster kan återspegla inneboende artspecifika skillnader i benvävnad egenskaper, skillnader som härrör från förändrade benmärgs populationer i immunbristmöss 11, och / eller den relativt unga ålder av möss som används i experiment, som alla är sannbestämnings benet mikromiljö. In vitro metoder för att studera bröstcancerceller i humana skelett samkulturer har oftast fokuserar på specifika ben celltyper såsom märghärstammande osteoblaster eller stromala celler odlade som monoskikt, eller inom manipulerade 3-dimensionella modellsystem 25-35. Även 2-dimensionell cellodlingsmodeller har bildat grunden för in vitro-metoder för cancerforskning, har det länge varit känt att cellens beteende är i grunden förändrad hos monolayer kultursystem 18,36,37. Detta har lett till utvecklingen av konstruerade mikromiljöer som efterliknar de komplicerade 3-dimensionella levande vävnader, inklusive matris och ställningsbaserade modeller sammansatta av naturliga material såsom kollagen, eller syntetiska polymerer ympats med specifika celltyper att skapa vävnadsliknande mikromiljöer 36-41. Engineered tillvägagångssätt har också användningen av bioreaktor plattformar för att styra och studera den hormonella miljön i mikromiljön 18,19,41-43. Även biomimetiska modeller och bioreaktorer ger många delar av en komplex vävnad mikromiljö i en kontrollerad miljö, och har tillämpats med framgång för att främja studiet av bröstcancer metastaser till ben 18,19,35,42,43 behöver manipulerade modellsystem i allmänhet inte innehålla hela spektrat av celltyper och extracellulära matrixkomponenter som finns inom eget ben miljön. Tills nyligen, bröstcancerceller har inte studerats inom den nativa, intakta, 3-dimensionella mikromiljö av humana benvävnader. Vi rapporterade nyligen att utveckla en co-kultur modell med benvävnadsfragment isolerade från total höftledsplastik (THR) kirurgi prover 44 humana. Dessa prover hyser både de mineraliserade och märg fack som krävs för att studera mekanismerna bakom mikro metastas i korttidskultur. I tidigare arbete etablerade vi proof-of-princip för att använda bioluminiscens imaging (BLI) att övervaka spridningen av luciferas-uttryckbröstcancerceller (MDA-MB-231-Fluc) samar odlade med benfragment 44. Här presenterar vi detaljerade experimentella protokoll för att studera bröstcancer cell cancer proliferation, kolonisering, och migration inom ramen för den infödda mikro använder mänskliga ben vävnadsexplantat. Först presenterar vi ett protokoll för samarbete odling bröstcancerceller intill benfragment att mäta bröstcellproliferation med användning av BLI. I detta avsnitt, är bröst cellsuspensioner seedade som cell fläckar i 6-hålsplattor intill benfragment, som är immobiliserade med benbitar vax. Kontrollbrunnar innehåller benvax, men ingen benfragment. När cell fläckar fäster, är medelsätts och plattan är odlade för 24 timmar, varefter självlysande signalstyrkan (i samband med cellnummer) mäts med BLI. I nästa steg presenterar vi metoder för co-odling bröstcancerceller seedade direkt på benfragment att studera kolonisering och spridning. Här bröstet cellsuspensioner pipetteras direkt på benvävnaden fragment, som övervakas i kultur av BLI och fluorescensmikroskopi över tid för att spåra koloniseringen och mobilnummer. I denna metod, kan den märgutrymmet spolas ur benfragmenten vid någon tidpunkt för analys av koloniserade bröstcancerceller genom flödescytometri eller märg viabilitetsanalyser. Dessutom har vi frånskriftlärd två olika metoder för att mäta bröstcancer cell migration. I den första metoden steg beskrivs för att mäta migrering mot benvävnad odlingssupernatanter. I detta protokoll de bröstcancerceller sås på de inre, övre ytor Transwell sätter membran med en 8 um porstorlek (som visas i figur 1A). Skären placerades sedan i en mottagningsplatta med brunnar innehållande benvävnad supernatant eller kontrollmedium. Under loppet av en 20 h inkubationsperiod litet antal bröstcancerceller migrerar genom insatsmembran ned i de undre vävnadsodlingsbrunnar där de fäster för detektering av BLI. I den andra migreringsmetod de bröstcancerceller sås på de nedre, yttre ytor Transwell insatsmembran. Bone vävnadsfragment placeras i insats kopparna och bröstcancerceller migrerar uppåt genom membranen att kolonisera benfragmenten (såsom visas i Figur 1B), vilketsedan avbildas med BLI.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>McCoy&#39;s 5A Medium (1X)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16600-082</td>
			<td>Supplement all McCoy&#39;s&#160; with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillen Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blastocidin (10 mgl/ml)</td>
			<td>InvivoGen&#160;</td>
			<td>ant-bl</td>
			<td>Supplement media used for transfected cell lines.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 &#956;m pore size)</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon&#174; 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>353504</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*</td>
			<td>Invitrogen Detection Technologies</td>
			<td>L-3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FluoroBrite DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A18967-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-luciferin firefly, potassium salt 5 grams (30 mg/mL)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>L-8220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Cell Strainer 70 &#956;m</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363548</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3516</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster</td>
			<td>Corning Incorporated</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Friedman-Pearson Rongeur</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>16021-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bone wax</td>
			<td>Surgical Specialties Corporation</td>
			<td>903</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IVIS 50 Imaging Platform</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Living Image Software Program&#160;</td>
			<td>Caliper Life Sciences/PerkinElmer</td>
			<td>133026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOS FL Imaging System</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Version 4.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OsteoSense 680 EX</td>
			<td>PerkinElmer</td>
			<td>NEV10020EX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MCF-7 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDA-MB-231 breast cancer cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>HTB-26</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>Clone (AE1/AE3)</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods for culturing human femur tissue explants to study breast cancer cell colonization of the metastatic niche

Ben är den vanligaste platsen för bröstcancer metastasering. Även om det är allmänt accepterat att mikromiljön påverkar cancercellen beteende, lite är känt om fastigheter bröstcancerceller och beteenden inom infödda mikro av mänsklig benvävnad. Vi har utvecklat metoder för att spåra, kvantifiera och modulerar humana bröstcancerceller inom mikro av odlade humana skelettvävnadsfragment isolerade från kasse femurhuvuden efter total höftledsplastik operationer. Använda bröstcancerceller konstruerade för luciferas och förbättrade grönt fluorescerande protein (EGFP) uttryck, har vi möjlighet att reproducerbart kvantifiera migration och spridningsmönster som använder bioluminiscens imaging (BLI), spår cell interaktioner inom benfragment som använder fluorescensmikroskopi, och utvärdera bröstceller efter kolonisering med flödescytometri. De viktigaste fördelarna med denna modell är: 1) en infödd, arkitektoniskt intakt vävnad microeILJÖ som inbegriper relevanta humana celltyper, och 2) direkt tillgång till mikromiljö, vilket underlättar snabb kvantitativ och kvalitativ övervakning och störning av bröst- och ben cellegenskaper, beteenden och interaktioner. En primär begränsning, för närvarande, är det ändliga livskraft av vävnadsfragment, som begränsar fönstret i studien till korttidskultur. Tillämpningar av modellsystemet inkluderar studerar grundläggande biologi av bröstcancer och andra skelettsökande maligniteter inom metastaser nisch, och utveckla terapeutiska strategier för att effektivt nå bröstcancerceller i benvävnad.

Isolera vävnadsfragment från femurhuvuden Femurhuvuden samlades från lika många manliga och kvinnliga patienter (44-90 år) som genomgår elektiv höftledskirurgi vid institutionen för Ortopedisk kirurgi vid Stanford University School of Medicine. Varje kasselårbenshuvudet innehåller en liten del av den övre femur, vilken härbärgerar trabekulär benvävnad består av mineraliserade nålar och märg. Denna vävnad är tillgänglig genom den kirurgiskt exponerade tvärsektion av axel...

Watch this Scientific Journal Video about Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche at JoVE.com

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Protokoll beskrivs för att studera bröstcancer cellmigration, spridning och kolonisering i en mänsklig benvävnad Explantation modellsystem.

Metoder för Odling Human Lårben vävnadsexplantat att studera Breast Cancer Cell Colonization av Metastatisk Niche

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

Research

JoVE Journal

Medicine

Method for Novel Anti-Cancer Drug Development using Tumor Explants of Surgical Specimens

Metod för Novel läkemedel mot cancer utveckling med hjälp av tumör explants av kirurgiska preparat


The current therapies for malignant glioma have only palliative effect. For therapeutic development, one hurdle is the discrepancy of efficacy determined ...

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

An In Vitro System to Study Tumor Dormancy and the Switch to Metastatic Growth

En In Vitro Systemet studerar tumör Vilande och övergången av metastaserande tillväxt

Recurrence of breast cancer often follows a long latent period in which there are no signs of cancer, and metastases may not become clinically apparent ...

Human Neuroendocrine Tumor Cell Lines as a Three-Dimensional Model for the Study of Human Neuroendocrine Tumor Therapy

Mänskliga neuroendokrin tumör cellinjer som en tredimensionell modell för studiet av mänskliga neuroendokrin tumör Therapy

Neuroendocrine tumors (NETs) are rare tumors, with an incidence of two per 100,&#x200A;000 individuals per year, and they account for 0.5% of all human ...

The Use of Reverse Phase Protein Arrays (RPPA) to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

The Use of Reverse Phase Protein Arrays RPPA to Explore Protein Expression Variation within Individual Renal Cell Cancers

Användning av omvänd matriser Phase Protein (RPPA) att utforska Variation Protein Expression inom enskilda Renal Cell Cancer

Currently there is no curative treatment for metastatic clear cell renal cell cancer, the commonest variant of the disease. A key factor in this treatment ...

Initiation of Metastatic Breast Carcinoma by Targeting of the Ductal Epithelium with Adenovirus-Cre: A Novel Transgenic Mouse Model of Breast Cancer

Inledande av metastaserande Bröstkarcinom genom Inriktning av Ductal epitel med adenovirus-Cre: A Novel transgen musmodell av bröstcancer

Breast cancer is a heterogeneous disease involving complex cellular interactions between the developing tumor and immune system, eventually resulting in ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Profilering av östrogenreglerade MicroRNAs i bröstcancerceller

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Three Dimensional Cultures: A Tool To Study Normal Acinar Architecture vs. Malignant Transformation Of Breast Cells

Tredimensionell kulturer: Ett verktyg för att studera Normal Acinar arkitektur kontra malignt Omformning av bröstceller

Invasive breast carcinomas are a group of malignant epithelial tumors characterized by the invasion of adjacent tissues and propensity to metastasize. The ...

Orthotopic Injection of Breast Cancer Cells into the Mammary Fat Pad of Mice to Study Tumor Growth.

Orthotopic Injektion av bröstcancerceller i juverfett Pad av möss att studera tumörtillväxt.

Breast cancer growth can be studied in mice using a plethora of models. Genetic manipulation of breast cancer cells may provide insights into the ...

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

An Ex vivo Model to Study Hormone Action in the Human Breast

En<em&gt; Ex vivo</em&gt; Modell för att studera Hormone Action i Human Breast

The study of hormone action in the human breast has been hampered by lack of adequate model systems. Upon in vitro culture, primary mammary epithelial ...

Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Mammosphere Formation analys från Human bröstcancer vävnader och cellinjer

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...