Name: simplified human neutrophil extracellular traps (nets) isolation and handling
Uploaded: 2015-04-16T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling at JoVE.com

The authors would like to acknowledge Dr. Paul Kubes for his guidance and mentoring that were central in the construction of this work.

NOTA: Todas as experiências foram conduzidos de acordo com as diretrizes éticas institucionais locais. Desenho 1. Sangue <ol><li> Através venipucture antecubital, coletar 14 tubos de sangue de voluntários saudáveis ​​em top verde tubos (heparina) e inverta cada tubo antes de se estabelecer em gelo. Recolha de sangue dentro de 10-15 min de experiência para garantir um rendimento óptimo de neutrófilos. </li></ol> 2. Neutrophil Isolamento de Sangue Total ...

<ol>
	<li>Saitoh, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+mediate+a+host+defense+response+to+human+immunodeficiency+virus-1.">Neutrophil extracellular traps mediate a host defense response to human immunodeficiency virus-1.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 109-116 (2012).</li><li>Bruns, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Production+of+extracellular+traps+against+Aspergillus+fumigatus+in+vitro+and+in+infected+lung+tissue+is+dependent+on+invading+neutrophils+and+influenced+by+hydrophobin+RodA.">Production of extracellular traps against Aspergillus fumigatus in vitro and in infected lung tissue is dependent on invading neutrophils and influenced by hydrophobin RodA.</a> PLoS Pathog. 6 (4), e1000873 (2010).</li><li>Brinkmann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+kill+bacteria.">Neutrophil extracellular traps kill bacteria.</a> Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).</li><li>Papayannopoulos, V., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETs:+a+new+strategy+for+using+old+weapons.">NETs: a new strategy for using old weapons.</a> Trends Immunol. 30 (11), 513-521 (2009).</li><li>McDonald, B., Urrutia, R., Yipp, B. G., Jenne, C. N., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravascular+neutrophil+extracellular+traps+capture+bacteria+from+the+bloodstream+during+sepsis.">Intravascular neutrophil extracellular traps capture bacteria from the bloodstream during sepsis.</a> Cell Host Microbe. 12 (3), 324-333 (2012).</li><li>Pilsczek, F. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+mechanism+of+rapid+nuclear+neutrophil+extracellular+trap+formation+in+response+to+Staphylococcus+aureus.">A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus.</a> J Immunol. 185 (12), 7413-7425 (2010).</li><li>Villanueva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netting+neutrophils+induce+endothelial+damage,+infiltrate+tissues,+and+expose+immunostimulatory+molecules+in+systemic+lupus+erythematosus.">Netting neutrophils induce endothelial damage, infiltrate tissues, and expose immunostimulatory molecules in systemic lupus erythematosus.</a> J Immunol. 187 (1), 538-552 (2011).</li><li>Khandpur, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NETs+are+a+source+of+citrullinated+autoantigens+and+stimulate+inflammatory+responses+in+rheumatoid+arthritis.">NETs are a source of citrullinated autoantigens and stimulate inflammatory responses in rheumatoid arthritis.</a> Sci Transl Med. 5 (178), 178ra140 (2013).</li><li>Demers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancers+predispose+neutrophils+to+release+extracellular+DNA+traps+that+contribute+to+cancer-associated+thrombosis.">Cancers predispose neutrophils to release extracellular DNA traps that contribute to cancer-associated thrombosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (32), 13076-13081 (2012).</li><li>Hahn, S., Giaglis, S., Hoesli, I., Hasler, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+NETs+in+reproduction:+from+infertility+to+preeclampsia+and+the+possibility+of+fetal+loss.">Neutrophil NETs in reproduction: from infertility to preeclampsia and the possibility of fetal loss.</a> Front Immunol. 3, 362 (2012).</li><li>Cools-Lartigue, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+sequester+circulating+tumor+cells+and+promote+metastasis.">Neutrophil extracellular traps sequester circulating tumor cells and promote metastasis.</a> J Clin Invest. , (2013).</li><li>Cools-Lartigue, J., Spicer, J., Najmeh, S., Ferri, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+in+cancer+progression.">Neutrophil extracellular traps in cancer progression.</a> Cell Mol Life Sci. , (2014).</li><li>Brinkmann, V., Laube, B., Abu Abed, U., Goosmann, C., Zychlinsky, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps:+how+to+generate+and+visualize+them.">Neutrophil extracellular traps: how to generate and visualize them.</a> J Vis Exp. (36), (2010).</li><li>Maqbool, M., Vidyadaran, S., George, E., Ramasamy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimisation+of+laboratory+procedures+for+isolating+human+peripheral+blood+derived+neutrophils.">Optimisation of laboratory procedures for isolating human peripheral blood derived neutrophils.</a> Med J Malaysia. 66 (4), 296-299 (2011).</li><li>Boyum, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+lymphocytes,+granulocytes+and+macrophages.">Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages.</a> Scand J Immunol. Suppl. 5, 9-15 (1976).</li><li>Calado, R. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sex+hormones,+acting+on+the+TERT+gene,+increase+telomerase+activity+in+human+primary+hematopoietic+cells.">Sex hormones, acting on the TERT gene, increase telomerase activity in human primary hematopoietic cells.</a> Blood. 114 (11), 2236-2243 (2009).</li><li>Zhong, C., Qu, X., Tan, M., Meng, Y. G., Ferrara, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+regulation+of+bv8+in+human+blood+cells.">Characterization and regulation of bv8 in human blood cells.</a> Clin Cancer Res. 15 (8), 2675-2684 (2009).</li><li>Wu, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+leukocyte+labeling+with+intravenous+ferumoxides/protamine+sulfate+complex+and+in+vitro+characterization+for+cellular+magnetic+resonance+imaging.">In vivo leukocyte labeling with intravenous ferumoxides/protamine sulfate complex and in vitro characterization for cellular magnetic resonance imaging.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 293 (5), C1698-C1708 (2007).</li><li>Saffarzadeh, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil+extracellular+traps+directly+induce+epithelial+and+endothelial+cell+death:+a+predominant+role+of+histones.">Neutrophil extracellular traps directly induce epithelial and endothelial cell death: a predominant role of histones.</a> PLoS One. 7 (2), e32366 (2012).</li><li>Fuchs, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+death+program+leads+to+neutrophil+extracellular+traps.">Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps.</a> J Cell Biol. 176 (2), 231-241 (2007).</li></ol>

O protocolo de isolamento Armadilha de Neutrófilos Extracelular demonstrado neste vídeo combina diferentes técnicas utilizadas na literatura para o isolamento dos neutrófilos e de formação NET. Ele simplifica um processo bastante complexo e variável e oferece uma maneira muito confiável e replicável para isolar NETs livres de células purificadas com menos etapas do que outros protocolos. Além disso, reagentes prontamente disponíveis são empregados adicionando à simplicidade protocolos e reduzindo significa...

Armadilhas extracelulares dos neutrófilos (NETs) são recém-descoberto elementos derivadas de neutrófilos compostas de cadeias de DNA extracelular decoradas por centenas de proteínas e histonas. Eles são segregadas por neutrófilos no contexto da infecção e inflamação seguintes estímulos específicos e eles foram reconhecidos inicialmente fazer parte dos mecanismos de defesa contra as infecções de neutrófilos. Eles foram mostrados primeiro a promover a captura de vários invasores microbianos, incluindo bactérias, vírus e fungos 1-3. Aprisionando do micróbio, então, levar a sua destruição tanto diretamente pelo proteínas associadas a NET 3,4 e indiretamente através de recrutamento local de células fagocíticas 5,6. O papel de NET, contudo, não parece ser limitado a defesa do hospedeiro. Mais recentemente, têm sido mostrado desempenhar um importante papel em doenças auto-imunes 7,8, trombose 9, desordens relacionadas com a gravidez 10 e ainda a progressão do cancro11,12. Por conseguinte, afigura-se que as redes de desempenhar um papel importante em um grande número de diversos processos fisiológicos. No entanto, dada a natureza inovadora de tais pesquisas, ainda há muito a ser elucidado com respeito aos mecanismos pelos quais NETs exercem os seus efeitos. Este trabalho apresenta um método simplificado para o isolamento de NET na ausência de neutrófilos. No vídeo a seguir, demonstramos uma técnica simplificada e fácil de isolar NETs de sangue humano. NET isentos de células podem então ser utilizados em uma série de experiências in vitro, incluindo coloração, imuunofluorescence, apagando assim como um certo número de ensaios, tais como adesão, migração e proliferação. Outros protocolos de existir 13, 19, no entanto eles são geralmente longos, complexos, caros, e frequentemente, baixo rendimento 13. Este protocolo simplificado utiliza reagentes básicos e diminui o número de passos necessários para isolar neutrófilos, minimizando assim o comprimento da procedure ao mesmo tempo maximizar o rendimento. O método a seguir combina diferentes técnicas para isolamento de neutrófilos anteriormente descrito na literatura para obtenção de um protocolo simples, obtendo-se uma amostra muito pura de neutrófilos vivos. Tal como sugerido na literatura, o sangue venoso é recolhido em tubos com EDTA e utilizado dentro de 10 minutos para evitar a activação de neutrófilos 14. Usamos Meios de Separação de Linfócitos (LSM) centrifugação com gradiente de densidade para isolar granulócitos e células vermelhas do sangue heparinizado a partir de sangue total, um método adaptado de a técnica de centrifugação de densidade Ficoll inicialmente descrito por Boyum et al 15. LSM é uma modificação da formulação Boyum que substitui o diatrizoato de sódio para o metrizoato de sódio e foi utilizada com sucesso em muitos estudos para isolar neutrófilos 16-18. Após centrifugação diferencial de densidade, monócitos e linfócitos são descartados; células vermelhas do sangue são então sedimentadoutilizando uma solução de dextrano a 6% e os 14 restantes glóbulos vermelhos são lisadas para se obter uma população de neutrófilos puros, que é verificada com azul de Tripano e coloração com azul de metileno. Numerosos agentes têm sido utilizados para induzir NETosis tanto in vitro e in vivo, incluindo lipopolissacárido (LPS), e acetato de miristato de forbol (PMA) e as interleucinas (IL-8) 3,5,6. No seguinte protocolo, isolados neutrófilos são estimuladas com PMA 500 ​​nM durante 4 horas, o que tem sido demonstrado ser uma concentração adequada para permitir a formação NET consistente e fiável sem promover a apoptose 19,20. Após o isolamento, é mostrado como NET isentos de células obtidos a partir deste protocolo pode ser utilizado em um ensaio de adesão. DNAse1 é utilizado para digerir ou degradar NET como descrito anteriormente e, portanto, serve como um controlo 2,3,11. Outras opções incluem a utilização de inibidor de elastase de neutrófilos (NEI) para inibir formati NET, o que é uma alternativa aceitável quando o objectivo é inibir a formação de NET, em vez de efectuar a sua degradação 11. Embora NEi tem um número de funções variadas, foi previamente mostrado que a deposição NET pode ser inibida por NEi por bloqueio da descondensação de cromatina, a desgranulação de neutrófilos e a morte nuclear 12

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="983">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:75px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:573px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Dulbecco&#8217;s Phosphate Buffered Saline (PBS), Modified, without calcium chloride and magnesium chloride</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">311-425-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Lymphocyte Separation Medium (LSM)</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">305-010-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dextran hydrochloride (powder)</td>
			<td style="width:75px;">Spectrum</td>
			<td style="width:119px;">DE130</td>
			<td>6% Dextran solution is made by supplementing PBS with Ca and Mg with 6% Dextran powder</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RPMI-1640 Medium with L-glutamine</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">350-000-CL</td>
			<td>3% RPMI solution is made by supplementing RPMI with 3% Fetal Bovine serum</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">BD Pharm Lyse Lysing buffer</td>
			<td style="width:75px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">555899</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td style="width:75px;">Sigma-Alrdrich</td>
			<td style="width:119px;">P8139</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DNAse1</td>
			<td>Roche</td>
			<td style="width:119px;">11284932001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">F12 DMEM</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">319-075-CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:75px;">Wisent</td>
			<td style="width:119px;">080-150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">CFSE</td>
			<td style="width:75px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">C1157</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">0.25% Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:75px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Integrid tissue culture dish with 20mm grid (150 x 25mm)</td>
			<td style="width:75px;">Falcon</td>
			<td style="width:119px;">353025</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simplified human neutrophil extracellular traps (nets) isolation and handling

Neutrófilos extracelulares Armadilhas (NETS), foram recentemente identificadas como parte do arsenal antimicrobiano da neutrófilo. Para além do seu papel no combate às infecções, investigação recente demonstrou que eles podem ser envolvidos em muitos outros processos de doença, incluindo a progressão do cancro. Isolando NETs purificadas é um elemento crucial para permitir que o estudo dessas funções. Neste vídeo, demonstramos um método simplificado de célula livre isolamento NET a partir de sangue humano utilizando reagentes facilmente disponíveis. Isolado NET pode então ser utilizado para a coloração de imunofluorescência, blotting ou vários ensaios funcionais. Isto permite uma avaliação das suas propriedades biológicas na ausência dos potenciais efeitos de confusão dos próprios neutrófilos. Uma técnica de separação por gradiente de densidade é utilizada para isolar os neutrófilos a partir de sangue completo de dadores saudáveis. Isolado neutrófilos são então estimulados por forbol 12-myrsiState 13-acetato (PMA) para induzir NETosis. Os neutrófilos activados são então descartados, e um estoque NET livre de células é obtida. Em seguida, demonstram como NET isolado pode ser utilizado em um ensaio de adesão com células de cancro do pulmão humano A549. O estoque NET é utilizado para revestir os poços de uma cultura de células de 96 poços da placa S / N, e depois de se assegurar a formação de uma monocamada NET adequada no fundo dos poços, CFSE rotulados células A549 são adicionados. As células aderentes são quantificados utilizando um microscópio de fluorescência Nikon TE300. Em alguns poços, 1000U DNAse1 é adicionado 10 minutos antes da contagem de degradar NET

Realização bem sucedida de um ensaio de adesão estático com NET requer revestimento adequada dos poços com uma monocamada de NET antes da adição de células de cancro (Figura 1). Todos os passos subsequentes deve ser feito com cuidado para não perturbar essa camada. Quando uma camada adequada de NET é formada, espera-se ver as células cancerosas significativa adesão às NET como pode ser visto na Figura 2A e 2C. Este efeito é abolida pela adição de DNAse1,...

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Simplified Human Neutrophil Extracellular Traps NETs Isolation and Handling

No seguinte protocolo, descrevemos um modo muito simples para isolar armadilhas de Neutrófilos extracelulares (NETS) a partir de sangue total humano utilizando reagentes prontamente disponíveis. Em seguida, demonstram como os NET isolado pode ser utilizado em um ensaio de adesão in vitro com células cancerosas.

Simplificado Humanos neutrófilos extracelulares Traps (NETs) Isolamento e Manuseio

Neutrophil Extracellular Traps (NETs) have been recently identified as part of the neutrophil&#8217;s antimicrobial armamentarium. Apart from their role ...

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Quantifying Myeloperoxidase-DNA and Neutrophil Elastase-DNA Complexes from Neutrophil Extracellular Traps by Using a Modified Sandwich ELISA

Quantificação de complexos mieloperoxidase-DNA e elastase-DNA neutrofílico a partir de armadilhas extracelulares de neutrófilos usando um ELISA sanduíche modificado

Certain stimuli, such as microorganisms, cause neutrophils to release neutrophil extracellular traps (NETs), which are basically web-like structures ...

Staining and Imaging to Visualize Neutrophil Extracellular Traps

Immunofluorescence Imaging of Neutrophil Extracellular Traps in Human and Mouse Tissues

Neutrophil Extracellular Traps Imaging in Human and Mouse Tissues (Video) | JoVE

Imagem por Imunofluorescência de Armadilhas Extracelulares de Neutrófilos em Tecidos Humanos e de Camundongos

Neutrophil extracellular traps (NETs) are released by neutrophils as a response to bacterial infection or traumatic tissue damage but also play a role in ...