Name: simplified human neutrophil extracellular traps (nets) isolation and handling
Uploaded: 2015-04-16T13:00:00
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The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.

注：全ての実験は、地元の機関倫理指針に従って行った。 1.採血<ol><li>肘前venipuctureを通じて、グリーントップ（ヘパリン処理）チューブに健康なボランティアからの血液の14のチューブを収集し、氷上にセトリングする前に、各チューブを反転させる。最適な好中球の収量を確保するために、実験の15分 - 10内の血液を収集する。 </li></ol>全血から2.好?...

<ol>
	<li>Saitoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+mediate+a+host+defense+response+to+human+immunodeficiency+virus-1.">Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).</li><li>Bruns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+extracellular+traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+infected+lung+tissue+is+dependent+on+invading+neutrophils+and+influenced+by+hydrophobin+RodA.">Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6 (4), e1000873 (2010).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETs:+a+new+strategy+for+using+old+weapons.">NETs: a new strategy for using old weapons.</a> Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).</li><li>McDonald, B., Urrutia, R., Yipp, B. G., Jenne, C. N., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+neutrophil+extracellular+traps+capture+bacteria+from+the+bloodstream+during+sepsis.">Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from the bloodstream during sepsis.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 324-333 (2012).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> J Immunol. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage,+infiltrate+tissues,+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus.">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).</li><li>Khandpur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETs+are+a+source+of+citrullinated+autoantigens+and+stimulate+inflammatory+responses+in+rheumatoid+arthritis.">NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis.</a> Sci Transl Med. 5 (178), 178ra140 (2013).</li><li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis.">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li><li>Hahn, S., Giaglis, S., Hoesli, I., Hasler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+NETs+in+reproduction:+from+infertility+to+preeclampsia+and+the+possibility+of+fetal+loss.">Neutrophil NETs in reproduction: from infertility to preeclampsia and the possibility of fetal loss.</a> Front Immunol. 3, 362 (2012).</li><li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis.">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> J Clin Invest. , (2013).</li><li>Cools-Lartigue, J., Spicer, J., Najmeh, S., Ferri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+cancer+progression.">Neutrophil extracellular traps in cancer progression.</a> Cell Mol Life Sci. , (2014).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> J Vis Exp. (36), (2010).</li><li>Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+laboratory+procedures+for+isolating+human+peripheral+blood+derived+neutrophils.">Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils.</a> Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).</li><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+lymphocytes,+granulocytes+and+macrophages.">Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages.</a> Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).</li><li>Calado, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+hormones,+acting+on+the+TERT+gene,+increase+telomerase+activity+in+human+primary+hematopoietic+cells.">Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells.</a> Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).</li><li>Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+regulation+of+bv8+in+human+blood+cells.">Characterization and regulation of bv8 in human blood cells.</a> Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).</li><li>Wu, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+leukocyte+labeling+with+intravenous+ferumoxides/protamine+sulfate+complex+and+in+vitro+characterization+for+cellular+magnetic+resonance+imaging.">In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).</li><li>Saffarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+directly+induce+epithelial+and+endothelial+cell+death:+a+predominant+role+of+histones.">Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones.</a> PLoS One. 7 (2), e32366 (2012).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li></ol>

このビデオで実証好中球細胞外トラップ単離プロトコールは、好中球の単離およびNET形成のために文献で使用される様々なテクニックを兼ね備えています。これは、かなり複雑な変数のプロセスを簡素化し、他のプロトコルよりも少ない工程で精製された無細胞ネットを分離するための非常に信頼性と複製可能な方法を提供しています。また、容易に入手可能な試薬をプロトコル簡潔に追加?...

好中球細胞外トラップ（のNET）タンパク質とヒストンの何百によって装飾された外DNAの鎖から構成される新たに発見された好中球由来の要素です。これらは、特定の刺激後の感染および炎症の文脈における好中球によって分泌され、それらが最初に感染に対する好中球の防御機構の一部であることが認められた。これらは、最初の細菌、ウイルスおよび真菌1-3を含む種々の微生物の侵入者の捕獲を促進することが示された。微生物の捕捉することは、両方の直接NET関連タンパク質3,4及び間接的に食細胞5,6の地元の募集を通じてによってその破壊につながる。のNETの役割は、しかし、防衛をホストするために制限されていないようです。より最近では、彼らは、自己免疫疾患7,8、血栓9、妊娠関連障害10、さらに癌の進行において重要な役割を果たすことが示されている11,12。したがって、NETは、多様な生理学的プロセス、多数の重要な役割を果たしていると思われる。しかしながら、このような研究の新規な性質を考えると、多くのNETは、それらの効果を発揮するメカニズムについて解明されていない。ここで、我々は、好中球の不在内のネットの単離のための簡便法を提示する。 次のビデオでは、我々は、ヒト全血からのNETを単離するために簡略化され、容易な技術を実証する。無細胞のNETは、次いで、接着、増殖および遊走のような多くのアッセイならびにブロッティング、染色、imuunofluorescence含むインビトロの実験で使用することができる。他のプロトコルは、しかし、彼らは通常、長い複雑な、高価な、そして多くの場合、低い収率13である、13、19が存在する。この簡略化されたプロトコルは、基本的な試薬を使用し、好中球を単離するために必要なステップの数が減少するので。手順の長さを最小化する収量を最大化しながら、再。 以下の方法は、好中球の単離のための別の技術は、以前に生きた好中球の非常に純粋な試料を得た単純なプロトコルを得るために、文献に記載され組み合わせる。文献で ​​示唆したように、静脈血をEDTAチューブに回収し、好中球活性化14を回避するために10分以内に使用されている。我々は、ヘパリン化全血、最初にBoyumら15によって記載され、フィコール密度遠心分離技術から適応方法から顆粒球および赤血球を分離するためにリンパ球分離培地（LSM）密度勾配遠心分離を使用する。 LSMナトリウムピリオドンのためのジアトリゾ酸ナトリウムを代入し、好中16-18を単離するために多くの研究において成功裏に使用されてきたBoyum製剤の変形例である。 差動密度遠心分離後、単球およびリンパ球は廃棄される。赤血球は、次いで沈降さ6％デキストラン溶液14を使用して、残りのRBCをトリパンブルーおよびメチレンブルー染色によって確認された純粋な好中球の集団を得るために溶解される。 多くの物質は、リポ多糖（LPS）、および酢酸ミリスチン酸ホルボール（PMA）およびインターロイキン（IL-8）-3,5,6-含む、 インビトロおよびインビボの両方NETosisを誘導するために使用されてきた。以下のプロトコールでは、単離された好中球はアポトーシス19,20を促進することなく一貫した信頼NET形成を可能にするのに十分な濃度であることが示されている4時間、500 nMのPMAで刺激する。 単離後、我々は、このプロトコルから得られた無細胞のNETは、接着アッセイにおいて使用することができる方法を示す。 DNAse1で消化し ​​、前述のようにのNETを分解するために使用されるので、制御2,3,11として機能する。他のオプションはNET formatiを阻害する好中球エラスターゼ阻害剤（NEI）の使用を含むこれ、上の目標は、NET形成を阻害するのではなく、それらの分解11を達成するためにあるときに許容可能な代替手段です。 NEIが変化多数の機能を有するが、それは以前にNET堆積が、クロマチン脱凝縮、核の脱顆粒及び好中球の死12の閉塞を通してNEIによって阻害され得ることが示されている

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="983">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:75px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:573px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">305-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dextran hydrochloride (powder)</td>
			<td style="width:75px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">DE130</td>
			<td>6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RPMI-1640 Medium with L-glutamine</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">350-000-CL</td>
			<td>3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">BD Pharm Lyse Lysing buffer</td>
			<td style="width:75px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:75px;">Sigma-Alrdrich</td>
			<td style="width:119px;">P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse1</td>
			<td>Roche</td>
			<td style="width:119px;">11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F12 DMEM</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">319-075-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CFSE</td>
			<td style="width:75px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm)</td>
			<td style="width:75px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simplified human neutrophil extracellular traps (nets) isolation and handling

好中球細胞外トラップ（ネットは）最近、好中球の抗菌装備一式の一部として同定されている。別に感染との戦いにおける役割から、最近の研究は、それらが癌の進行を含む多くの他の疾患プロセスに関与し得ることを実証した。精製されたネットを分離すること、これらの機能の研究を可能にする重要な要素である。 このビデオでは、我々は容易に入手可能な試薬を用いて、ヒト全血からの無細胞NET単離の簡便法を実証する。単離されたNETは、その後、免疫蛍光染色、ブロッティングまたは様々な機能的アッセイのために使用することができる。これは、好中球自身の潜在的な交絡効果がない場合に、それらの生物学的特性の評価を可能にします。 密度勾配分離技術は、健康なドナーの全血から好中球を単離するために使用される。単離された好中球は、その後12-マイアにより刺激されるNETosisを誘導するISTATE 13-アセテート（PMA）。活性化された好中球は、その後破棄され、無細胞NETストックが得られる。 次に、A549ヒト肺癌細胞との接着アッセイにおいて使用することができる方法を孤立のNET実証する。 NETストックをコーティングするために追加された96ウェル細胞培養プレートのO / Nであり、ウェルの底に適切なNET単層形成を確認した後、CFSEで標識したA549細胞のウェルに使用される。接着細胞を、ニコンTE300蛍光顕微鏡を使用して定量化される。いくつかのウェルでは、1000U DNAse1はネットを分解するために数え10分前に追加されます

NETは静的接着アッセイの成功の達成は、癌細胞の添加前のNETの単層（ 図1）を有するウェルの適切なコーティングを必要とします。それ以降のすべてのステップは、その層を破壊しないように注意して行う必要があります。のNETの適切な層を形成する場合には、 図2Aおよび図2Cに示すようにのNETに大きな癌細胞の接着を見ることが期待される。この効果?...

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Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

以下のプロトコールでは、容易に入手可能な試薬を用いて、ヒト全血からの好中球細胞外トラップ（のNET）を単離するための非常に簡単な方法を記載している。次に、単離されたNETは、癌細胞を用いたin vitro接着アッセイにおいて使用することができる方法を示す。

簡体ヒト好中球細胞外トラップ（のNET）の単離と取扱い

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps (NETs) Isolation and Handling

Neutrophil Extracellular Traps: How to Generate and Visualize Them

好中球細胞外トラップ：それらを生成して可視化する方法

Neutrophil granulocytes are the most abundant group of leukocytes in the peripheral blood. As professional phagocytes, they engulf bacteria and kill them ...

Methods to Study Lipid Alterations in Neutrophils and the Subsequent Formation of Neutrophil Extracellular Traps

脂質好中球の変化と好中球細胞外トラップのその後の形成を研究する方法

Lipid analysis performed by high performance thin layer chromatography (HPTLC) is a relatively simple, cost-effective method of analyzing a broad range of ...

Visualizing Macrophage Extracellular Traps Using Confocal Microscopy

共焦点顕微鏡を用いた可視化マクロファージ細胞外トラップ

A primary method used to define the presence of neutrophil extracellular traps (NETs) is confocal microscopy. We have modified established confocal ...

Automated Image-Based Quantification of Neutrophil Extracellular Traps Using NETQUANT

NETQUANTを用いた好中球細胞トラップの自動画像ベース定量

Neutrophil extracellular traps (NETs) are web-like antimicrobial structures consisting of DNA and granule derived antimicrobial proteins. ...

Identification of Neutrophil Extracellular Traps in Paraffin-Embedded Feline Arterial Thrombi using Immunofluorescence Microscopy

蛍光免疫顕微鏡を用いたパラフィン組み込みネコリン動脈血栓における好中球外細胞トラップの同定

Neutrophil extracellular traps (NETs), composed of cell-free DNA (cfDNA) and proteins like histones and neutrophil elastase (NE), are released by ...

Morphological and Compositional Analysis of Neutrophil Extracellular Traps Induced by Microbial and Chemical Stimuli

微生物・化学刺激による好中球細胞外トラップの形態・組成解析

Neutrophils function as the first line of cellular defense in an innate immune response by employing diverse mechanisms, such as the formation of ...

Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

改変サンドイッチELISAを用いた好中球細胞外トラップからのミエロペルオキシダーゼ-DNAおよび好中球エラスターゼ-DNA複合体の定量(英語)

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

ヒトおよびマウス組織における好中球細胞外トラップの免疫蛍光イメージング

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...