Name: scalable 96-well plate based ipsc culture and production using a robotic liquid handling system
Uploaded: 2015-05-14T14:00:00
Duration: 8 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System at JoVE.com

Dit werk werd mede ondersteund door NIH subsidies, R44 en R01 GM087784 HL109505. Auteurs danken de technische en OEM-team van Gilson, INC voor uitgebreide technische ondersteuning.

De robot vloeistofverwerkingsysteem, waarbij de volgende protocollen was Gilson pipetmaX, vergemakkelijkt geautomatiseerde, schaalbare stamcelkweek en productie behoud traditionele voorwaarden adherente cultuur in de 96-well plaat formaat. Net als de traditionele 6-well plaat cultuur iPSCs gekweekt met dit protocol als monolaag afzonderlijke kolonies maar in de 96-well plaat formaat. Elk goed kan isogene of verschillende zijn en ofwel configuratie kan worden gekweekt in parallel, omdat de robot kunnen houden elkaar goed gescheiden. De typische robot iPSC cultuur routine heeft twee fasen: een voedingsprogramma, waar culturen worden gevoed op een klantgerichte schema en een passage programma waar de gebruiker de dissociatie werkwijze en splitsverhouding daardoor seeding dichtheid en omvang snelheidsregelend kiest. De volgende protocollen beschrijven hoe een nieuwe cultuur wordt gestart, hoe voeding en passage worden bereikt en de aanvullende programma&#39;s die iPSC cultuur te vergemakkelijken. <p class=&quot;Jove_content&quot;&gt; Opmerking: Zie de Materials List voor specifieke aanbevelingen over de matrix bekledingsmateriaal en dissociatie reagentia gevalideerd voor de volgende protocollen. 1. Voorbereiden van extracellulaire matrix Gel Coated 96-well platen <ol><li> Verwijder het verpakkingsmateriaal uit zes nieuwe, RT 96-well platen en plaats ze op de vloeistofverwerking robot bed in de posities 2, 3, 5, 7, 8, 9 (zie Figuur 1A bed posities). </li><li> Plaats een pre-gekoelde, 4 ° C 4-goed dieptepunt in bed positie 6. </li><li> Load kolom 12 van de punt rek bedpositie 1 met voorgekoeld, 4 ° C 200 pi pipet tips. </li><li> Vul het eerste (links meeste) trog goed in bed positie 6 met 25 ml 4 ° C DMEM / F12 door het gieten van een hoeveelheid met behulp van steriele techniek. Alternatief, gebruik dan een pipet om de overdracht te voltooien. </li><li> Verwijder de 96-wells plaat deksels en schuif elk in de speciaal ontworpen plaat deksel houden rack (PLHR, zie Figuur 1A). Contact te vermijdenmet binnenkant plaat deksels. Opmerking: Behandeling de binnenzijde van een plaat deksel of de plaat stapelen deksels waarbij de binnenkant van een deksel raakt buiten andere een uitstekende route op vervuiling. </li><li> Met behulp van de robot controle touchpad, drukt u op de volgende reeks knoppen om het goed pre-wetting te starten: <ol><li> Tik &quot;Voer een protocol&quot;. </li><li> Selecteer &quot;extracellulaire matrix gel Prewet&quot; en tik op Volgende. </li><li> Gebruiker beslissing: Tik &quot;test run&quot; om de stap-voor-stap wizard gebruiken om pre-test het geselecteerde programma. Opmerking: De robot loopt niet, maar de software test het protocol voor software problemen. Met de vastgestelde protocollen, tikken, &quot;skip setup&quot; is acceptabel. </li><li> Tik op &quot;Run Protocol&quot;. </li></ol></li><li> Tijdens de pre-bevochtigende (stap 1,6) voortgaan met stap 1.8. </li><li> Dooi op ijs één 4 mg aliquot groeifactor verminderde extracellulaire matrix gel (GFRM) in een 50 mlconische buis bewaard bij -80 ° C. Houd het monster op ijs pas klaar voor gebruik. Opmerking: De GFRM stollen indien toegestaan ​​tot kamertemperatuur te komen en niet nuttig. </li><li> Resuspendeer de 4 mg GFRM aliquot in 24 ml 4 ° C DMEM / F12 met 25 ml glazen pipet. Bij het overbrengen van de DMEM / F12, pauze voor 2-3 sec om de pipet te koelen voorafgaand aan de GFRM monster resuspenderen. </li><li> Wanneer de pre-bevochtiging proces (stap 1.6) is voltooid, verder met stap 1.11. </li><li> Breng de 24 ml DMEM / F12 GFRM mengsel aan de vierde bron van de trog in bed positie 6. </li><li> Met behulp van de robot controle touchpad, drukt u op de volgende reeks knoppen om de extracellulaire matrix gel-coating proces te starten: <ol><li> Tik &quot;Voer een protocol&quot;. </li><li> Selecteer &quot;extracellulaire matrix gel monster&quot; en tik op Volgende. </li><li> Gebruiker beslissing: Tik &quot;test run&quot; om de stap-voor-stap wizard gebruiken om pre-test het geselecteerde programma. Opmerking: De robot loopt niet, maar Rather de software test het protocol voor software problemen. Met de vastgestelde protocollen, tikken, &quot;skip setup&quot; is acceptabel. </li><li> Tik op &quot;Run Protocol&quot;. </li></ol></li><li> Bij stap 1.12 is voltooid, vervangt de plaat deksels. </li><li> Breng de extracellulaire matrix gel gecoate 96-well platen met een 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde incubator Houd er 24 uur waarna de platen klaar voor gebruik of opgeslagen wordt. Opmerking: Onder verzachtende omstandigheden kan de nieuw beklede extracellulaire matrix gel platen worden na 15-30 min incubatie maar O / N bij 24 uur incubatie wordt aanbevolen. </li><li> Herhaal protocol stappen 1,1, 1,3, 1,5-1,6, 1,10, en 1,12-14 totdat alle DMEM / F12 met GFRM gebruikt. </li></ol> 2. opslaan extracellulaire matrix Gel Coated 96-well platen <ol><li> Verwijder extracellulaire matrix gel beklede 96-putjesplaten van de 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde incubator. </li><li> Optioneel: Allow de extracellulaire matrix gel gecoate 96-well platen tot kamertemperatuur komen alvorens tot stap 2,3. Opmerking: Deze optionele stap vermindert condenswater wanneer de platen worden geplaatst bij 4 ° C. </li><li> Plaats de platen op de vloeistofverwerking robot bed in de posities 2, 3, 5, 7, 8, 9 (zie Figuur 1A bed posities). </li><li> Load kolom 12 van de tip rek in bed stand 1 met RT 200 ul pipet tips. </li><li> Plaats een vier dieptepunt reservoir in bed positie 6. </li><li> Vul ook 4 (meest rechtse) van het reservoir met RT DMEM / F12. </li><li> Verwijder de 96-well plaat deksel en schuif elk in de PLHR. </li><li> Met behulp van de robot controle touchpad, drukt u op de volgende combinatie van knoppen: <ol><li> Tik &quot;Voer een protocol&quot;. </li><li> Selecteer &quot;extracellulaire matrix gel monster&quot; en tik op Volgende. </li><li> Gebruiker beslissing: Tik &quot;test run&quot; om de stap-voor-stap wizard gebruiken om pre-test het geselecteerde programma. Opmerking: De robot loopt niet, maar de software test het protocol voor software problemen. Met de vastgestelde protocollen, tikken, &quot;skip setup&quot; is acceptabel. </li><li> Tik op &quot;Run Protocol&quot;. </li></ol></li><li> Eenmaal voltooid, vervangt de plaat deksels en verwijder de platen uit de machine bed. </li><li> Wikkel rond het gehele zijde van elk extracellulaire matrix gel beklede 96 putjes (waarbij het deksel aan de plaat) met een een inch bij 6 inch paraffine film strip. Zorg ervoor dat de paraffine film om een ​​luchtdichte afdichting te creëren rekken. </li><li> Optioneel: Label de borden met de datum van de voltooide extracellulaire matrix gel coating, de extracellulaire matrix gel lotnummer, gebruikersnaam en alle andere informatie. </li><li> Bewaar de platen bij 4 ° C wanneer ze goed te gebruiken gedurende twee weken niet. Opmerking: Platen met succes gebruikt buiten de grens van twee weken, wordt echter niet aanbevolen. </li></ol> 3. Het uitvoeren van een Stem Cell Colony zaaien DichtheidGradiënt in de 96-well plaat formaat van een live of bevroren Cultuur: Hoe te beginnen of herstel van de normale Passage intervallen een stamcellijn <ol><li> Als beginnend met een bevroren cultuur, ga dan naar stap 3.2. Als beginnend met een live stamcel cultuur al op een bord, begint u bij stap 3.5. </li><li> Ontdooi de bevroren cultuur door zwenken de buis in een 37 ° C waterbad tot slechts een klein stuk ijs blijft. </li><li> Optioneel: Verdun de ontdooide cellen in 10 ml rt stam celgroei medium (SCGM), centrifugeer gedurende 2 min bij 300 xg, zuig de supernatant media en resuspendeer de pellet stamcellen in 7 ml vers SCGM bevattende 10 uM Y27632. Opmerking: Deze stap elimineert overdracht van de bevriezing media. </li><li> Ga verder met stap 3.6. </li><li> Als ab levende reeds geplateerd stamcellen: passage cellen normaal gebruik van enzymatische of niet-enzymatische dissociatie. Probeer een totaal van 1,5-3.000.000 cellen te oogsten; gewoonlijk een putje van een zes-puts plaat. Centrifugeer de geoogste cellen2 min bij 300 xg, zuig het supernatant media en resuspendeer de stamcellen pellet in 7 ml verse SCGM met 10 uM Y27632. Ga verder met stap 3.6. </li><li> Zorg ervoor dat de cellen, ofwel van een bevroren of levende cultuur worden gesuspendeerd in 7 ml RT SCGM met 10 uM Y27632. </li><li> Load kolom 12 van de tip rek in bed staat een met RT 200 ul pipet tips. </li><li> Plaats een vier dieptepunt reservoir in bed positie 2. </li><li> Plaats een nieuwe extracellulaire matrix gel gecoate 96-well plaat voorverwarmd tot 37 ° C in bed positie 5 en verwijder het deksel te plaatsen in de PLHR. </li><li> Breng de 7 ml geresuspendeerde cellen om goed 3 van het reservoir door de pipet of steriel giet. <ol><li> Met behulp van de robot controle touchpad, drukt u op de volgende combinatie van knoppen: </li><li> Tik &quot;Voer een protocol&quot;. </li><li> Selecteer &quot;Seeding Density Gradient&quot; en tik op Volgende. </li><li> Gebruiker beslissing: Tik &quot;test run&quot; om de stap-voor-stap wizard gebruiken om pre-test van de selected programma. Opmerking: De robot loopt niet, maar de software test het protocol voor software problemen. Met de vastgestelde protocollen, tikken, &quot;skip setup&quot; is acceptabel. </li></ol></li><li> Tik op &quot;Run Protocol&quot;. </li><li> Wanneer de verdunningsreeks voltooid, opnieuw bedekken de plaat en in een 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde incubator tot de volgende voeding. </li><li> Optioneel: Label de plaat met de datum, de stam gegevens, gebruikersnaam, het type media en andere relevante informatie. </li><li> In de komende paar dagen, voeden de 96-well plaat zoals vereist het gebruik van Protocol 4 hieronder. Opmerking: Een typische stamcel plaat zal een volledige media verandering nodig eenmaal per 24 uur en de SCGM niet Y27632 voor het voeden bevatten; Alleen tijdens de eerste passage na zaaien. Voorafgaand aan het voeden, controleren de plaat voor vervuiling en kolonie dichtheid. Zie stap 3.16 voor meer over de controle kolonie dichtheid. </li><li> In de komende dagen, een aantal kolommen in de buurt van het cinvoeren van de plaat (gewoonlijk kolommen 5-8) een ideale dichtheid voor het doorlaten te benaderen; om deze dichtheid identificeren vergelijken 96-putjesplaat de densiteitbereik figuur 3B de volgende informatie in gedachte: <ol><li> Passage wanneer de ruimte tussen de meerderheid van de kolonies ongeveer 25% van aangrenzende kolonie diameter. Opmerking: De reden om de tijd te identificeren passage is dat een andere cyclus van voederen en groei zou leiden tot kolonies contact maken, moet worden voorkomen. </li></ol></li><li> Om een ​​uniform verdund bord te starten en te beginnen regelmatig cultuur, selecteert u een kolom die is op de ideale dichtheid en passage. Zie Protocol 5 tot passage. </li></ol> 4. Feeding 96 putjes plaat Stem Cell Kolonies Opmerking: Het volgende protocol beschrijft het voeden van een 96-well stamcellen kolonie plaat. De techniek kan worden opgeschaald tot 6 totale platen parallel tegemoet. <ol><li> Verwijder de 96-well stem celkolonie plaat boven de 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde incubator. </li><li> Controleer de plaat voor vervuiling en celdichtheid. Om te voeden, opdat de kolonie dichtheid dan het ideale passage dichtheid. Zie figuur 3B voor informatie over de dichtheid. Opmerking: Besmetting kan als troebele media te presenteren en worden begeleid door een onaangename geur. Kleine, uiteraard niet-iPSC aggregaten kan ook zichtbaar onder microscopische inspectie. Om celdichtheid evalueren, zie stap 3.16.1 hierboven. </li><li> Plaats de 96-well stamcellen kolonie plaat in bed positie 3 op een hellend, 37 ° C helling. </li><li> Load kolom 12 van de tip rek in bed stand 1 met RT 200 ul pipet tips. </li><li> Plaats een 4-goed dal in bed positie 2. </li><li> Vul ook 3 van de trog in bed positie 2 met 8 ml verse, RT SCGM zonder Y27632 hetzij door steriele gieten of pipet overdracht. </li><li> Verwijder de 96-well stamcellen kolonie plaat deksel te plaatsen in de PLHR. </li><li> De ... gebruikenrobot controle touchpad, drukt u op de volgende combinatie van knoppen: <ol><li> Tik &quot;Voer een protocol&quot;. </li><li> Selecteer &quot;Colony Feed One Plate &#39;en tik op Volgende. </li><li> Gebruiker beslissing: tik &quot;test run&quot; om de stap-voor-stap wizard gebruiken om pre-test het geselecteerde programma. Let op, de robot loopt niet, maar de software test het protocol voor software problemen. Met de vastgestelde protocollen, tikken, &quot;skip setup&quot; is acceptabel. </li><li> Tik op &quot;Run Protocol&quot;. </li></ol></li><li> Wanneer de voeding protocol is voltooid, opnieuw betrekking op de 96-well plaat stamcellen kolonie en terugkeert naar 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde incubator tot de volgende voeding of passage vereist. Dit is meestal nodig na 24 uur. Opmerking: Het wordt aanbevolen om het voederen evenement op de plaat deksel met de datum, het type media, gebruikersnaam en andere relevante informatie vast te leggen. </li></ol> 5. Passage 96-well Platen Stem Cell Colonies <ol><li> Na enkele voeden cycli de 96-well stamcellen kolonie plaat klaar om doorgang zal zijn. Dit protocol beschrijft passage van de ene kolom naar een 96-well plaat, wat een 1:12 splitsingsverhouding. De gebruiker kan de splitsingsverhouding omschrijven en elk aantal putjes of kolommen te splitsen, waaronder het kiezen putten die niet aangrenzend zijn. </li><li> Vergelijk de 96-well plaat stamcellen kolonie dichtheid naar figuur 3B te bepalen of passage. De ideale passage dichtheid wanneer de ruimte tussen de meeste kolonies ongeveer 25% van aangrenzende kolonie diameter of latere voederen en daarbij de kolonies groeien tot elkaar. </li><li> Onderzoek de 96-well stamcellen kolonie plaat onder een microscoop om te zorgen dat er geen besmetting. </li><li> Plaats de 96-well stamcellen kolonie plaat in bed positie 3 op een hellend, 37 ° C helling. </li><li> Load kolommen 8-12 in de tip laden rek in bed stand 1 met RT 200 ul pipettips. </li><li> Plaats een 4-goed dal in bed positie 2. </li><li> Laat trog goed 1 leeg is, zet 8,5 ml SCGM + 10 uM Y27632 in zowel 2, zet 3,5 ml 30% proteolytische en collagenolytische dissociatie reagens (of EDTA gebaseerd dissociatie reagens) in een goed 3, zet 4,5 ml PBS in een goed 4. Opmerking: Alle reagentia kunnen bij kamertemperatuur of 37 ° C. RT proteolytische en collagenolytische dissociatie reagens bij 30% verdund met PBS werd gebruikt voor de vet- en fibroblast afgeleide iPSC kweek beschreven. </li><li> Plaats een nieuwe, voorverwarmd 37 ° C extracellulaire matrix gelgelaagde 96-putjesplaat in bedpositie 5. </li><li> Verwijder de 96-well plaat stamcellen kolonie deksel en de nieuwe 96-well plaat deksel en plaats ze zowel de PLHR. </li><li> Met behulp van de robot controle touchpad, drukt u op de volgende combinatie van knoppen: <ol><li> Tik &quot;Voer een protocol&quot;. </li><li> Selecteer &quot;Colony Split 01:12 Column 1&quot; en tik op Volgende. </li><li> Gebruiker beslissing: Tik &quot;test run&quot; te gebruikende stap-voor-stap wizard om pre-test het geselecteerde programma. Opmerking: De robot loopt niet, maar de software test het protocol voor software problemen. Met de vastgestelde protocollen, tikken, &quot;skip setup&quot; is acceptabel. </li><li> Tik op &quot;Run Protocol&quot;. </li></ol></li><li> Zodra de passage protocol is voltooid, RE-COVER beide platen. </li><li> Optioneel: Label de nieuwe plaat met de vereiste informatie (dat wil zeggen, datum, cellijn, passage nummer, het type media, gebruikersnaam etc.). </li><li> Terug beide platen naar 37 ° C, 5% CO2 bevochtigde incubator tot de volgende voeding of passage vereist. Opmerking: De volgende voeding is meestal na 24 uur. Opmerking: De cellen en kolonies moet hechten aan de plaat binnen 2-3 hr splitsen en zien er erg verspreid. Dit komt door de aanwezigheid van Rho-kinase remmer en de cellen condenseert en vertonen karakteristieke stamcel morfologie (bijv geplaveide verpakt kolonies with kleincellige volume te grote kern ratio) na de eerste Rho-kinase remmer vrij voeden. </li></ol> 6. Oogst 96-well plaat stamcellen voor productie Opmerking: Stamcel kolonies kunnen voor gebruik op enig moment tijdens de cultuur worden geoogst. Meestal gebeurt dit wanneer de cellen zijn klaar om passage (zie protocol 5). Dit protocol wordt beschreven hoe elf kolommen oogsten uit een 96-well plaat stamcellen kolonie. <ol><li> Onderzoek de 96-well stamcellen kolonie plaat onder een microscoop om te zorgen dat er geen besmetting. </li><li> Plaats de 96-well stamcellen kolonie plaat in bed positie 3 op een hellend, 37 ° C helling. </li><li> Load kolommen 11 en 12 in de top geladen rek in bed stand 1 met RT 200 ul pipet tips. </li><li> Plaats een 4-goed dal in bed positie 2. </li><li> Laat trog goed 1 leeg is, zet 8,5 ml SCGM in zowel 2, zet 3,5 ml 30% proteolytische en collagenolytische dissociatie reagens (of EDTA gebaseerd dissociatie reagens) in een goed3, zet 4,5 ml PBS in een goed 4. Opmerking: Alle reagentia kunnen bij kamertemperatuur of 37 ° C. </li><li> Verwijder de 96-well stamcellen kolonie plaat deksel en plaats in de PLHR. </li><li> Met behulp van de robot controle touchpad, drukt u op de volgende combinatie van knoppen: <ol><li> Tik &quot;Voer een protocol&quot;. </li><li> Selecteer &quot;Colony Harvest Kolommen 2-12&quot; en tik op Volgende. </li><li> Gebruiker beslissing: Tik &quot;test run&quot; om de stap-voor-stap wizard gebruiken om pre-test het geselecteerde programma. Opmerking: De robot loopt niet, maar de software test het protocol voor software problemen. Met de vastgestelde protocollen, tikken, &quot;skip setup&quot; is acceptabel. </li><li> Tik op &quot;Run Protocol&quot;. Opmerking: Zodra de collectie is voltooid, zullen de cellen in trog goed 2 en klaar voor de inzameling. </li></ol></li></ol>

De auteurs MKC, MJG, EEB, NJD en RO zijn of waren ten tijde van de ontwikkeling van medewerkers InvivoSciences, INC die bedacht en ontwikkelde de robot protocollen beschreven. TW is de CSO voor InvivoSciences INC. SH is een werknemer van Gilson INC.

In de huidige studie ontwikkelden we een methode robotachtige cultuur iPSC productie die miniaturizes en automatiseert het voeden en passage in een 96-well plaat formaat, terwijl ook mogelijk efficiënte schaal omhoog. Een vloeibare handlingrobot werd gebruikt om routinematig voeden iPSC koloniën en passage ze op regelmatige tijdstippen door enzymatische dissociatie. De robot werd geprogrammeerd om extracellulaire matrix gel-beklede platen produceren en uitvoeren van een gradiënt entdichtheid. Wanneer fibroblasten en vetweefsel afgeleide iPSCs werden gekweekt in dit systeem meer dan 20 passages, ongeveer 3 maanden, werd pluripotentie behouden, net als stabiel karyotype. Beide cellijnen waren in staat differentiatie in hartspiercellen. Samen, het verzamelen van protocollen hier beschreven stelt gebruikers in staat met zeer weinig stamcellen cultuur ervaring, of beperkte toegang tot gespecialiseerde apparatuur cultuur, de cultuur van stamcellen en het bereiken van een hoge cel productie of multi-line behandeling met minimale arbeid en kosten. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; De robot protocollen hier beschreven bieden een methode voor het economisch opschaling van iPSC productie en behandeling. Een voordeel is schaalbaar stamcel cultuur in een gevestigde plaat gebaseerd formaat hier gedemonstreerd en eerder 44,47 - 49 tot pluripotentie behouden. Terwijl andere formaten van schaalbare stamcellen kweken opbrengst pluripotente cellen 20,23,29 deze plaat gebaseerde methode vereist in wezen geen verandering in de cultuur-formaat, zoals aanpassing aan schorsing, het gebruik van anti- chemicaliën of langdurig gebruik van Rho-kinase remmer 20. Deze plaat gebaseerde methode kan dus snel en voorspelbaar, geschikt voor nieuwe lijnen, omdat de kweekomstandigheden zijn vergelijkbaar. Aangezien het gebruik van iPSCs voor ziektemodel verhoogt 4,6,19,50 worden nieuwe iPSC lijnen doorlopend wordt. De hier beschreven technieken zijn het meest geschikt voor de cultuur nieuwe lijnen in middelgrote tot grote volumes en doorzet, omdat de barrière om de overgang naar het formaat is low. Dit geldt ook voor de arbeid en apparatuur nodig om de koloniën. Tenslotte, omdat het formaat en de behandeling zijn vergelijkbaar met de gehanteerd om en bevestig iPSC lijnen, cultuur prestaties, zoals voorgeschreven differentiatie omgeving, waarschijnlijk meer voorspelbaar. Figuur 8 illustreert een strategie voor opschaling van stamcelproductie in 96-wells platen. Eén plaat (cyclus 0) wordt gebruikt om een ​​robot zaad 12 nieuwe platen, een 12 voudige toename (cyclus 0-1). Na enkele dagen voeren, één van de twaalf platen passage naar een andere set van twaalf platen (cyclus 1 tot Cyclus 2) zaad. De overige elf platen zijn nu beschikbaar voor andere doeleinden en vertegenwoordigen de produktie component van het systeem. In dit tempo zal passage van een plaat bieden 11 platen elke cyclus, of om de 3-4 dagen. Deze methode kan verder worden opgeschaald wanneer meerdere platen worden doorgekweekt zoals in de overgang van cyclus 2 tot cyclus 3. Cyclus 3, twee platenaltijd gebruikt om de kolonie te behouden en zaden 24 nieuwe platen. De resterende 22 platen zijn dan beschikbaar voor gebruik na elke passage cyclus. Op elk punt in het onderhoud cyclus kan de gebruiker zaad meer platen te verhogen. Een voorbeeld zou zijn om passage elke kolom voor twee groei cycli. De eerste doorgang geconverteerd plaat in twaalf platen en elk van de twaalf platen gebruikt 144 schotels zaad. In dit geval kan een gebruiker begint met één plaat en na twee passages, of ongeveer 1,5-2 weken kweken, heeft 144 schotels. Bijvoorbeeld, de fibroblast en vetweefsel iPSC lijnen op ongeveer 25-75000000 cellen per 96-well plaat als u klaar bent om de doorgang. 144 platen kan dus vertegenwoordigen ongeveer 4-7 x 10 9 cellen. Welke arbeidslast voor het dragen 144 96-putjesplaten robotically? Eén van de doelen van dit werk was schaalbare stamcelproductie dat arbeid verminderd in vergelijking met traditionele (dwz 6-well plaat) stamcelcultuur. De robot accomplishes dit door het verlichten van de noodzaak om fysiek te behandelen elke plaat tijdens het voeden en passage. Terwijl 96-well plaat productie schalen lineair dat het traditionele 6-well platen, de tijd doorbrengt een technicus die met de platen aanzienlijk minder middels robotic cultuur. De productie-efficiëntie robotachtige cultuur afgeleid van deze verschillen (figuur 9). Het werd gevonden technici zou een 6-wells plaat uit de incubator te verwijderen, controleren op de microscoop, dan zuigen en voeden de plaat in ongeveer 3,5 minuten. Ter vergelijking, technici brengen ongeveer 30 sec verwijderen van een 96-well plaat uit de incubator en inspecteren het op de microscoop voor dichtheid en vervuiling voordat zij het in de robot. Met een uitgezette voeding protocol vergelijkbaar met de hierboven beschreven, kunnen zes 96-putjesplaten worden geladen en gevoed, die ongeveer 21 min, of 3,5 min per plaat draait. De totale verstreken tijd om een ​​plaat te voeden is vergelijkbaar tussen robotic en handmatige methoden, maar om de hand-feed 6 platen een technicus is vereist voor alle 21 min, terwijl de technicus besteedt slechts 3 min behandeling van de zes platen voor de robot (30 sec inspectie per plaat). Zoals figuur 9 laat zien, de tijd dat een technicus besteedt de behandeling 144 platen met behulp van de robot is ongeveer 1,2 uur, in tegenstelling tot 8 uur met de hand en de robot zal nooit een fout maakt het hanteren van de platen of de overdracht van vloeistoffen. De 96-well iPSC kweekmethoden hier beschreven bieden een handelbaar platform voor complexe screening taken. Omdat elk putje genetisch identiek en gezaaid met dezelfde dichtheid van dezelfde oorspronkelijke pool kan variabelen over de plaat worden gedistribueerd en onderhouden door de robot met commercieel verkrijgbaar reservoirs voorwaarden scheiden. Dit zou nuttig zijn voor experimenten zoals groei stamcellen media ontwikkeling 34,35,47, substraat of cultuur conditie testen en toxicologisch onderzoek met behulp van stamcellen51. Aangezien elke stamcellijn is uniek in termen van optimale kolonie grootte en passage eisen, kan men dit systeem gebruiken om te zaaien dichtheid, het voeden van de frequentie en de passage handling moduleren door het manipuleren van de geoogste kolommen, de mechanische agitatie tijdens passage en het voederen frequentie. Itereren door middel van deze variabelen kan de gebruiker in staat om snel een reeks voorwaarden die geschikt zijn voor de cultuur van een nieuwe lijn of een nieuwe cultuur technieken te ontwikkelen. Het robotsysteem Ook kan handhaven 96 parallel maar onafhankelijk stamcel kolonies. Wanneer iPSC zijn afgeleid uit somatische cellen of gekloneerd na genetische manipulatie zijn vele parallelle klonen gescreend op potentiële iPSC lijnen opleveren. Zodra enkele cellen worden gezaaid in 96-well platen, kan dit systeem voeden en de doorgang 96-well platen houdt elke kolonie gescheiden. Dit maakt een zeer hoge doorvoersnelheid bij het selecteren van potentiële klonen en elimineert de moeilijkheid in fysiek kweken 96 parallelle lijnen. Deze werkwijze ookllows opgeschaald productie van elke kloon, zodat materiaal is beschikbaar voor parallelle analyse. Tenslotte, voor ogen we integratie van deze kweek technieken een robot plate handel systeem levert platen en naar de incubator zodat volautomatische cultuur. Dit kan worden bereikt met complexere robotica die zorgen voor een grotere uitzetting bestaan ​​omdat de protocollen die beschreven zijn overdraagbaar naar andere plaat gebaseerde systemen. De eerste kritische stappen aan te pakken in de protocollen zijn degenen die te voorkomen en te controleren op vervuiling, zoals de stappen 1.5 en 4.2. Verontreinigingen, zoals hierboven besproken, kunnen met succes worden vermeden als goede steriele techniek en gezond verstand worden gebruikt. Het is noodzakelijk, ongeacht de stamcel cultuur-formaat, dat de exploitant controle op vervuiling en te doen in dit protocol op de aangegeven stappen aanzienlijk het risico op besmetting te verminderen. Juiste extracellulaire matrix gel applicatie is een tweede esstiële stap naar de algehele succes van dit protocol. Zonder juiste coaten van de 96-well platen, zal de stamcellen niet groeien. Een veel voorkomend probleem is incompleet goed coating. De ervaring leert dat luchtbellen, elektrostatische aantrekking en capillaire werking belemmeren volledig goed coating. De vooraf bevochtigen stap (1,6) ontwikkeld om een ​​aanzienlijke verbetering wellbodem bekleding en mag niet worden overgeslagen. Deze pre-bevochtigingsstap lijkt de schijnbare hydrofobiciteit van het plastic 96-well plaat verminderen zodat wanneer de extracellulaire matrix gel coating aangebracht wordt gelijkmatig verdeeld over de putbodem en zijkanten. Het wordt ook aangeraden om voorzichtig tik op de 96-well platen tegen een schone hand eens gecoat om zelfs extracellulaire matrix gel oplossing distributie zorgen. De dissociatie parameters zijn ook belangrijk voor het optimaliseren. Verlengde incubatie met enzym of EDTA gebaseerd dissociatie reagens resulteert in afzonderlijke cellen die al dan niet het doel tijdens passage. Daarom is de operatormoet speciale aandacht besteden aan hoe dissociatie tijd, trituratie kracht en wassen herhalingen beïnvloeden kolonie morfologie en gezondheid en dienovereenkomstig aan te passen. Inzicht in de beperkingen van de hier beschreven technieken zijn van cruciaal belang voor een goede werking. Zoals bij elke andere celcultuur instelling het gebruik van 96-well platen vormt een relatief hoog risico besmetting. Zoals hierboven is beschreven, een technicus stapelaars elke plaat tijdens het voeden en passage; bijvoorbeeld, bij het openen, waardoor de plaat op de robot bed, en het controleren van de plaat op de microscoop. Daarom, zoals waargenomen na stap 1,5, is het noodzakelijk de binnenzijde van elke plaat deksel niet aanraakt of dit deel geven mogelijk besmette oppervlak blootgesteld, zoals de schuine verwarmingsblokken of verticale pinnen op het bed. Tijdens protocol ontwikkeling werd deze beperking ontdekt en was de aanzet tot een rek te plaat deksels houden om de steriliteit te behouden te ontwikkelen. Ook de trog reservoirs, pipet tips en other levert op de liquid handling robot bed zijn potentiële bronnen van verontreiniging, omdat ze open zijn voor het milieu en behandeld door de technicus. Daarom moet een goede steriele techniek zodanig worden toegepast zoals het verminderen van bewegingen overbelicht cultuur materialen of geopend vloeistoffen. Een andere beperking is dat wanneer het protocol wordt opgeschaald, visuele controle van elk putje van&gt; 100 96-well platen is omslachtig. Dit kan worden behandeld door visuele inspectie van de gehele plaat op tekenen van besmetting, zoals troebele media, verdachte bronnen te identificeren. Voor toekomstige schaal, zal het gebruik van een geautomatiseerde microscoop en indicator van de celgroei en potentiële verontreiniging worden opgenomen. Samengevat, de high-throughput 96 putjes gebaseerde platform hier beschreven biedt een reproduceerbare high fidelity werkwijze voor stamcelkweek en productie in een plaatformaat. Deze methode vermindert de nodige ervaring, apparatuur die nodig is en arbeid tijd gewijd aan stamcel cultuur terwijlbehoud van de voordelen van de traditionele hechtende kweek.

Het gebruik van menselijke geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) heeft sinds hun afleiding aanzienlijk gestegen in 2007 1 voor verbinding testen, regeneratieve geneeskunde en de ziekte modelleren 2-6. Deze eis komt uit iPSC vermogen om grote aantallen van pluripotente cellen die kunnen worden onderscheiden in somatische cellen op een ongekende hoeveelheid verkregen. Zoals geleid differentiatie technieken te verbeteren 7-10 en de ontwikkeling van de menselijke cel of weefsel modelleren en celtherapie verhoogt 11-14, neemt ook de eis voor de massa-productie van hoogwaardige iPSCs. Algemeen wordt aangehaald dat naast andere ziekten, myocardiaal infarct of B-cel functionele vervanging honderden miljoenen verlangen miljarden iPSC afgeleide somatische cellen 15-18. Bovendien, steeds complexere 3D weefsel modellering voor drug discovery en therapy zullen grote aantallen cellen 9,13,19 eisen. In al deze voorbeelden gedefinieerd, uniform en reproduceerbaar iPSCs moet beschikbaar en eenvoudig te produceren. Om produceren stamcellen afgeleide biofarmaceutica en cellen voor weefselregeneratie en transplantatie, een rendabele cell-productietechnologie noodzakelijk. Geschaalde productie iPSCs is gericht op suspensiekweek 20-25 of suspensie met behulp van microdrager substraten 26-28 mede omdat deze technieken met succes toegepast voor grootschalige, non-iPSC eukaryote gebaseerde productie. Verschillende groepen hebben suspensiecultuur systemen die pluripotente stamcellen 20,21,23,24,29 opbrengst aangetoond. Echter, deze benaderingen te gebruiken dure en complexe systemen niet direct beschikbaar voor onderzoekers ontwikkelen van nieuwe differentiatie programma, rijden tissue engineering en het doen van Laboratory grootschalig onderzoek. Bovendien, schorsing en microdrager iPSC culturen moeten worden aangepast en technieken of chemicaliën niet gevonden in de traditionele aanhangend iPSC cultuur zoals continue gebruik van Rho-kinase remmer, antischuimmiddelen en filtratie om aggregatie te reguleren. Fysieke belasting van de cellen vaker in suspensiekweek, die door mechanisch roeren en tijdens microdrager botsing. Deze problemen beperken de voorspelbaarheid en snelheid waarmee nieuw gegenereerde stamcellijnen kunnen worden gekweekt in suspensie. Anderen hebben plate handling robot systemen die plaat kweektechnieken 30,31 nabootsen ontwikkeld, maar deze platformen vereisen aanzienlijke investeringen voor apparatuur en deskundigheid om in aanvulling op de fundamentele uitdagingen van stamcelcultuur. De volgende werkzaamheden beschrijft de ontwikkeling en de praktijk van een schaalbaar iPSC cultuur systeem dat een op zichzelf staand, standaard 8-kanaals robot maakt gebruik van vloeibarehandler en 96-well platen. Deze methode werd ontworpen om laboratoriumschaal iPSC cultuur en high-volume iPSC productie te overbruggen (bijvoorbeeld 10 7-1,5 x 10 9 cellen per week per technicus), waardoor die de ontwikkeling van nieuwe technologieën iPSC om eenvoudig opschalen productie zonder grote hardware of arbeid investeringen. Deze werkwijze is betrekkelijk goedkoop te installeren, vereist weinig tot geen stamcelkweek, programmering of techniekervaring, heeft een kleine footprint materiaal zonder dat een specifieke celkweek kap en gebruikt standaard celkweek apparatuur gemiddelde tot hoge doorvoer geautomatiseerde inschakelen cel productie. Het doel was om een ​​systeem dat in staat schaalbare stamcel cultuur die kan worden gebruikt door laboratoria nieuw voor celcultuur voort te ontwikkelen, degenen die vinden handleiding teelt een belemmering voor de ontwikkeling van hun ideeën of degenen die een economisch middel om grote aantallen stamcellen te produceren. De hier gepresenteerde platform verwijdert technicus invloed opstamcel cultuur en normaliseert de voeding en de passage procedures om consistente stamcellen productie mogelijk te maken.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>96-well; Well volume: 360uL; Cell growth area: 0.32cm2; Individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Trough</td>
			<td>SeahorseBio</td>
			<td>201308-100</td>
			<td>Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167023</td>
			<td>10 racks gilson 96tips D200 tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12500062</td>
			<td>DMEM/F12 powder.&#160; Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor Reduced Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Referred to as, &#34;extracellular matrix gel&#34; in the text.&#160; Matrigel GFR, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5857</td>
			<td>mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 Media</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>AdooQ BioScience</td>
			<td>A11001-50</td>
			<td>Rock inhinitor Y-27632 2HCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>ACCUTASE</td>
			<td>Referred to as, &#34;proteolytic and collagenolytic dissociation reagent&#34; in the text.&#160; Accutase 500 mL sterile cell solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30256FS</td>
			<td>PBS w/o CA MG 500 mL, 6/pk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson PIPETMAX</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>PIPETMAX</td>
			<td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable 96-well plate based ipsc culture and production using a robotic liquid handling system

Vervolg vooruitgang in pluripotente stamcellen cultuur wordt de kloof tussen de bank en bed voor het gebruik van deze cellen in de regeneratieve geneeskunde, drug discovery en het testen van de veiligheid. Om produceren stamcellen afgeleide biofarmaceutica en cellen voor weefselregeneratie en transplantatie, een rendabele cell-productietechnologie noodzakelijk. Onderhoud van pluripotentie en stabiele prestaties van de cellen in downstream-toepassingen (bijvoorbeeld celdifferentiatie) over de tijd is van cruciaal belang voor grootschalige cel productie. Maar die moeilijk te bereiken vooral als cellen handmatig worden gekweekt waarin de exploitant aanzienlijke variabiliteit introduceren en onbetaalbaar duur opschaling. Om high-throughput, grootschalige stamcel productie mogelijk te maken en te verwijderen operator invloed roman stamcellen cultuur protocollen met behulp van een bench-top multi-channel vloeistof handling robot ontwikkeld die minimale technicus betrokkenheid of ervaring nodig. MetDeze protocollen humane geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) werden gekweekt in voedingsvrije van directe uit een bevroren voorraad en onderhouden in 96-wells platen. Afhankelijk van de cellijn en de gewenste schaal-up rate, kan de operator eenvoudig bepalen wanneer passage gebaseerd op een reeks van beelden met de optimale kolonie dichtheden voor de splitsing. Dan is de noodzakelijke reagentia bereid zijn om een ​​kolonie splitsen om nieuwe platen te voeren zonder centrifugeren stap. Na 20 passages (~ 3 maanden), twee iPSC lijnen gehandhaafd stabiele karyotypes, uitgedrukt stamcel markers en gedifferentieerd in hartspiercellen met een hoog rendement. Het systeem kan daarop high-throughput screening van nieuwe differentiatie protocollen of genetische manipulatie ontworpen voor 96 putjes uitgevoerd. Deze technologie zal de arbeid en technische lasten grote aantallen identieke stamcellen voor een groot aantal toepassingen.

Watch this Scientific Journal Video about Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System at JoVE.com

Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes.

Schaalbare 96 putjes plaat Based iPSC Culture and Production Met een Robotic Liquid Handling System

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Alginaat inkapseling van pluripotente stamcellen Met behulp van een co-axiale Nozzle

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Wijze van Studeren Palatal Fusion met statische Organ Cultuur

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functionele klonen behulp van een<em&gt; Xenopus</em&gt; Eicel Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Het bijhouden van cellen in GFP-transgene zebravis Met behulp van de photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Grootschalige productie van cardiomyocyten van menselijke pluripotente stamcellen met behulp van een zeer reproduceerbare Small-Molecule Based Differentiatie Protocol

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

De productie van pluripotente stamcellen van Mouse Vruchtwater cellen met behulp van een transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

Een inrichting voor het uitvoeren van celmigratie / wondgenezing in een 96-putjesplaat

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

Gedefinieerde Xeno-vrij en kweekomstandigheden Feeder-gratis voor de generatie van menselijke iPSC afkomstige Retinal cel modellen

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

Een In Vitro Model van een Parallel-plaat perfusie-systeem te bestuderen van de naleving van de bacteriële om te enten van weefsels

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Driedimensionaal angiogenese-assay systeem met co-Culture Spheroids gevormd door endotheliale kolonie vormende cellen en mesenchymale stamcellen

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...