Name: simplified human neutrophil extracellular traps (nets) isolation and handling
Uploaded: 2015-04-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling at JoVE.com

The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.

NOTA: Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità alle linee guida etiche istituzionali locali. Disegno 1. Sangue <ol><li> Attraverso venipucture antecubitale, raccogliere 14 provette di sangue da un volontario sano in top verde (eparina) tubi e capovolgere ogni tubo prima di stabilirsi sul ghiaccio. Prelevare il sangue entro 10 - 15 minuti di esperimento per garantire la resa ottimale dei neutrofili. </li></ol> 2. neutrofili Isolamento da sangue intero <...

<ol>
	<li>Saitoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+mediate+a+host+defense+response+to+human+immunodeficiency+virus-1.">Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).</li><li>Bruns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+extracellular+traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+infected+lung+tissue+is+dependent+on+invading+neutrophils+and+influenced+by+hydrophobin+RodA.">Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6 (4), e1000873 (2010).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETs:+a+new+strategy+for+using+old+weapons.">NETs: a new strategy for using old weapons.</a> Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).</li><li>McDonald, B., Urrutia, R., Yipp, B. G., Jenne, C. N., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+neutrophil+extracellular+traps+capture+bacteria+from+the+bloodstream+during+sepsis.">Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from the bloodstream during sepsis.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 324-333 (2012).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> J Immunol. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage,+infiltrate+tissues,+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus.">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).</li><li>Khandpur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETs+are+a+source+of+citrullinated+autoantigens+and+stimulate+inflammatory+responses+in+rheumatoid+arthritis.">NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis.</a> Sci Transl Med. 5 (178), 178ra140 (2013).</li><li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis.">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li><li>Hahn, S., Giaglis, S., Hoesli, I., Hasler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+NETs+in+reproduction:+from+infertility+to+preeclampsia+and+the+possibility+of+fetal+loss.">Neutrophil NETs in reproduction: from infertility to preeclampsia and the possibility of fetal loss.</a> Front Immunol. 3, 362 (2012).</li><li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis.">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> J Clin Invest. , (2013).</li><li>Cools-Lartigue, J., Spicer, J., Najmeh, S., Ferri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+cancer+progression.">Neutrophil extracellular traps in cancer progression.</a> Cell Mol Life Sci. , (2014).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> J Vis Exp. (36), (2010).</li><li>Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+laboratory+procedures+for+isolating+human+peripheral+blood+derived+neutrophils.">Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils.</a> Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).</li><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+lymphocytes,+granulocytes+and+macrophages.">Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages.</a> Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).</li><li>Calado, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+hormones,+acting+on+the+TERT+gene,+increase+telomerase+activity+in+human+primary+hematopoietic+cells.">Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells.</a> Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).</li><li>Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+regulation+of+bv8+in+human+blood+cells.">Characterization and regulation of bv8 in human blood cells.</a> Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).</li><li>Wu, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+leukocyte+labeling+with+intravenous+ferumoxides/protamine+sulfate+complex+and+in+vitro+characterization+for+cellular+magnetic+resonance+imaging.">In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).</li><li>Saffarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+directly+induce+epithelial+and+endothelial+cell+death:+a+predominant+role+of+histones.">Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones.</a> PLoS One. 7 (2), e32366 (2012).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li></ol>

Il protocollo di isolamento trappola neutrofili extracellulare dimostrato in questo video combina diverse tecniche utilizzate in letteratura per l&#39;isolamento dei neutrofili e la formazione NET. Semplifica un processo abbastanza complesso e variabile e offre un modo molto affidabile e replicabile per isolare NET privi di cellule purificate con meno passaggi rispetto ad altri protocolli. Inoltre, i reagenti immediatamente disponibili sono impiegati aggiungendo al protocolli semplicità e riducendo in modo significativ...

Neutrofili trappole extracellulari (NET) sono state recentemente scoperti elementi neutrofili-derivati ​​composti da filamenti di DNA extracellulare decorate da centinaia di proteine ​​e istoni. Essi sono secreti dai neutrofili nel contesto di infezione e infiammazione seguenti stimoli specifici e la loro iscrizione iniziale di far parte dei meccanismi del neutrofili di difesa contro le infezioni. Sono stati mostrati prima a promuovere la cattura di vari invasori microbici compresi batteri, virus e funghi 1-3. Trapping del microbo potrebbe poi portare alla sua distruzione sia direttamente da proteine ​​NET-associate 3,4 e indirettamente, attraverso il reclutamento locale di fagociti 5,6. Il ruolo dei NET tuttavia non sembra essere limitato a ospitare difesa. Più di recente, che hanno dimostrato di svolgere un ruolo importante nelle malattie autoimmuni 7,8, trombosi 9, i disturbi legati alla gravidanza 10 e anche la progressione del cancro11,12. Pertanto, sembra che NET svolgono un ruolo importante in un gran numero di diversi processi fisiologici. Tuttavia, data la natura romanzo di tale ricerca, molto resta da chiarire per quanto riguarda i meccanismi con cui NET esercitano i loro effetti. Qui, presentiamo un metodo semplificato per l&#39;isolamento dei NET in assenza di neutrofili. Nel seguente video, dimostriamo una tecnica semplificata e facile da isolare NET dal sangue umano intero. NET cell-free possono quindi essere usati in una serie di esperimenti in vitro compreso colorazione, imuunofluorescence, blotting nonché un certo numero di dosaggi come l&#39;adesione, la migrazione e la proliferazione. Esistono altri protocolli 13, 19, tuttavia sono generalmente lunghe, complesse, costose e spesso, bassa resa 13. Questo protocollo semplificato utilizza reagenti di base e diminuisce il numero di fasi necessarie per isolare neutrofili, minimizzando la lunghezza del Operazire massimizzando il rendimento. Il seguente metodo combina diverse tecniche per l&#39;isolamento dei neutrofili precedentemente descritti in letteratura per ottenere un semplice protocollo formare un campione molto pura di neutrofili vivi. Come suggerito in letteratura, sangue venoso viene raccolto in provette EDTA ed usata entro 10 min per evitare l&#39;attivazione dei neutrofili 14. Usiamo linfociti separazione media (LSM) gradiente di densità centrifugazione per isolare granulociti e globuli rossi dal sangue intero eparinizzato, un metodo adattato dalla tecnica di centrifugazione densità Ficoll inizialmente descritto da Boyum et al 15. LSM è una modifica della formulazione Boyum che sostituisce diatrizoato sodio per la metrizoate sodio ed è stato usato con successo in molti studi per isolare neutrofili 16-18. Dopo differenziale densità centrifugazione, monociti e linfociti vengono scartati; globuli rossi vengono poi sedimentateutilizzando una soluzione Dextran 6% 14 e le restanti globuli rossi vengono lisati di ottenere una popolazione di neutrofili puri, che si verifica con Trypan blu e blu di metilene colorazione. Molti agenti sono stati utilizzati per indurre NETosis sia in vitro che in vivo, compresi lipopolisaccaride (LPS), e forbolo miristato di acetato (PMA) e interleuchine (IL 8-) 3,5,6. Nella seguente protocollo, neutrofili isolati sono stimolati con PMA 500 ​​nM per 4 ore, che ha dimostrato di essere una concentrazione sufficiente per permettere la formazione NET coerente e affidabile senza promuovere apoptosi 19,20. Dopo l&#39;isolamento, si dimostra come NET privi di cellule ottenute da questo protocollo può essere utilizzato in un test di adesione. DNAse1 viene utilizzato per digerire e degradare NET come precedentemente descritto e quindi serve come controllo 2,3,11. Altre opzioni includono l&#39;uso di inibitori dell&#39;elastasi dei neutrofili (NEI) per inibire Formati NETon, che è un&#39;alternativa accettabile quando l&#39;obiettivo è quello di inibire la formazione NET anziché effettuare la degradazione 11. Sebbene NEi ha un certo numero di funzioni diverse, è stato precedentemente dimostrato che NET deposizione può essere inibita da NEi attraverso blocco decondensazione cromatina, degranulazione dei neutrofili nucleare e la morte 12

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="983">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:75px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:573px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">305-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dextran hydrochloride (powder)</td>
			<td style="width:75px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">DE130</td>
			<td>6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RPMI-1640 Medium with L-glutamine</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">350-000-CL</td>
			<td>3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">BD Pharm Lyse Lysing buffer</td>
			<td style="width:75px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:75px;">Sigma-Alrdrich</td>
			<td style="width:119px;">P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse1</td>
			<td>Roche</td>
			<td style="width:119px;">11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F12 DMEM</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">319-075-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CFSE</td>
			<td style="width:75px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm)</td>
			<td style="width:75px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simplified human neutrophil extracellular traps (nets) isolation and handling

Neutrofili extracellulari Traps (NET) sono stati recentemente identificati come parte dell&#39;armamentario antimicrobica del neutrofili. Oltre al loro ruolo nella lotta contro le infezioni, una recente ricerca ha dimostrato che possono essere coinvolti in molti altri processi patologici, tra cui la progressione del cancro. Isolare NET purificati è un elemento cruciale per consentire lo studio di queste funzioni. In questo video, dimostriamo un metodo semplificato di cella di isolamento NET esenti da sangue umano intero utilizzando reagenti prontamente disponibili. Isolati NET possono poi essere utilizzati per immunofluorescenza, cancellando o vari test funzionali. Ciò consente una valutazione delle loro proprietà biologiche in assenza dei potenziali effetti confondenti di neutrofili stessi. Una tecnica di separazione gradiente di densità viene impiegato per isolare neutrofili dal donatore sano sangue intero. Isolati neutrofili sono poi stimolati da phorbol 12 MYRiState 13-acetato (PMA) per indurre NETosis. Neutrofili attivati ​​vengono poi scartati, e uno stock NET cell-free si ottiene. Abbiamo poi dimostra come NET isolato può essere utilizzato in un test di adesione sulle cellule tumorali del polmone A549 umani. Lo stock NET è usato per rivestire i pozzi di un 96 e piastra di coltura cellulare O / N, e dopo aver assicurato una adeguata formazione monostrato NET sul fondo dei pozzetti, CFSE etichettati cellule A549 sono aggiunti. Cellule aderenti sono quantificati tramite un microscopio a fluorescenza Nikon TE300. In alcuni pozzi, 1000U DNAse1 viene aggiunto 10 minuti prima di contare fino a degradare NET

Conseguimento di successo di un saggio di adesione statica con NET richiede adeguata rivestimento dei pozzetti con un monostrato di NET prima dell&#39;aggiunta di cellule tumorali (Figura 1). Tutte le fasi successive devono essere eseguiti con attenzione a non interrompere quel livello. Quando si forma un adeguato strato di NET, si prevede una consistente cellule tumorali adesione NET come si vede nella Figura 2A e 2C. Questo effetto è abolita con l&#39;aggiunta di DNA...

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Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

Nella seguente protocollo, si descrive un modo molto semplice per isolare trappole neutrofili extracellulari (NET) da sangue umano intero utilizzando reagenti facilmente disponibili. Abbiamo poi mostrato come i NET isolati possono essere utilizzati in un&#39;adesione test in vitro con cellule tumorali.

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