Name: scalable 96-well plate based ipsc culture and production using a robotic liquid handling system
Uploaded: 2015-05-14T14:00:00
Duration: 8 min
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この作品は、NIHの助成金、R44 GM087784とR01 HL109505によって部分的にサポートされています。著者らは、拡張された技術的なサポートのためにギルソン、INCの技術およびOEMチームに感謝します。

の構想、ここでは説明ロボットのプロトコルを開発し、著者MKC、MJG、EEB、NJD及びROまたはInvivoSciencesの開発従業員の時にあったされ、INC。 TWはInvivoSciences INCためCSOである。SHはギルソン社の従業員です。

本研究では、小型化し、また効率的なスケールアップを可能にしながら、96ウェルプレートフォーマットで送り通路を自動化するiPS細胞の産生のためのロボット文化の方法を開発しました。液体ハンドリングロボットを日常酵素的解離によって、定期的にiPS細胞コロニーと通路にそれらを供給するために使用しました。ロボットはまた、細胞外マトリックスゲル被覆プレートを生成し、播種密度勾配を実行するようにプログラムしました。線維芽細胞と脂肪由来iPS細胞が20以上の通路、約3ヶ月間、このシステムで培養したときに安定した核型であったように、多能性は、維持されました。両方の細胞株は、心筋細胞に分化することができました。一緒に、ここに記載されたプロトコルのコレクションは、培養幹細胞に、非常に少ない幹細胞培養の経験、または特殊な培養装置へのアクセスが制限されたユーザを可能にし、高い細胞産生または最小限の労力とコストで扱うマルチラインを実現します。 、49 -一つの利点は、ここで、以前に44,47を実証確立プレートベースのフォーマットでスケーラブルな幹細胞培養です。スケーラブルな幹細胞培養収率の多能性細胞の他の形式は、20,23,29、このプレートベースの方法は、適応のような懸濁液に培養形式の本質的変化、化学物質やRhoキナーゼ阻害剤20の長期使用を消泡を使用する必要がありませんが。培養条件が類似しているため、このプレートベースの方法は、したがって、急速に、そして予想通り、新しい行を収容することができます。病気のモデリングのための性IPSCの使用は4,6,19,50を増加すると、新しいiPS細胞ラインが連続して発生します。形式に移行する障壁がlであるため、ここで説明する技術は、高容量とスループットの培地中で培養新しい行に最も適していますOW。これはコロニーを維持するのに必要な労働力や設備についても同様です。形式と取り扱いが派生し、そのような指向分化などiPS細胞株、培養性能を検証するために使用される環境に類似しているため、最終的に、より予測可能である可能性が高いです。 図8は、96ウェルプレートにおける幹細胞産生のスケールアップのための1つの戦略を示す図です。一方のプレート（サイクル0）はロボット12の新しいプレート、12倍の増加（1サイクル0）を播種するために使用されます。給餌の数日後、12プレートの一方は、12プレート（サイクル2サイクル1）の別のセットをシードする継代されています。残りの11のプレートは現在、他の用途に利用可能であり、システムの生産要素を表します。このレートでは、一方のプレートの通過が11プレート毎サイクル、または3〜4日ごとに提供します。この方法は、二つのプレートがあり、サイクル3サイクル2からサイクル3への移行に示すように、複数のプレートが継代されている場合に、より拡張することができ常にコロニーを維持し、24の新しいプレートに播種するために使用されます。残りの22のプレートは、すべての通路サイクル後の使用のために利用可能です。メンテナンスサイクル中の任意の時点で、ユーザは、生産を増大させるために多くのプレートに播種することができます。一例は、通路に2つの成長サイクルのすべての列になります。第一通路12は、プレートに一方のプレートを変換して、12プレートの各々は、144プレートに播種するために使用されます。この場合、ユーザは、1つのプレートから始まり、2つの通路、または培養物の約1.5〜2週間後に、プレート144を有しています。例えば、線維芽細胞および脂肪iPS細胞株は、通路に96ウェルプレート当たり約25から75000000細胞の準備ができたときに得られます。プレート144は、従って、約4~7×10 9細胞を表すことができます。 ロボット144 96ウェルプレートを搬送するための労働負担とは何ですか？この仕事のための目標の一つは、細胞培養幹伝統的な（ すなわち 、6ウェルプレート）に比べて労力を低減し、スケーラブルな幹細胞の産生しました。ロボットACComplishesこの物理的に供給および継代中に各プレートを処理する必要性を軽減することもできます。直線的に、それは伝統的な6ウェルプレートであろうように、96ウェルプレートの生産スケールが、技術者がプレートでの作業に費やす時間が有意に少なく、ロボット培養を使用しています。ロボット培養の生産効率は、この差（ 図9）に由来します。これは、技術者は、インキュベーターから6ウェルプレートを取り外し、顕微鏡でそれを確認し、その後吸引し、約3.5分でプレートを養うことができるが見つかりました。対照的に、技術者は、約30秒インキュベーターから96ウェルプレートを取り外し、ロボット上に配置する前に、汚染密度用顕微鏡でそれを検査費やします。上記と同様の拡大給餌プロトコル六の96ウェルプレートを、約21分、またはプレートあたり3.5分をとる、ロード及び供給することができます。プレートを養うために、総経過時間はロボットと同等です技術者は、ロボットのための6つのプレート（プレートあたり30秒検査）を取り扱うだけで3分を費やしているのに対し、ICと手動方法が、手差しに6プレート技術者は、すべての21分のために必要とされます。 8手動で時間とロボットとは対照的に、 図9に示すように、技術者がロボットを使用して144板を扱うに費やす時間は約1.2時間である間違いは、プレートの取り扱いや液体を転送行うことはありません。 ここで説明した96ウェルiPS細胞の培養方法は、複雑なスクリーニング作業のための扱いやすいプラットフォームを提供します。各ウェルは、遺伝的に同一であり、同じ初期プールから同じ密度で播種するので、変数は、プレート全体に分散され、条件を分離する市販のリザーバを有するロボットによって維持することができます。これは、幹細胞を用いた幹細胞増殖培地の開発34,35,47、基板または培養条件の試験および毒性試験などの試験のために有用であろう51。各幹細胞系が最適なコロニーの大きさと通路の要件の点でユニークであるので、一つの通路と、給電周波数の間に、収穫の列を操作することにより、周波数と通過処理を供給する、播種密度を調節するために、機械的に攪拌し、このシステムを使用することができるに。これらの変数を反復すると、ユーザーはすぐに新しいラインの培養に適した条件のセットを見つけたり、新しい培養技術を開発することができます。ロボットシステム96はまた、平行であるが独立した幹細胞のコロニーを維持することができます。 iPS細胞は体細胞に由来するか、または遺伝子操作した後にクローン化されると、多くの並列のクローンは、潜在的なiPS細胞株を得るためにスクリーニングされます。単一細胞を、96ウェルプレートに播種した後、このシステムを供給することができ、それぞれのコロニーを維持する通路96ウェルプレートを分離しました。これは、潜在的なクローンを選択する際に、非常に高いスループットを可能にし、物理的に96本の平行線を培養することの困難を排除します。この方法はまた、材料は平行分析のために容易に利用可能であるようにllowsは、各クローンの産生をスケールアップ。最後に、我々は完全に自動化された文化を可能にインキュベーターにしてから、プレートを提供ロボットプレート輸送システムと、これらの培養技術を統合構想します。これは、ここで説明する基本的なプロトコルは、他のプレートベースのシステムに転送されているので、それ以上の拡張を可能にし、より複雑なロボットで達成することができます。 プロトコルに対処するための最初の重要なステップは、防止し、1.5と4.2の手順などの汚染を確認するものです。良好な無菌技術および常識が利用される場合汚染は、上述のように、うまく回避することができます。これは、オペレータの汚染のチェックと示されたステップで、このプロトコルではそうすることが著しく汚染のリスクを減少させることに関係なく、幹細胞培養フォーマットの、不可欠です。適切な細胞外マトリックスゲルアプリケーションは、第ESSありますこのプロトコルの全体的な成功にentialステップ。適切に96ウェルプレートをコーティングすることなく、幹細胞は増殖しないであろう。一般的な問題の1つは、不完全よくコーティングです。経験は、気泡、静電引力及び毛管作用が完了ウェルコーティングを妨げることが示されています。プリウエット工程（1.6）かなりよくボトムコーティングを改善するために開発され、スキップされるべきではありません。この予備湿潤段階は、細胞外マトリックスゲルコーティングが適用されたとき、それが均一にウェル底部と側面に分散されるようにプラスチックの96ウェルプレートの見かけの疎水性を減少させるように思われます。また、静かに一度でも外マトリックスゲル溶液の分布を確実にするためにコーティングされた清潔な手に対して96ウェルプレートをタップすることをお勧めします。解離パラメータも最適化することが重要です。酵素またはEDTAベースの解離試薬と拡張インキュベーションまたは通過中の目標であってもなくてもよい単一の細胞になります。したがって、オペレータ解離時間、摩砕力、および洗浄の繰り返しは、コロニー形態や健康に影響を与えるし、それに応じて調整する方法に特別な注意を払う必要があります。 ここに記載された技術に限界を理解することは、正常な動作に最も重要です。他の細胞培養の設定のように、96ウェルプレートを使用することは、比較的高い汚染リスクを提示します。上述したように、技術者は、摂食及び継代中に各プレートを処理しています。例えば、蓋を開けロボットベッドの上でプレートを入れて、顕微鏡にプレートをチェックするとき。ステップ1.5の後に述べたようにそのため、そのようなベッドの上で傾斜加熱ブロックまたは垂直ピンとして任意の板蓋の内側に触れたり、潜在的に汚染された表面に、この部分が露出しないが不可欠です。プロトコルを開発する際には、この制限は、発見され、無菌性を維持するために、プレートの蓋を保持するためのラックを開発するための原動力でした。同様に、トラフリザーバー、ピペットチップおよびo彼らは環境に開放し、技術者によって処理されるため、液体ハンドリングロボットベッドの上THER供給が汚染源となる可能性があります。したがって、良好な滅菌技術は、露出した培養材料またはオープン液体の上の動きを減少させるものとして適用されるべきです。別の制限は、プロトコルが視覚的に&gt; 100 96ウェルプレートの各ウェルをチェックし、スケールアップされたときに面倒であるということです。これは、疑わしいウェルを同定するために、このような混濁媒体として、視覚的に汚染の兆候をプレート全体を検査することによって対処することができます。将来のスケールアップのために、細胞の増殖および潜在的な汚染の自動顕微鏡とインジケータの使用が組み込まれます。 要約すると、ここで説明した高スループットの96ウェルベースの​​プラットフォームは、プレート形式での幹細胞培養および生産のための再現性、高忠実度の方法を提供しています。この方法は、細胞培養しばらく幹専用の必須の経験、必要な設備と労働時間を削減します従来の接着培養の利点を維持します。

6 -ヒト人工多能性幹細胞（性IPSC）の使用は、化合物試験、再生医療や病気のモデリング2 2007年1での導出以来、大幅に増加しています。この需要は圧倒的な量で体細胞に分化させることができる多能性細胞を大量に生成するiPS細胞の能力から来ています。指向分化技術が7向上したよう-ので、高品質のiPS細胞の大量生産のための要件を行い、14 - 10をし、ヒト細胞または組織のモデリングと細胞治療の開発11を増加させます。 18 -それは広く、体細胞15を由来する他の病気の中で、心筋梗塞またはB細胞機能の交換はiPS細胞数億から数十億のが必要になることが挙げられます。薬物発見およびtの場合さらに、ますます複雑な3D組織モデリングherapyは細胞9,13,19を大量に要求します。これらの例の全てにおいて、定義され、均一で再現性の性IPSCは、製造するのに利用可能であり、簡単でなければなりません。 組織工学および移植のための細胞由来の生物薬剤学及び幹細胞を産生するために、費用対効果の高いセル製造技術が不可欠です。これらの技術が正常に大規模な、非iPS細胞、真核生物ベースの生産のために展開されている理由の一つ28 -マイクロキャリア基材26を用いて、25または懸濁液- iPS細胞のスケーリングされた生産は、懸濁培養20に焦点を当てています。いくつかのグループは、多能性幹細胞20,21,23,24,29を得る懸濁培養システムを実証しています。しかし、これらのアプローチは、組織工学を駆動しlaboratを行う、新規の分化プログラムを開発する研究者には容易に入手できない高価で複雑なシステムを利用しますORY規模な研究。また、サスペンションとマイクロキャリアiPS細胞の培養物は、凝集を調節するために、適応と技術や、Rhoキナーゼ阻害剤の連続使用など、従来の付着性iPS細胞培養では見られない化学物質、消泡剤および濾過を必要とします。細胞への物理的ストレス、機械的に攪拌することにより、ならびにマイクロキャリア衝突時に導入された、懸濁培養においてより一般的です。これらの問題は、新たに生成された幹細胞株は懸濁状態で培養することができるれる予測と速度を制限します。その他は、プレート培養技術30,31を模倣するロボットプレートハンドリングシステムを開発してきたが、これらのプラットフォームは、機器や幹細胞培養に関連する基本的な課題に加えて動作するための専門知識のために多額の投資を必要としています。 次の作業は自己完結型の、標準的な8チャンネルロボット液体を利用するスケーラブルなiPS細胞培養システムの開発と実践について説明しますハンドラ96ウェルプレート。この方法は、実験室規模iPS細胞培養および大量iPS細胞の生産を橋渡しするように設計された（ 例えば 、10 7 -技術者あたり週1.5×10 9細胞）の新しいiPS細胞技術の開発、それらを有効にするには、簡単に大規模なハードウェアや労力の投資なしで生産を拡大します。この方法では、セットアップが比較的安価で、専用の細胞培養フードを必要とせずに小型機器の設置面積を有し、無幹細胞培養、プログラミングやエンジニアリングの経験に少しを必要とし、自動化された高スループットにメディアを有効にするには、標準的な細胞培養装置を利用しますセル生産。目的は、細胞培養物を食い止めるために、新しい研究所、マニュアル栽培に自分のアイデアや幹細胞を大量に生産する経済的な手段を望むものを開発する障壁を見つけた人が利用できる、スケーラブルな幹細胞培養が可能なシステムを開発することでした。ここで提示プラットフォームは、上の技術者の影響を除去します細胞培養幹、一貫した幹細胞の産生を可能にするために送り通路手順を正規化します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>96-well; Well volume: 360uL; Cell growth area: 0.32cm2; Individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Trough</td>
			<td>SeahorseBio</td>
			<td>201308-100</td>
			<td>Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167023</td>
			<td>10 racks gilson 96tips D200 tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12500062</td>
			<td>DMEM/F12 powder.&#160; Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor Reduced Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Referred to as, &#34;extracellular matrix gel&#34; in the text.&#160; Matrigel GFR, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5857</td>
			<td>mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 Media</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>AdooQ BioScience</td>
			<td>A11001-50</td>
			<td>Rock inhinitor Y-27632 2HCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>ACCUTASE</td>
			<td>Referred to as, &#34;proteolytic and collagenolytic dissociation reagent&#34; in the text.&#160; Accutase 500 mL sterile cell solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30256FS</td>
			<td>PBS w/o CA MG 500 mL, 6/pk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson PIPETMAX</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>PIPETMAX</td>
			<td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable 96-well plate based ipsc culture and production using a robotic liquid handling system

多能性幹細胞培養における継続的な進歩は、再生医療、創薬及び安全性試験では、これらの細胞を使用するためのベンチ、ベッドサイドの間のギャップを閉じています。組織工学および移植のための細胞由来の生物薬剤学及び幹細胞を産生するために、費用対効果の高いセル製造技術が不可欠です。多能性と時間をかけてダウンストリーム·アプリケーション（ 例えば 、細胞分化）の細胞の安定した性能を維持することは、大規模なセル生産に最も重要です。まだそれは、オペレータがかなりの変動を導入だけでなく、スケールアップをするために非常に高価であることができる場所細胞が手動で培養される場合は特に達成することは困難です。最小限の技術者の関与や経験を必要とする液体ハンドリングロボットを開発したマルチチャンネルベンチトップを使用して、オペレータの影響新規幹細胞培養プロトコルを高スループット、大規模な幹細胞の生産を可能にし、削除します。ととも​​にこれらのプロトコルは、ヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）を凍結ストックから直接無フィーダー条件で培養し、96ウェルプレート中で維持しました。通路に分割するための最適なコロニー密度を示す一連の画像に基づいて、ときに細胞株、所望のスケールアップ率に応じて、操作者が容易に決定することができます。その後、必要な試薬は、遠心分離工程なしに新しいプレートにコロニー分割を行うために用意されています。 20継代（2~3ヶ月）後、2つのiPS細胞株は、安定した核型を維持した幹細胞マーカーを発現し、かつ高効率で心筋細胞に分化しました。システムは、96ウェルプレート用に設計された新たな分化プロトコルまたは遺伝子操作のその後のハイスループットスクリーニングを行うことができます。この技術は、アプリケーションのための無数の同一性幹細胞を大量に生成するために労力および技術的負担を減少させます。

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Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes.

ロボット液体ハンドリングシステムを用いたiPS細胞培養および生産ベースのスケーラブルな96ウェルプレート

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