Name: isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting
Uploaded: 2015-05-01T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting at JoVE.com

המחברים רוצים להכיר בקרן בייקר ו&#39;הנשים במדע המלגה &quot;קרן הילדים מלכותי תמיכה של Zerina Lokmic. אנדרו ג &#39;Elefanty ואדוארד ג&#39; סטנלי הם NHMRC עמיתי מחקר בכיר. עבודה במעבדותיהם נתמכה על ידי NHMRC ותאי גזע אוסטרליה.

הצהרת אתיקה: אישור אתי לאיסוף רקמות מום ועורלת הלימפה התקבלה מועדות האתיקה מחקר האדם בבית החולים מלכותי לילדים, מלבורן, אוסטרליה. הסכמה חתומה התקבלה מההורים של החולים לפני הניתוח. דגימות רקמה נאספו מחולים שאובחנו עם LMS עובר ניתוחים כחלק מהניהול הקליני שלהם וחולים שע?...

<ol>
	<li>Baluk, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functionally+specialized+junctions+between+endothelial+cells+of+lymphatic+vessels.">Functionally specialized junctions between endothelial cells of lymphatic vessels.</a> J Exp Med. 204 (10), 2349-2362 (2007).</li><li>Yao, L. C., Baluk, P., Srinivasan, R. S., Oliver, G., McDonald, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+button-like+junctions+in+the+endothelium+of+airway+lymphatics+in+development+and+inflammation.">Plasticity of button-like junctions in the endothelium of airway lymphatics in development and inflammation.</a> Am J Pathol. 180 (6), 2561-2575 (2012).</li><li>Zawieja, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contractile+physiology+of+lymphatics.">Contractile physiology of lymphatics.</a> Lymphat Res Biol. 7 (2), 87-96 (2009).</li><li>Witte, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+function+relationships+in+the+lymphatic+system+and+implications+for+cancer+biology.">Structure function relationships in the lymphatic system and implications for cancer biology.</a> Cancer Metastasis Rev. 25 (2), 159-184 (2006).</li><li>Andrade, M., Jacomo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+of+the+human+lymphatic+system.">Anatomy of the human lymphatic system.</a> Cancer Treat Res. 135, 55-77 (2007).</li><li>Kumar, V., Abbas, A. K., Aster, J. C., Ch Fausto, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Cotran Pathologic Basis of Disease. 43-78. 2, (2009).</li><li>Shayan, R., Achen, M. G., Stacker, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+vessels+in+cancer+metastasis:+bridging+the+gaps.">Lymphatic vessels in cancer metastasis: bridging the gaps.</a> Carcinogenesis. 27 (9), 1729-1738 (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mulliken &amp; Young's Vascular Anomalies Hemangiomas and. , 1059-1076 (2013).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Mulliken &amp; Young's Vascular Anomalies Hemangiomas. 14, 562-594 (2013).</li><li>Bellini, C., Hennekam, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+disorders+of+primary+malfunctioning+of+the+lymphatic+system.">Clinical disorders of primary malfunctioning of the lymphatic system.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 187-204 (2014).</li><li>Schook, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+lymphedema:+clinical+features+and+management+in+138+pediatric+patients.">Primary lymphedema: clinical features and management in 138 pediatric patients.</a> Plast Reconstr Surg. 127 (6), 2419-2431 (2011).</li><li>Brouillard, P., Boon, L., Vikkula, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+lymphatic+anomalies.">Genetics of lymphatic anomalies.</a> J Clin Invest. 124 (3), 898-904 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=for+the+Study+of+Vascular+Anomalies+(ISSVA)+classification.">for the Study of Vascular Anomalies (ISSVA) classification.</a> Available from: http://www.issva.org/classification.com. , (2014).</li><li>Croteau, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kaposiform+lymphangiomatosis:+a+distinct+aggressive+lymphatic+anomaly.">Kaposiform lymphangiomatosis: a distinct aggressive lymphatic anomaly.</a> J Pediatr. 164 (2), 383-388 (2014).</li><li>Lokmic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+human+lymphatic+malformation+endothelial+cells,+their+in+vitro+characterization+and+in+vivo+survival+in+a+mouse+xenograft+model.">Isolation of human lymphatic malformation endothelial cells, their in vitro characterization and in vivo survival in a mouse xenograft model.</a> Angiogenesis. 17 (1), 1-15 (2014).</li><li>Smith, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphatic+malformations.">Lymphatic malformations.</a> Lymphat Res Biol. 2 (1), 25-31 (2004).</li><li>Chen, E. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Similar+histologic+features+and+immunohistochemical+staining+in+microcystic+and+macrocystic+lymphatic+malformations.">Similar histologic features and immunohistochemical staining in microcystic and macrocystic lymphatic malformations.</a> Lymphat Res Biol. 7 (2), 75-80 (2009).</li><li>Norgall, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+expression+of+VEGFR-3+in+lymphatic+endothelial+cells+from+lymphangiomas.">Elevated expression of VEGFR-3 in lymphatic endothelial cells from lymphangiomas.</a> BMC cancer. 7 (2), 75-80 (2007).</li><li>Garzon, M. C., Huang, J. T., Enjolras, O., Frieden, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+malformations.">Vascular malformations.</a> Part I. J Am Acad Dermatol. 56 (3), 353-370 (2007).</li><li>Osborn, A., Dickie, P., Adams, D., Dickie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> 20th International workshop on Vascular Anomalies. ISSVA. , (2014).</li><li>Baluk, P., McDonald, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Markers+for+microscopic+imaging+of+lymphangiogenesis+and+angiogenesis.">Markers for microscopic imaging of lymphangiogenesis and angiogenesis.</a> Ann N Y Acad Sci. 1131, 1-12 (2008).</li><li>Lokmic, Z., Mitchell, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+the+microcirculation.+Tissue+engineering.">Engineering the microcirculation. Tissue engineering.</a> Part B, Reviews. 14 (1), 87-103 (2008).</li><li>Lokmic, Z., Mitchell, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualisation+and+stereological+assessment+of+blood+and+lymphatic+vessels.">Visualisation and stereological assessment of blood and lymphatic vessels.</a> Histol Histopathol. 26 (6), 781-796 (2011).</li><li>Hagerling, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+multistep+mechanism+for+initial+lymphangiogenesis+in+mouse+embryos+based+on+ultramicroscopy.">A novel multistep mechanism for initial lymphangiogenesis in mouse embryos based on ultramicroscopy.</a> EMBO J. 32 (5), 629-644 (2013).</li><li>Pollmann, C., Hagerling, R., Kiefer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+lymphatic+vessel+development,+growth,+and+function.">Visualization of lymphatic vessel development, growth, and function.</a> Adv Anat Embryol Cell Biol. 214, 167-186 (2014).</li><li>Breiteneder-Geleff, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiosarcomas+express+mixed+endothelial+phenotypes+of+blood+and+lymphatic+capillaries:+podoplanin+as+a+specific+marker+for+lymphatic+endothelium.">Angiosarcomas express mixed endothelial phenotypes of blood and lymphatic capillaries: podoplanin as a specific marker for lymphatic endothelium.</a> Am J Pathol. 154 (2), 385-394 (1999).</li><li>Kaipainen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+fms-like+tyrosine+kinase+4+gene+becomes+restricted+to+lymphatic+endothelium+during+development.">Expression of the fms-like tyrosine kinase 4 gene becomes restricted to lymphatic endothelium during development.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (8), 3566-3570 (1995).</li><li>Schacht, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T1alpha/podoplanin+deficiency+disrupts+normal+lymphatic+vasculature+formation+and+causes+lymphedema.">T1alpha/podoplanin deficiency disrupts normal lymphatic vasculature formation and causes lymphedema.</a> EMBO J. 22 (14), 3546-3556 (2003).</li><li>Kriehuber, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+dermal+lymphatic+and+blood+endothelial+cells+reveal+stable+and+functionally+specialized+cell+lineages.">Isolation and characterization of dermal lymphatic and blood endothelial cells reveal stable and functionally specialized cell lineages.</a> J Exp Med. 194 (6), 797-808 (2001).</li><li>Florez-Vargas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+D2-40+and+LYVE-1+immunostaiing+in+lymphatic+malformations.">Comparative analysis of D2-40 and LYVE-1 immunostaiing in lymphatic malformations.</a> Lymphology. 41 (3), 103-110 (2008).</li><li>Makinen, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PDZ+interaction+site+in+ephrinB2+is+required+for+the+remodeling+of+lymphatic+vasculature.">PDZ interaction site in ephrinB2 is required for the remodeling of lymphatic vasculature.</a> Genes Dev. 19 (3), 397-410 (2005).</li><li>Connell, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+coding+regions+of+VEGFR3+and+VEGFRC+in+Milroy+disese+and+other+primary+lymphoedemas.">Analysis of coding regions of VEGFR3 and VEGFRC in Milroy disese and other primary lymphoedemas.</a> Hum Genet. 124 (6), 625-631 (2009).</li></ol>

LECs לשחק תפקיד חשוב בשמירה על הומאוסטזיס נוזל, תגובה חיסונית לאנטיגנים זרים וקליטה והובלה של כמה חומרים מזינים. הומאוסטזיס הבקר יכול להיות מושפע מתהליכי מחלה כגון זיהומים חיידקיים וגרורות סרטניים, אך LECs יכול גם לפתח מוטציות סומטיות שתגרומנה להיווצרותם של כלי הלימפה ...

תפקידה העיקרי של מערכת הלימפה וכלי הדם הוא לקלוט הלימפה, נוזל ביניים עודף המכיל שומנים, חלבונים ומרכיבים תאיים, ולנהל אותו למערכת ורידי דם. רשת של נימי הלימפה מכוונת לימפה לבלוטות הלימפה שבו הוא הוקרן לנוכחות של אנטיגנים זרים, תהליך חשוב במעקב ופריסה של תאי דם לבנים לנטרל אנטיגנים זרים חיסוניים. מערכת הלימפה חד כיוונית מתחילה ברקמות עם נימי הלימפה הראשוניות, מבנה ייחודי עם שכבה אחת רציפה של תאי האנדותל שטוח מוקף חומה דקות עם צמתים תא מיוחדים המאפשרים כניסה לימפה 1,2. נימים אלה מחוברות מטריצת רקמת חיבור השכנה באמצעות עיגון חוטים כדי למנוע קריסת ספינה בנוכחות של לחץ מוגבר ביניים 3. נימי הלימפה הראשוניות הריקות לאיסוף נימי הלימפהשלהתגבש לגדולים יותר כלי או ורידי הלימפה. בהשוואה ראשוני כלי נימי הלימפה, איסוף יש כלי הלימפה דפנות כולים עבים, שסתומים הלימפה לזווג ונארזים על ידי קרום מרתף רציף שבו כמה תאי שריר חלק מוטבעים 4. פתיחה מתואמת וסגירת שסתומי הלימפה והתכווצות של תאי שריר חלק מאפשרים זרימת הלימפה 3. בבני אדם, ורידי הלימפה מאזורים שונים בגוף מצטרפים לגזעי הלימפה המתמזגים ליצירת שתי צינוריות הלימפה: צינור החזה וצינור הלימפה תקין. צינור החזה מרוקן הלימפה מהצד השמאלי של הגוף ומהצד הימני מתחת לחזה בזמן הלימפה מתנקזת צינור הלימפה תקין מהזרוע הימנית וצד ימין של הראש, צוואר, בית החזה ו. שני צינורות הלימפה לנהל לתוך ורידי subclavian בצוואר 5. הפרעות של מערכת הלימפה מקובצים באופן כללי לרכשND מולדת (טבלה 1). דוגמאות לתנאים נרכשים הנן דַלֶקֶת כְּלֵי הַלְשַׁד ובצקת לימפתית משנית. דַלֶקֶת כְּלֵי הַלְשַׁד היא דלקת של כלי הלימפה עקב זיהום חיידקים. Lymphatics המושפעת להתרחב ולמלא עם תאי polymorphonuclear exudate מכיל. בעור, lymphatics אלה נראית כפסים אדומים, כואבים תת עורי לעתים קרובות מלווים בהגדלה של קשורים צומת הניקוז לימפה (בְּלוּטַת לְשַׁד) 6. בצקת לימפתית משנית נובעת כתוצאה מניזק או שיבוש לחסימת כלי שיט או בלוטה לימפה הלימפה. זה מוביל לנפיחות מתקדמת כרונית עקב הצטברות של דיסטלי לימפה לנזק או שיבוש הליכי. במדינות מפותחות, בצקת לימפתית משנית קשורה לרוב עם ממאירות בי גידולי גרורות להכשיל כלי הלימפה או בלוטות הלימפה אזוריות, או כתוצאה מטיפול אנטי-סרטני לאחר ההסרה כירורגית של בלוטות לימפה, סיסטיק הודעה הקרנה-וthrom פוסט-דלקתיbosis וצלקות 7. בחלקים אחרים של העולם, בצקת לימפתית משנית עשויה להיות משנית לחסימת הלימפה הנגרמת על ידי תולעים טפילים כגון bancrofti Wuchereria 6. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td colspan="4"> הפרעות של מערכת כלי דם הלימפה </td></tr><tr><td> רכש </td><td colspan="3"> מולדים </td></tr><tr><td rowspan="3"> בְּלוּטַת לְשַׁד בצקת לימפתית משנית </td><td> עיקרי בצקת לימפתית 10 </td><td> הלימפה מומים סדירים 13 </td><td> הלימפה מומים הקשורים תסמונות 13 </td></tr><tr><td rowspan="2"> למשל Milroy תסמונת Meige תסמונת </td><td> פשוט: מומים הלימפה </td><td rowspan="2"> למשל Klippel-Tranaunay תסמונת הפארקים וובר תסמונת סטרג&#39;-וובר תסמונת </td></tr><tr><td> בשילוב: מומים נימים-הלימפה מום נימים-הלימפה-ורידים מום נימים-הלימפה-arteriovenous מום ורידים-arteriovenous נימים-הלימפה </td></tr></tbody></table> 1. השולחן של ההפרעות של מערכת כלי דם הלימפה. הפרעות מולדות של מערכת הלימפה כוללות בצקת לימפתית ראשונית (אידיופטית) חשבה שנגרם על ידי מוטציות גנטיות, lymphangiectasia וחריגות של 8,9 מערכת הלימפה. בצקת לימפתית ראשונית יכולה להיות לא סדירה שנגרמה ככל הנראה על ידי מוטציות דה נובו, או בירושה. הפרעות הלימפה יכולות גם להיות מבודדות או מהוות חלק מתסמונת כללית יותר 10. באוכלוסיית הילדים, 97% מהלימפההבצקת היא לא סדירה עם ליקויים במבנה כלי הלימפה הפוגעים בניקוז הלימפה אזורית 11. המחלה Milroy היא דוגמא לבצקת לימפתית העיקרית הנגרמת על ידי מוטציה בגן ניכר בלידה או מייד לאחר 12 VEGFR-3. למרות מצב משפחתי בעיקר, המחלה Milroy יכולה גם להיות מזוהה בתינוקות ללא היסטוריה של מחלות Milroy 32 משפחה. החומרה של כל בצקת לימפתית תלויה בכמות הייצור לימפה והיכולת להעביר לימפה בחזרה למחזור ורידי 6. בהתבסס על מצגת קלינית ובהתפשטות תאי אנדותל באתר, מומים של מערכת הלימפה מסווגות כגידולי הלימפה או מומים הלימפה 13. Kaposiform lymphangiomatosis היא דוגמא לגידול הבקר 14. מומים הלימפה הם חשבו להתעורר במהלך התפתחות עוברית ולגדול באופן יחסי לילד 15,16. רק לעתים רחוקות הם לסגת אבל יכולים מאהלרn ללא תסמינים עד טראומה או זיהום משקעים צמיחה מהירה שמובילה לסיבוכים קליניים. המבנה המסודר של רשת והולכה של הלימפה הלימפה מרקמות למחזור ורידים שתואר לעיל הוא מוטרד במומי הלימפה אשר מורכב של אוספים מקומיים של מבני פיברוזיס חריגים מלאים בנוזל הלימפה. אמנם אין עדות קלינית או ניסויים שכלי פיברוזיס אלה מחוברים לזרימת הלימפה או שהם מכילים שסתומים הלימפה פונקציונליים, זהות הלימפה שלהם אושר על ידי ביטוי של מגוון רחב של סמני תא הלימפה כגון PODOPLANIN, CD31, כלי הלימפה האנדותל קולט 1 (LYVE-1), חלבון homeobox פרוספרו 1 (PROX-1) וVEGFR-3 15,17,18. מבני פיברוזיס אלה יכולים להיות קטנים (microcystic) או גדול (macrocystic), אבל רוב המומים הלימפה מכילים הן microcystic ורכיבי macrocystic (איור 1) 16. לאחר ניתוח, Injection sclerotherapy ו / או גלי רדיו אבלציה המומים הלימפה לעתים קרובות מתרחשת שוב. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52691/52691fig1highres.jpg" width="700" /> איור 1. מורפולוגיה של כלי הלימפה אנושי ומומי הלימפה. הלימפה אנושית רגילה () וכלי הלימפה מום (B ו- C) שכותרתו עם נוגדן לPODOPLANIN (תווית בצבע חום, חץ). כלי מום הלימפה אנושיים מאופיינים בהתרחבות ניכרת והבדלים ניכרים בגודל לומן. מבני פיברוזיס החריגים המקומיים אלה יכולים להיות קטן (ב) או גדול (macrocystic, #) (ג) (microcystic, *). רוב המומים הלימפה מכילים את שני מרכיבי microcystic וmacrocystic. <a href="/files/ftp_upload/52691/52691fig1highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הדמות.</a> &lt;/ P&gt; חוקרים אחדים הציעו שמומי הלימפה מייצגים הפרעה התפתחותית של כלי דם הלימפה שבאין לי LECs פוטנציאל צמיחה נורמלי אבל במקום לא הצליח להתחבר לזרימה הרגילה 19. עם זאת, מצאנו כי LECs LM להתרבות מהר יותר ועמיד יותר לאפופטוזיס מאשר עורלת 15 LECs מצביע על כך שיש פגם עיקרי בLECs LM. כאשר LECs LM מושתל במודל xenograft עכבר, הם יוצרים מבנים דמויים מומים הלימפה 15. זה תומך בהשערה כי מומים הלימפה עלולים להיגרם על ידי אחד או יותר מוטציות סומטיות שהמקורה בLECs LM במהלך התפתחות עוברית. ואכן, הדיווחים אחרונים זיהו מוטציה אחת כזו במקטע קטליטי p110α של phosphoinositide-3-קינאז גן (PIK3CA) 20. בהתחשב בהתקדמות טכנולוגית רצפי DNA, מוטציות רלוונטיות גולד להיות מזוהה בקלות רבה יותר בLECs LM המבודד, המנחה את המחקרים עתידיים של תנאים אלה. הבידוד של LECs קיימא יאפשר השוואות בין LECs נורמלי והרגיל במבחנים כגון הגירה, שגשוג, יכולת להרכיב צינור והישרדות בתגובה לזמינות חומרי מזון מופחת או סוכנים פרו-אפופטוטיים 15. LECs המבודד יאפשר לנו לבצע עוד ביטוי גני תא ספציפי ומחקרי proteomic, להתוות אוכלוסיות הבקר חדשות ולגלות סוכנים תרופתיים רומן מתאים לניהול קליני של מומים הלימפה. יש לנו שפורסם בעבר בשיטת בידוד הבקר המבוססת על הפרדה חרוז מגנטית של LECs מעורלה בילוד ומומי הלימפה 15. דיווחנו אסטרטגיה של הפרדת LECs הבריא וחולה מתאי האנדותל של כלי דם המבוססים על היעדר ביטוי CD34, ואחרי חשיפת חלק תא CD34 נג לסלקציה חיובית לCD31.עם זאת, שיטה זו הקשתה על ידי הנוכחות של תאי האנדותל אינו שייר. זה לא היה תלוי בהסרת עור לפני עיכול רקמת חיבור שלאחר מכן. מזהמים אלה בדרך כלל התרבו במהירות רבה יותר ובכך בסופו overgrew תרביות תאי אנדותל למרות ניסיונות שלאחר מכן לחזור על בידוד הבקר. ואכן, זיהום ראשוני של תאי האנדותל אינו נמוכים כמו 2% עד 5% היה מספיק כדי להכניע את אוכלוסיית הבקר 15. זה גרם לנו לבחון שיטת מיון תא מופעלת fluorescently כאופציה לשיפור תשואת תא הבקר וטהרה. בנוסף, השתמשנו רב פרמטר מיון כדי לשפר את הספציפיות של אוכלוסיות הבקר, הוספת VEGFR-3 וPODOPLANIN לסמני הבחירה לזהות CD34 VEGFR-3 LECs נמוך CD31 ממוצע ממוצע ממוצע PODOPLANIN. הרציונל לבחירת סמנים אלה היה מבוסס על הדיווחים כי בעוד לסה&quot;נ LECs וכלי דם דם האנדותלLLS יש סמנים פני תא משותף רבים כגון CD31, LECs להראות וריאציה פנוטיפי בביטוים של CD34, PODOPLANIN וVEGFR-3 סמן תא שטח בהשוואה לתאי האנדותל של כלי דם דם 21-23. CD31 הוא גליקופרוטאין הטרנסממברני 130 kDa הידוע גם במולקולת הידבקות טסיות דם תא האנדותל 1 (PECAM-1). זה נחשב סמן תא פאן-אנדותל שכן הוא בא לידי הביטוי בכל הסוגים של כלי דם והלימפה 21,24,25. CD34 הוא 110-kDa גליקופרוטאין הטרנסממברני נוכחי על אבות היווצרות הדם ביותר ותאי גזע, תאי האנדותל של כלי דם וכלי הלימפה כמה 26. VEGFR-3, קולט לצמיחה של אנדותל כלי דם גורמי C ו- D, הוא בתחילה קיימים בורידים המתפתחים בעובר העכבר, אך בעקבות מפרט הלימפה מוסדר על ידי שעתוק גורמי HMG-תיבה הקשורים ל- ¥ * $ (SOX) -18, hicken ג o valbumin u pstreaשחקן עמ &#39;מ&#39; ו ranscription לא romoter 2 (COUPTF-השני) וPROX-1, VEGFR-3 ביטוי ורידים הולך לאיבוד והוא הופך להיות מוגבל לLECs העוברי 25,27. PODOPLANIN, קרום kDa 38 mucoprotein, יצוין ראשון בכלי הלימפה בכ עוברי יום 11 (~ E11.0) של התפתחות העוברית של עכבר 28 ותוך שהוא מתבטא בחריפות על ידי כלי הלימפה כלי דם, PODOPLANIN ביטוי על ידי האנדותל הלימפה macrocystic במומי הלימפה משתנה יותר 15. Cytometry זרימת ניסויים מראים כי לפחות חלק מתאי אנדותל CD34 הגבוה CD31 ממוצע להביע את סמן הלימפה PODOPLANIN 29. למרות הערכה שיטתית של מכתים LYVE-1 וPODOPLANIN במומי הלימפה אדם הראתה כי הן יעילות במכתימים האנדותל מום הלימפה 30, ברקמות נורמליות, LYVE-1 נמסר להיות מאוד נוכח בהלימפה הראשוניתהאנדותל נימים אבל מופחת ואפילו נעדרו בהאנדותל הלימפה איסוף 31. כמו המטרה שלנו היא לבודד את שני תאי האנדותל הלימפה הראשוניים ואיסוף שבחרנו שלא להשתמש LYVE-1 כחלק מהאסטרטגיה שלנו בחירת תא. לבסוף, ההחלטה להעסיק סמנים אלה הייתה מבוססת גם על הזמינות של נוגדנים המשמשות diagnostically לתיוג כלי הלימפה להדמיה מיקרוסקופית, תכונה שתאפשר קשר בין cytometry זרימה ומחקרי immunofluorescent. מאמר זה יתאר את שיטת עיכול רקמה, מכתים תא והגדרות FACS נדרשת לבידוד מוצלח של CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGFR-3 LECs ממוצע PODOPLANIN ממוצע, כמו גם תאי האנדותל CD34 גבוהים CD31 ממוצע VEGFR-3 ממוצע PODOPLANIN ממוצע מעורלה ומום הלימפה רקמה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Material/Equipment</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue Number</td>
			<td>Description</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>11965-092</td>
			<td>Used to collect tissue samples from the operating theatre.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 MV Bullet Kit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3202</td>
			<td>EGM-2 MV Bullet Kit contains 500 ml of EBM-2 media and human EGF, hydrocortisone, gentamycin (GA-1000), fetal bovine serum (FBS), VEGF, human FGF-b, R3-IGF-1 and ascorbic acid.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VEGF-C</td>
			<td>R&#38;D Systems</td>
			<td>2179-VC-025</td>
			<td>Complete endothelial cell media is supplemented with 50 ng/mL VEGF-C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-antimycotic solution (100x)</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>15240-062</td>
			<td>This solution contains 10,000U/ml of penicillin, 10,000 mg/ml of streptomycin and 25 mg/ml of Fungizone antimycotic. Use at 1:100 dilution.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from human plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F2006</td>
			<td>Used at 10 mg/ml concentrations. It can be re-used for up to 1 month if kept at 4 degrees and maintained sterile. Use 7 mL to coat 150 cm2 flask.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>StemPro Accutase Cell dissociation reagent</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>StemPro&#174;Accutase&#174; is used at 0.05 ml per cm2 to cover the entire surface area of the flask. Using lesser volumes may result in incomplete cell detachment.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.4% Trypan Blue dye</td>
			<td>Life Technologies (Gibco)</td>
			<td>15250-061</td>
			<td>Used as a viability stain.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Roche Applied Biosciences</td>
			<td>4942078001</td>
			<td>Used at 0.04%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase II</td>
			<td>Worthington Lab</td>
			<td>4176</td>
			<td>Used at 0.25%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase I</td>
			<td>Roche Applied Biosciences</td>
			<td>11284932001</td>
			<td>Used at 0.01%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 mm nylon cell strainers</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated VEGFR-3 clone 9D9F9, clone WM59</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>356204</td>
			<td>Used at 1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7-conjugated CD34, clone 581</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>343516</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse anti human CD31, clone WM59</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>303116,</td>
			<td>Used at 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated rat anti human PODOPLANIN, clone NC-80.</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>337006</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400112</td>
			<td>Used at 1:50 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PE-Cy7-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400126</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APC-conjugated mouse IgG1, k isotype, clone MOPC-21</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400120</td>
			<td>Used at 1:100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa 488-conjugated mouse IgG2a, k isotype, clone RATK2758</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>400525</td>
			<td>Used at 1:200 dilution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of human lymphatic endothelial cells by multi-parameter fluorescence-activated cell sorting

הפרעות במערכת הלימפה כגון בצקת לימפתית העיקרית, מומים הלימפה וגידולי הלימפה הן תנאים נדירים הגורמים לתחלואה משמעותית אך מעט מאוד ידוע על הביולוגיה שלהם. בידוד תאים טהורים ביותר אדם הלימפה אנדותל (LECs) מהרקמה חולה ובריאה היה להקל על מחקרים של האנדותל הלימפה ברמות גנטיות, מולקולריות ותאיות. זה צפוי כי חקירות אלה עשויות לחשוף מטרות לטיפולים חדשים שעשויות לשנות את הניהול הקליני של תנאים אלה. פרוטוקול המתאר את בידודו של אדם עורלת LECs ותאי הלימפה מום הלימפה אנדותל (LM LECs) מוצג. כדי להשיג רקמת השעיה תא בודדת הייתה טחון וטופלה באמצעות אנזימי dispase השני וcollagenase השני. ההשעיה התא בודדת וכתוצאה מכך הייתה אז שכותרתו עם נוגדנים לאשכול של בידול סמנים (CD) CD34, CD31, כלי דם האנדותל Growth Factor-3 (VEGFR-3) וPODOPLANIN. Staiתאי קיימא נד מוינו על סדרן תא מופעל fluorescently (FACS) כדי להפריד את האוכלוסייה ממוצע PODOPLANIN ממוצע LM הבקר CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGFR-3 מאנדותל האחר ותאי האנדותל אינו. LECs LM מסודרים היו בתרבית והרחיב על צלוחיות מצופים פיברונקטין לשימוש ניסיוני נוסף.

בעקבות עיכול רקמה ראשוני, לאחר 24 שעות בתרבות של דגימות unfractionated, ניתן לצפות מושבות תאי אנדותל שונות (איור 2 א) יחד עם תאים כמו פיברובלסטים ותאי שריר חלק. בעקבות מיון ולאחר 24 שעות בתרבית תאים, CD34 נמוך CD31 ממוצע VEGFR-3 התאים ממוצע Podoplanin ממוצע ל...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting at JoVE.com

Isolation of Human Lymphatic Endothelial Cells by Multi-parameter Fluorescence-activated Cell Sorting

המטרה של פרוטוקול זה היא לבודד תאי האנדותל הלימפה בדופן כלי אנושיים מום הלימפה כמו ציסטה-ועורלות באמצעות תא הקרינה המופעל מיון (FACS). culturing התא הבא והתרחבות של תאים אלה מאפשרים רמה חדשה של תחכום ניסיוני למחקרים גנטיים, proteomic, פונקציונליים והתמיינות תאים.

בידוד של תאי האנדותל אדם הלימפה על ידי מיון תא הקרינה המופעל Multi-פרמטר

Lymphatic system disorders such as primary lymphedema, lymphatic malformations and lymphatic tumors are rare conditions that cause significant morbidity ...

Research

JoVE Journal

Medicine

A Real-time Electrical Impedance Based Technique to Measure Invasion of Endothelial Cell Monolayer by Cancer Cells

טכניקה מבוסס למדוד את הפלישה של monolayer תא האנדותל על ידי תאים סרטניים חשמל התנגדות בזמן אמת

Metastatic dissemination of malignant cells requires degradation of basement membrane, attachment of tumor cells to vascular endothelium, retraction of ...

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

בידוד, אפיון והשוואתי התמיינות של תאי גזע אנושיים שיניים זולות נגזרה שיניים קבועות על ידי שימוש בשתי שיטות שונות

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Cell Death Associated with Abnormal Mitosis Observed by Confocal Imaging in Live Cancer Cells

מוות של תאים הקשורים מיטוזה חריגה נצפה על ידי ההדמיה Confocal בתאי סרטן חיים

Phenanthrene derivatives acting as potent PARP1 inhibitors prevented the bi-focal clustering of supernumerary centrosomes in multi-centrosomal human ...

Isolation, Culture, and Imaging of Human Fetal Pancreatic Cell Clusters

בידוד, תרבות והדמיה של צבירי תאים עוברי האנושי לבלב

For almost 30 years, scientists have demonstrated that human fetal ICCs transplanted under the kidney capsule of nude mice matured into functioning ...

Isolation of Cancer Stem Cells From Human Prostate Cancer Samples

בידוד של תאי גזע סרטני מדגימות אדם סרטן הערמונית

The cancer stem cell (CSC) model has been considerably revisited over the last two decades. During this time CSCs have been identified and directly ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

לומד סרטן לבלב גזע מאפייני תא לפיתוח טיפול חדש אסטרטגיות

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Isolation and Culture Expansion of Tumor-specific Endothelial Cells

הרחבת בידוד והתרבות של תאי האנדותל גידול ספציפי

Freshly isolated tumor-specific endothelial cells (TEC) can be used to explore molecular mechanisms of tumor angiogenesis and serve as an in vitro model ...

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

הדור מהיר ויעיל של תאי גזע פלוריפוטנטיים רקומביננטי אנושי ידי recombinase בתיווך המרת קלטת ב<em&gt; AAVS1</em&gt; לוקוס

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

Isolation and Culture of Primary Endothelial Cells from Canine Arteries and Veins

בידוד והתרבות של תאי האנדותל ראשיים מן העורקים וורידים לכלבים

Cardiovascular disease is studied in both human and veterinary medicine. Endothelial cells have been used extensively as an in vitro model to study ...

Isolation of Endothelial Progenitor Cells from Healthy Volunteers and Their Migratory Potential Influenced by Serum Samples After Cardiac Surgery

בידוד של ובתאים אנדותל מן הבריאה מתנדבת ופוטנציאל הנדידה שלהם בהשפעת דגימות סרום לאחר ניתוח הלב

Endothelial progenitor cells (EPCs) are recruited from the bone marrow under pathological conditions like hypoxia and are crucially involved in the ...