Name: scalable 96-well plate based ipsc culture and production using a robotic liquid handling system
Uploaded: 2015-05-14T14:00:00
Duration: 8 min
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이 작품은 NIH 보조금, R44 GM087784 및 R01 HL109505에 의해 부분적으로 지원하고있다. 저자는 확장 된 기술 지원, 길슨에서 INC을 기술 및 OEM 팀 감사합니다.

저자 MKC, MJG, EEB, NJD 및 소유주 또는 여기에 설명 된 로봇 프로토콜을 잉태하고 개발 InvivoSciences의 개발 직원, INC의 시간에 있었다. TW는 InvivoSciences INC의 CSO이다. SH는 길슨 주식회사의 직원입니다.

본 연구에서 우리는 miniaturizes 또한 효율적인 스케일 업을 가능하게하고있는 동안 96 웰 플레이트 형식으로 공급하고 통로를 자동화 IPSC 생산을위한 로봇 문화의 방법을 개발했다. 액체 처리 로봇은 일상적으로 효소 분해에 의해 정기적으로 IPSC 식민지와 통로를 공급하는 데 사용되었다. 로봇과 같은 세포 외 기질 겔 코팅 된 플레이트를 제조 및 파종 밀도 구배를 수행하도록 프로그램 하였다. 섬유 아세포 및 지방 유래 iPSCs가 큰 20 유로, 약 3 개월 동안이 시스템에서 배양했을 때 안정적인 핵형이었다로, 만능은 유지되었다. 두 세포주는 심근 세포로 분화 할 수 있었다. 함께, 여기에 설명 된 프로토콜의 컬렉션 문화 줄기 세포로, 아주 작은 줄기 세포 문화 체험, 또는 전문 문화 장비에 제한된 액세스 권한이있는 사용자를 가능하게하고 높은 전지 생산 또는 최소한의 노동과 비용으로 처리하는 멀티 라인을 얻을 수 있습니다. 44,47 - 49 능성을 유지하기 위해. 확장 성 줄기 세포 배양 수율 만능 세포의 다른 형식 20,23,29이 판 기반의 방법은 적응 같은 서스펜션에 문화 형식의 본질적 변화, 화학 물질이나의 Rho 키나아제 억제제 (20)의 장시간 사용을 소포제의 사용을 필요로하지 않지만. 배양 조건이 유사하기 때문에이 판 기반의 방법은 따라서 신속하고 예측, 새로운 라인을 수용 할 수 있습니다. 질병 모델링을위한 iPSCs의 사용은 4,6,19,50 증가함에 따라, 새로운 IPSC 라인은 지속적으로 생성됩니다. 형식에 전환 장벽이 L이기 때문에 여기에 설명 된 기술은 높은 볼륨 및 처리량 중간에 문화의 새로운 라인에 가장 적합아야. 이것은 또한 식민지를 유지하기 위해 필요한 노동 및 장비 마찬가지입니다. 포맷 처리는 유도 및 분화와 같은 지시 IPSC 라인 배양 성능을 검증하기 위해 사용되는 환경과 비슷하기 때문에 마지막으로,보다 예측이 될 가능성이 높다. 도 8은 96 웰 플레이트에 줄기 세포 생산의 스케일 업을위한 하나의 전략을 예시한다. 한 접시 (사이클 0) 로봇 (12)의 새로운 판, 12 배 증가 (1주기 0) 시드하는 데 사용됩니다. 공급 몇 일 후, 십이 판 중 하나는 열두 판 (주기 2주기 1)의 또 다른 세트를 시드 계대입니다. 나머지 열한 플레이트 다른 용도로 사용할 수 있으며, 시스템의 구성 요소의 생산을 나타낸다. 이 속도로, 한 판의 통과는 11 판 매 사이클, 또는 3-4 일마다를 제공 할 것입니다. 주기 3 년주기 (3)에주기 2의 전환과 같이 여러 판이 계대 할 때이 방법이 더 확장 할 수 있습니다,이 판은항상 식민지를 유지하고 24 새로운 판을 배정 할. 나머지 22 판은 모든 통로 사이클 후 사용 후 사용할 수 있습니다. 유지주기의 어떤 시점에서 사용자는 증산 이상의 플레이트를 시드 할 수있다. 한 가지 예는 통로에 두 개의 성장주기에 대한 모든 열 것입니다. 제 1 통로는 열두 판에 한 판을 변환하고, 열두 판의 각각 144 판을 시드하는 데 사용됩니다. 이 경우, 사용자는 하나의 플레이트로 시작하고 두 개의 통로, 또는 배양의 약 1.5 주 후에, 판 (144)을 갖는다. 예를 들어, 섬유 아세포 및 지방 IPSC 라인 통로 96 웰 플레이트 당 약 25-75000000 세포를 준비 할 때, 수율. 144 판을 따라서 약 4-7 × 10 9 세포를 나타낼 수 있습니다. 로봇 (144) 96 웰 플레이트를 운반 노동 부담은 무엇인가? 이 작품의 목표 중 하나는 세포 배양 줄기 전통 (즉, 6 웰 플레이트)에 비해 노동을 감소 확장 성 줄기 세포 생산했다. 로봇 ACComplishes이 물리적으로 공급 및 계대 동안 각 플레이트를 처리 할 필요성을 경감함으로써. 선형 그것과 같은 96 웰 플레이트 생산 규모는 기존의 6 웰 플레이트에, 기술자가 판 작업 소요 시간이 로봇 문화를 사용하여 훨씬 적은 것입니다 동안. 로봇 문화의 생산 효율이 차이 (도 9)로부터 도출된다. 그것은 기술자의 플레이트 약 3.5 분, 인큐베이터에서 6 웰 플레이트를 제거 현미경에 그것을 확인 후 대기음 및 공급 수 발견되었다. 비교에서, 기술자는 약 30 초 인큐베이터에서 96 웰 플레이트를 제거하고, 로봇에 배치하기 전에 밀도 및 오염 현미경 검사에 보낸다. 상술 한 것과 유사한 확장 프로토콜 급전, 여섯 96- 웰 플레이트를 약 21 분, 또는 플레이트 당 3.5 분 걸린다 로딩 공급 될 수있다. 접시를 공급하는 총 경과 시간은 로봇 사이의 비교입니다기술자가 로봇에 대한 여섯 판 (플레이트 당 30 초 검사) 처리 만 3 분을 소비하는 반면 IC 및 수동 방법,하지만 손 피드 6 판 기술자는 모두 21 분 필요합니다. 수동으로 8 시간에 반대하고 로봇이 실수가 판을 취급 또는 액체를 전송하지 않습니다 않을 것 같은 그림 9에서 볼 수 있듯이, 기술자가 로봇을 사용하여 144 판을 처리 소요 시간은 약 1.2 시간이다. 여기에 설명 된 96 웰 IPSC 배양 방법은 복잡한 심사 작업을위한 다루기 쉬운 플랫폼을 제공합니다. 각 웰은 유 전적으로 동일한 같은 초기 풀에서 동일한 밀도로 시드이기 때문에, 변수는 판에 분산 및 조건을 분리하기 위해 상업적으로 사용할 수 저수지와 로봇에 의해 유지 될 수있다. 여기에는 줄기 세포 성장 배지 개발 34,35,47, 기판 또는 배양 조건 테스트와 줄기 세포를 이용하여 독성 연구와 같은 실험에 유용 할 것이다각 줄기 세포주 최적 콜로니 크기 및 통로 요건의 관점에서 고유하기 때문에 (51). 한 번 수확 열 통로 동안 기계적 교반 및 반송 주파수를 조작하여 파종 밀도, 먹이 주파수 및 통로 처리를 변조하는데,이 시스템을 사용할 수있다. 이러한 변수의 반복을 통해, 사용자가 신속하게 새로운 라인의 배양에 적합한 조건의 세트를 찾거나 새로운 배양 기술을 개발할 수 있도록한다. 로봇 시스템 (96)은 또한 평행하지만 독립적 줄기 세포 콜로니를 유지할 수있다. IPSC는 체세포로부터 유래 또는 유전자 조작 후 복제 할 때, 많은 병렬 클론 가능성 IPSC 라인을 산출하기 상영된다. 단일 세포를 96 웰 플레이트에 접종되면,이 시스템은 공급하고 각 콜로니를 유지 통로 96- 웰 플레이트를 분리. 이것은 잠재적 인 클론을 선택할 때 매우 높은 처리량을 가능하게하고 물리적으로 96 평행선을 배양의 어려움을 제거합니다. 이 방법 또한그 재료가 병렬 분석을 위해 쉽게 사용할 수 있도록 llows 각 클론의 생산을 축소. 마지막으로, 우리와 완전 자동화 된 문화를 활성화 인큐베이터에서 접시를 제공하는 로봇 판 인신 매매 시스템이 배양 기술을 통합 구상. 이 여기에 설명 된 기본 프로토콜이 다른 판 기반 시스템에 양도하기 때문에 더 큰 확장을 위해 더 복잡한 로봇으로 수행 할 수 있습니다. 프로토콜에 해결하기위한 첫 번째 중요한 단계는 방지하고 1.5 및 4.2 단계 등의 오염을 확인 것들이다. 상술 한 바와 같이 양호한 무균 기술 상식이 이용되는 경우 오염은, 성공적으로 회피 할 수있다. 이 지시 단계에서 오염이 프로토콜에서 그렇게하는 연산자 체크 상당히 오염의 위험을 줄일 수 있는지에 관계없이, 줄기 세포 배양 형식에 필수적이다. 적절한 세포 외 기질 겔 애플리케이션 초이다 ESS이 프로토콜의 전반적인 성공에 ential 단계. 적절 96- 웰 플레이트를 코팅없이 줄기 세포는 성장하지 않는다. 한 가지 일반적인 문제는 불완전한 잘 코팅입니다. 경험 기포, 정전 인력과 모세관 작용이 완료된 웰 코팅을 방해 것을 보여 주었다. 사전 습윤 단계 (1.6) 상당히 잘 바닥 코팅을 개선하기 위해 개발되었으며 건너 뛸 수 없습니다. 세포 외 기질 겔 코팅이 균일하게 잘 저면과 측면에 걸쳐 분산되어인가 될 때 사전 습윤 공정되도록 플라스틱 96- 웰 플레이트의 외관상의 소수성을 감소시킬 것으로 보인다. 또한 부드럽게 한 번, 심지어 세포 외 매트릭스 겔 용액 분배를 보장하기 위해 코팅 된 깨끗한 손에 96 웰 플레이트를 누릅니다하는 것이 좋습니다. 해리 파라미터는 또한 최적화하는데 중요하다. 효소 또는 EDTA 기반 해리 시약과 확장 배양은 또는 통과하는 동안 목표되지 않을 수 있습니다 하나의 세포에서 발생합니다. 따라서, 작업자해리 시간, 분쇄 력 및 세척 반복이 식민지의 형태와 건강에 영향을 미칠 그에 따라 조정하는 방법에 특별한주의를 기울여야한다. 여기에 설명 된 기술에 한계를 이해는 성공적인 운영에 매우 중요하다. 다른 세포 배양 환경에서와 같이, 96 웰 플레이트의 사용은 비교적 높은 오염의 위험을 제공한다. 상술 한 바와 같이, 기술자는 먹이 계대 동안 각 플레이트를 처리하고; 예를 들면, 뚜껑을 개방 로봇 침대 플레이트 퍼팅 한 현미경 플레이트를 검사 할 때. 단계 1.5 이후에 언급 한 바와 같이 따라서, 이러한 침대에 경사 가열 블록 또는 수직 핀으로 어떤 접시 뚜껑의 내부를 만지거나 잠재적으로 오염 된 표면에이 부분을 노출하지 필수적입니다. 프로토콜 개발 과정에서이 제한을 발견하고 불임을 유지하기 위해 판 뚜껑을 보유하는 랙을 개발하는 원동력이었다. 마찬가지로, 골 저수지, 피펫 팁과 오그들은 환경에 열고 기술자에 의해 처리하기 때문에 액체 처리 로봇 침대에 THER 공급 장치는 오염의 잠재적 인 소스입니다. 따라서, 좋은 무균 기술은 노출 된 문화 자료 또는 열려있는 액체를 통해 움직임을 줄이는 등의 적용되어야한다. 또 다른 제한은 프로토콜이 시각적&gt; 100 96 웰 플레이트의 각 웰에 의하면, 업 스케일링 될 때 성가신 점이다. 이것은 의심 우물을 식별하기 위해, 시각적으로 같은 혼탁 한 매체와 같은 오염의 징후에 대한 전체 판을 검사하여 처리 할 수​​ 있습니다. 미래의 스케일 업을 위해, 자동화 된 현미경과 세포 성장 및 오염의 가능성 지표의 사용은 인용한다. 요약하면, 여기에서 설명하는 높은 처리량 96 웰 기반 플랫폼 접시 형식으로 줄기 세포 배양 및 생산을위한 재현성, 높은 충실도 방법을 제공합니다. 이 방법은 세포 배양 동안을 막기 위해 최선을 다하고 필요한 경험, 장비 필요하고 노동 시간을 단축전통적인 접착 배양의 장점을 유지.

6 - 인간 유도 된 다 능성 줄기 세포 (iPSCs)의 사용은 시험 화합물, 재생 의학 및 질병 모델 (2) 2007 년 1 그들의 유도 이후 크게 증가하고있다. 이 수요는 비교할 수없는 양에서 체세포로 분화 할 수있는 만능 세포의 많은 수를 산출하는 IPSC의 능력에서 비롯됩니다. 분화 관한 기술들이 향상됨 7 - 그래서 고품질 iPSCs의 대량 생산에 대한 요구를 수행, 14 - 10과 인간 세포 또는 조직 모델링 및 세포 치료의 개발 (11)을 증가시킨다. 18 - 그것은 널리 다른 질병들, 심근 경색 또는 B 세포 기능 교체 IPSC 수십억 수억을 필요로 체세포 (15)을 유도 것을 인용한다. 약물 발견 및 정화 또한, 점점 더 복잡한 3D 조직 모델링herapy 세포 9,13,19 많은 수를 요구할 것이다. 모든 예에서, 정의 균일하고 재현성 iPSCs이 가능하고 생산 간단합니다. 조직 공학 및 이식 세포 및 생물 약제학 유래 줄기 세포를 제조하기 위해서는, 비용 효율적인 셀 제조 기술이 필수적이다. 이러한 기술이 성공적으로 대규모 비 IPSC 진핵 계 생산 배포 부분적 때문에 28 - 마이크로 캐리어 기판 (26)의 이용으로 25 또는 현탁액 - iPSCs의 미늘 생산 현탁 배양 물 (20) 상에 초점을 맞추었다. 몇몇 그룹은 만능 줄기 세포 20,21,23,24,29를 얻을 현탁 배양 시스템을 증명하고있다. 그러나 이러한 접근 방법은 조직 공학을 운전 LABORAT을하고, 새로운 차별화 프로그램을 개발 연구자들에게 쉽게 사용할 수없는 고가의 복잡한 시스템을 활용ORY 규모의 연구. 또한, 서스펜션과 미세 전달체 IPSC 문화가 응집을 조절하는 적응과 기술 또는의 Rho 키나제 억제제의 연속 사용으로 기존의 부착 IPSC 문화에서 찾을 수없는 화학 물질, 소포제 및 여과가 필요합니다. 세포에 물리적 스트레스는 기계적 교반에 의해뿐만 아니라 미세 전달체 충돌시 도입, 현탁 배양에 더 유행이다. 이러한 문제는 세포주는 현탁 배양 될 수 줄기 새롭게 생성되는 예측과 속도를 제한한다. 다른 사람들은 판 배양 기술 (30, 31)을 모방 로봇 플레이트 처리 시스템을 개발하지만, 이러한 플랫폼은 장비와 줄기 세포 배양과 관련된 근본적인 문제뿐만 아니라 작동하는 전문 지식에 대한 상당한 투자를 요구한다. 다음 작품은 자 급식, 표준 8 채널 로봇을 이용하는 액체 현상과 확장 성 IPSC 배양 시스템의 실시를 설명핸들러 및 96 웰 플레이트. 이 방법은 실험실 규모 IPSC 문화와 대량 IPSC 생산을 해소하기 위해 설계되었다 (예를 들어, 10 (7) - 기술자 당 일주일에 1.5 × 10 9 세포) 새로운 IPSC 기술 개발을들을 수 있도록 쉽게 큰 하드웨어 또는 노동 투자없이 생산을 확장합니다. 이 방법은, 설정 비교적 저렴​​없는 줄기 세포 배양, 프로그래밍 또는 엔지니어링 경험이 거의 필요 전용 세포 배양 후드 없이도 작은 설비 풋 프린트를 가지고, 자동화 된 처리량에 매체를 사용하는 표준 세포 배양 용 기재를 이용 전지 생산. 목표는 세포 배양을 막기 위해 새로운 실험실에서 이용 될 수있는 확장 가능한 줄기 세포 배양 할 수있는 시스템을 개발하는 수동 재배 그들의 생각을 개발하거나 줄기 세포를 대량 생산하는 경제적 인 수단을 원하는 사람들에게 장벽을 찾는 사람. 여기에 제시된 플랫폼에 기술자 영향을 제거세포 배양 줄기 일관된 줄기 세포의 생산을 가능하게 공급 통로 및 절차를 정규화한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>96-well; Well volume: 360uL; Cell growth area: 0.32cm2; Individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Trough</td>
			<td>SeahorseBio</td>
			<td>201308-100</td>
			<td>Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167023</td>
			<td>10 racks gilson 96tips D200 tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12500062</td>
			<td>DMEM/F12 powder.&#160; Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor Reduced Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Referred to as, &#34;extracellular matrix gel&#34; in the text.&#160; Matrigel GFR, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5857</td>
			<td>mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 Media</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>AdooQ BioScience</td>
			<td>A11001-50</td>
			<td>Rock inhinitor Y-27632 2HCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>ACCUTASE</td>
			<td>Referred to as, &#34;proteolytic and collagenolytic dissociation reagent&#34; in the text.&#160; Accutase 500 mL sterile cell solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30256FS</td>
			<td>PBS w/o CA MG 500 mL, 6/pk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson PIPETMAX</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>PIPETMAX</td>
			<td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable 96-well plate based ipsc culture and production using a robotic liquid handling system

다 능성 줄기 세포 배양의 지속적인 발전은 재생 의료, 약물 발견 및 안전성 시험에서 이들 세포를 사용하기위한 벤치 맡 사이의 갭을 ​​폐쇄한다. 조직 공학 및 이식 세포 및 생물 약제학 유래 줄기 세포를 제조하기 위해서는, 비용 효율적인 셀 제조 기술이 필수적이다. 만능 시간 경과 하류 애플리케이션 (예, 세포 분화) 세포의 안정적인 성능 유지 대규모 셀 생산에 가장 중요하다. 그러나 그 운영자가 상당한 변동성을 소개뿐만 아니라 스케일 업을하는 엄청나게 비싼 수있는 세포가 수동으로 배양되어 특히 달성하기 어려울 수 있습니다. 최소 기술자 참여 또는 경험을 필요로 액체 핸들링 로봇이 개발 된 멀티 채널 벤치 탑을 이용하여 오퍼레이터 영향 신규 줄기 세포 배양 프로토콜을 높은 처리량, 대규모 줄기 세포의 생산을 가능하게하거나 제거. 와이러한 프로토콜 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)는 직접 냉동 재고에서 공급이없는 조건에서 배양 96 웰 플레이트에서 유지. 때 통로 세포주 원하는 스케일 업 속도에 따라, 운전자는 쉽게 분할을위한 최적의 집단 밀도를 나타낸 일련의 이미지들에 기초하여 결정할 수있다. 그런 다음 필요한 시약은 원심 분리 단계없이 새로운 판에 식민지 분할을 수행 할 준비가되어 있습니다. 통로 (20) (~ 3 개월) 한 후, 두 IPSC 라인은 안정적인 핵형을 유지 줄기 세포 마커를 발현하고, 고효율로 심근 세포로 분화. 이 시스템은 96 웰 플레이트 용으로 설계된 새로운 분화 프로토콜 또는 유전자 조작의 후속 높은 처리량 검사를 수행 할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 애플리케이션에 대해 동일 줄기 세포의 대량 생산 기술 노동 부담을 감소시킬 것이다.

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Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes.

로봇 액체 처리 시스템을 사용하여 확장 가능한 96 웰 IPSC 문화 기반 플레이트 및 생산

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