Name: scalable 96-well plate based ipsc culture and production using a robotic liquid handling system
Uploaded: 2015-05-14T14:00:00
Duration: 8 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System at JoVE.com

Detta arbete har stötts delvis av NIH bidrag, R44 GM087784 och R01 HL109505. Författarna tackar den tekniska och OEM teamet på Gilson, INC för utökad teknisk support.

Vätskehanterings robotsystem, som för följande protokoll var Gilson s pipetmaX, underlättar automatiserad, skalbar stamcellskultur och produktion med bibehållen traditionella vidhäftande odlingsbetingelser i 96-brunnar format. Liksom traditionella 6-brunnar kultur, iPSCs vuxit med detta protokoll som ett monolager av olika kolonier, men i 96-brunnar format. Varje brunn kan vara isogen eller distinkt och endera konfigurationen kan odlas parallellt eftersom roboten kan hålla varje brunn segregerade. Den typiska robot iPSC kultur rutin har två faser: en utfodringsprogram där kulturer matas på ett anpassningsbart schema och en passage program där användaren väljer dissociation metoden och delningsförhållande därigenom styra sådd densitet och skalan. Följande protokoll beskriver hur en ny kultur startas, hur utfodring och passage är genomförda och de kompletterande program som underlättar iPSC kulturen. 1. Förbereda Extracellulär Matrix Gel Coated 96-brunnsplattor <ol><li> Ta bort förpackningen från sex nya, RT 96-brunnsplattor och placera dem på vätskehanteringsrobot säng i positionerna 2, 3, 5, 7, 8, 9 (se figur 1A för säng positioner). </li><li> Placera en pre-kyld, 4 ° C 4 brunnar tråg i sängen position 6. </li><li> Last kolonn 12 av spets kuggstången i sängen läge 1 med pre-kyld, 4 ° C 200 pl pipettspetsar. </li><li> Fyll först (längst till vänster) tråg bra i sängen position 6 med 25 ml 4 ° C DMEM / F12 genom att hälla en portion med steril teknik. Alternativt kan du använda en pipett för att slutföra överföringen. </li><li> Ta bort de 96-brunnar lock och skjut var i den specialdesignade plattan locket håller ställ (PLHR, se figur 1A). Undvik kontaktmed insidan av plåtlock. Anm: Hantering insidan av en platta lock eller stapling av plattlocken där insidan av ett lock berör utsidan av en annan är en utmärkt väg för kontaminering. </li><li> Använda robotstyrning pekplattan genom att trycka på följande rad knappar för att starta väl förvätning process: <ol><li> Tryck på &quot;Kör ett protokoll&quot;. </li><li> Välj &quot;extracellulära matrisgel Prewet&quot; och tryck på nästa. </li><li> Användar beslut: Tryck &quot;testkörning&quot; för att använda steg-för-steg guide för att i förväg testa det valda programmet. Obs: Roboten går inte utan programmet testar protokoll för problem med programvara. Med etablerade protokoll, knacka, &quot;hoppa över steget inställningar&quot; är acceptabelt. </li><li> Tryck &quot;Run Protocol&quot;. </li></ol></li><li> Under förvätning processen (steg 1,6) vidare till steg 1,8. </li><li> Tina på is en 4 mg portion av tillväxtfaktor reducerad extracellulär matrisgel (GFRM) ingår i en 50 mlkoniskt rör lagrades vid -80 ° C. Håll portionen på is tills det ska användas. Obs: GFRM kommer att stelna om de tillåts att komma till RT och kommer inte att vara användbara. </li><li> Resuspendera 4 mg GFRM alikvot i 24 ml 4 ° C DMEM / F12 med en 25 ml glas pipett. Vid överföring av DMEM / F12, paus för 2-3 sekunder för att tillåta pipett svalna innan det blandas GFRM delmängd. </li><li> När förvätning processen (steg 1,6) är klar, fortsätter du till steg 1.11. </li><li> Överför 24 ml av DMEM / F12 GFRM blandningen till fjärde brunn tråget i sängen position 6. </li><li> Använda robotstyrning pekplattan genom att trycka på följande rad knappar för att starta extracellulära matrisgel beläggningsprocess: <ol><li> Tryck på &quot;Kör ett protokoll&quot;. </li><li> Välj &quot;extracellulära matrisgel portion&quot; och tryck på nästa. </li><li> Användar beslut: Tryck &quot;testkörning&quot; för att använda steg-för-steg guide för att i förväg testa det valda programmet. Obs: Roboten går inte men rather programmet testar protokoll för problem med programvara. Med etablerade protokoll, knacka, &quot;hoppa över steget inställningar&quot; är acceptabelt. </li><li> Tryck &quot;Run Protocol&quot;. </li></ol></li><li> När steg 1,12 är klar, byt plåtlock. </li><li> Överför de extracellulära matris gel belagda 96-brunnsplattor till en 37 ° C, 5% CO2, fuktad inkubator och håll där i 24 h vid vilken punkt plattorna kommer att vara redo för användning eller lagras. Anmärkning: Under förmildrande omständigheter, kan de nyligen belagda extracellulära matris gelplattor användas efter 15-30 min av inkubation men O / N till 24 timmars inkubering rekommenderas. </li><li> Upprepa protokoll steg 1,1, 1,3, 1.5-1.6, 1.10, och 1,12-14 tills all DMEM / F12 med GFRM används. </li></ol> 2. Lagring av extracellulär matrix Gel Coated 96-brunnsplattor <ol><li> Avlägsna extracellulära matris gel belagda 96-brunnars plattor från 37 ° C, 5% CO2, fuktad inkubator. </li><li> Tillval: Allow den extracellulära matrisen gel belagda 96-brunnsplattor för att komma till RT innan man går vidare till steg 2,3. Obs! Det här valfria steget kommer att minska kondens bygga upp när plattorna placeras vid 4 ° C. </li><li> Placera plattorna på vätskehanteringsroboten säng i positionerna 2, 3, 5, 7, 8, 9 (se figur 1A för säng positioner). </li><li> Last kolumn 12 av spetsen rack i sängen position 1 med RT 200 l pipettspetsar. </li><li> Placera en fyra tråg reservoar i sängen position 6. </li><li> Fyll väl 4 (längst till höger) av behållaren med RT DMEM / F12. </li><li> Ta bort de 96-brunnar lock och skjut var i PLHR. </li><li> Använda robotstyrning pekplattan genom att trycka på följande kombination av knapparna: <ol><li> Tryck på &quot;Kör ett protokoll&quot;. </li><li> Välj &quot;extracellulära matrisgel portion&quot; och tryck på nästa. </li><li> Användar beslut: Tryck &quot;testkörning&quot; för att använda steg-för-steg guide för att i förväg testa det valda programmet. Obs! Robot går inte utan programmet testar protokoll för problem med programvara. Med etablerade protokoll, knacka, &quot;hoppa över steget inställningar&quot; är acceptabelt. </li><li> Tryck &quot;Run Protocol&quot;. </li></ol></li><li> När du är klar, byt ut plattan lock och ta bort plattorna från maskinbädden. </li><li> Linda runt hela sidan av varje extracellulär matrisgel belagda 96-brunnsplatta (där locket möter plattan) med en en tum gånger sex tum paraffinfilmremsan. Var noga med att sträcka paraffinfilmen för att skapa en lufttät tätning. </li><li> Tillval: Märk plattorna med datum för färdig extracellulärmatrix gelbeläggning, den extracellulära matrisgel lotnummer, användarnamn och annan information. </li><li> Förvara plattorna vid 4 ° C, där de kommer att vara bra att använda i upp till två veckor. Obs: Plattor har med framgång använts bortom tvåveckorsgräns, men det är inte rekommenderat. </li></ol> 3. Utföra en Stem Cell Colony såddtäthetGradient i 96-brunnar format från en Live eller Frozen Kultur: Så här startar eller återställa normal Passage intervall till en stamcellslinje <ol><li> Om börjar med en frusen kultur, gå vidare till steg 3,2. Om börjar med en levande stamcellskultur redan på en tallrik, börjar du med steg 3.5. </li><li> Tina frysta kulturen genom att snurra röret i ett 37 ° C vattenbad tills endast en liten bit av is återstår. </li><li> Valfritt: Späd de upptinade cellerna i 10 ml RT stamcelltillväxtmedia (SCGM), centrifugera i 2 minuter vid 300 xg, aspirera supernatanten medier och resuspendera stamcells pelleten i 7 ml färskt SCGM innehållande 10 pM Y27632. Obs! Detta steg eliminerar överföring av frysmedier. </li><li> Fortsätt till steg 3,6. </li><li> Om börjar med levande, redan guldpläterade stamceller: passage cellerna som vanligt med hjälp av enzymatisk eller icke-enzymatisk dissociation. Försök att skörda totalt 1,5 till 3.000.000 celler; vanligtvis en brunn i en sex-brunnar. Centrifugera de skördade cellerna för2 minuter vid 300 xg, aspirera supernatanten media och resuspendera stamcells pelleten i 7 ml färsk SCGM innehållande 10 iM Y27632. Fortsätt till steg 3,6. </li><li> Se till cellerna, antingen från en frusen eller levande kultur, suspenderas i 7 ml RT SCGM med 10 iM Y27632. </li><li> Last kolumn 12 av spetsen rack i sängen position en med RT 200 l pipettspetsar. </li><li> Placera en fyra tråg reservoar i sängen position 2. </li><li> Placera en ny extracellulära matrisgel belagda 96-brunnsplatta förvärmas till 37 ° C i sängen position 5 och ta bort locket placera den i PLHR. </li><li> Överför 7 ml återsuspenderade celler väl 3 av behållaren med pipett eller steril pour. <ol><li> Använda robotstyrning pekplattan genom att trycka på följande kombination av knapparna: </li><li> Tryck på &quot;Kör ett protokoll&quot;. </li><li> Välj &quot;sådd densitetsgradient&quot; och tryck på nästa. </li><li> Användar beslut: Tryck &quot;testkörning&quot; för att använda steg-för-steg guide för att i förväg testa selected programmet. Obs: Roboten går inte utan programmet testar protokoll för problem med programvara. Med etablerade protokoll, knacka, &quot;hoppa över steget inställningar&quot; är acceptabelt. </li></ol></li><li> Tryck &quot;Run Protocol&quot;. </li><li> När utspädningsserien är avslutad, åter täcka plattan och placera det i en 37 ° C, 5% CO2, fuktad inkubator till nästa utfodring. </li><li> Tillval: Märk plattan med datum, stam information användarnamn, mediatyp och annan relevant information. </li><li> Över de nästa flera dagar, mata 96-brunnar såsom erfordras med användning av protokoll 4 nedan. Obs: En typisk stamcellsplatta kommer att kräva en fullständig media förändring gång per 24 timmar och SCGM inte innehåller Y27632 för utfodring; endast under den initiala ympningen efter passage. Före matning, kontrollera plattan för förorening och kolonitätheten. Se steg 3.16 för mer information om övervakning av kolonitätheten. </li><li> Under de närmaste dagarna, flera kolumner i närheten av cin av plattan (vanligtvis kolumnerna 5-8) kommer att närma sig ett perfekt densitet för passage; att identifiera denna densitet, jämför 96-brunnar till densitetsområdet visas i figur 3B med följande information i åtanke: <ol><li> Passage då utrymmet mellan majoriteten av kolonierna är cirka 25% av angränsande kolonidiametern. Obs: Den logiska grunden för att identifiera tiden för passagen är att en annan cykel av utfodring och tillväxt skulle resultera i kolonier kommer i kontakt, vilket bör undvikas. </li></ol></li><li> För att starta en enhetligt utspädd platta och börja regelbunden kultur, välj en kolumn som är den idealiska densitet och passage. Se protokoll 5 till passagen. </li></ol> 4. Utfodring 96-brunnar stamcell Kolonier Obs: Följande protokoll beskriver matning av en 96-väl stamcellskoloniplattan. Tekniken kan skalas upp för att rymma sex totala plattorna parallellt. <ol><li> Ta bort 96 brunnar stem cellkoloniplattan från 37 ° C, 5% CO 2, fuktad inkubator. </li><li> Kontrollera plattan för kontaminering och celltäthet. För att mata, se till att kolonitätheten är lägre än den ideala passagen tätheten. Se figur 3B för information om densitet. Obs: Förorening kan presentera så grumliga medier och åtföljas av en obehaglig lukt. Små, uppenbarligen icke-IPSC aggregat kan också vara synlig under mikroskopisk undersökning. För att utvärdera celltäthet, se steg 3.16.1 ovan. </li><li> Placera 96-brunnars stamcellskoloniplattan i sängen ställning 3 på en sluttande, 37 ° C ramp. </li><li> Last kolumn 12 av spetsen rack i sängen position 1 med RT 200 l pipettspetsar. </li><li> Placera en 4-väl tråg i sängen position 2. </li><li> Fyll väl 3 av tråget i sängen position 2 med 8 ml färskt, RT SCGM utan Y27632 antingen genom steril hälla eller pipet överföring. </li><li> Ta ut 96-väl stamcellskoloniplatta lock placera den i PLHR. </li><li> Användarobotstyrning pekplattan genom att trycka på följande kombination av knapparna: <ol><li> Tryck på &quot;Kör ett protokoll&quot;. </li><li> Välj &quot;Colony Feed En tavla&quot; och tryck på nästa. </li><li> Användar beslut: på &quot;testkörning&quot; för att använda steg-för-steg guide för att i förväg testa det valda programmet. Observera roboten inte köra utan snarare programvaran testar protokoll för problem med programvara. Med etablerade protokoll, knacka, &quot;hoppa över steget inställningar&quot; är acceptabelt. </li><li> Tryck &quot;Run Protocol&quot;. </li></ol></li><li> När matnings protokollet är fullständig, åter täcka 96-brunnars stamcellskoloniplattan och tillbaka till 37 ° C, 5% CO2, fuktad inkubator tills nästa utfodring eller passagen krävs. Detta krävs vanligtvis efter 24 h. Obs: Det rekommenderas att spela matnings händelsen på plattan locket med datum, mediatyp, användarnamn och annan relevant information. </li></ol> 5. Passaging 96-brunnars Plåt Stem Cell Kolonier <ol><li> Efter flera matningscykler med 96 brunnar stamcellskoloniplattan kommer att vara redo att passage. Detta protokoll beskriver passage av en kolumn till en 96-brunnsplatta, som representerar en 1:12 delningsfaktorn. Användaren kan definiera delningsfaktorn och välja valfritt antal brunnar eller kolumner att dela, inklusive att välja brunnar som inte kan vara intill. </li><li> Jämför 96 brunnar stamcellskoloniplattan täthet figur 3B att avgöra om passagen. Den idealiska passagen tätheten är då utrymmet mellan majoriteten av kolonier är ca 25% av angränsande kolonidiameter eller en efterföljande matning skulle resultera i kolonierna som växer in i varandra. </li><li> Undersök 96 brunnar stamcellskoloniplattan under ett mikroskop för att se till att det inte finns någon förorening. </li><li> Placera 96-brunnars stamcellskoloniplattan i sängen ställning 3 på en sluttande, 37 ° C ramp. </li><li> Ladda kolumnerna 8-12 i spetsen lastning rack i sängen position 1 med RT 200 ul pipetttips. </li><li> Placera en 4-väl tråg i sängen position 2. </li><li> Lämna tråg brunn 1 tom, sätta 8,5 ml SCGM + 10 iM Y27632 väl 2, satte 3,5 ml 30% proteolytiska och kollagenolytisk dissociation reagens (eller EDTA baserat dissociation reagens) i väl 3, satte 4,5 ml PBS i brunn 4. Obs: Alla reagens kan vara vid RT eller 37 ° C. RT proteolytiska och kollagenolytiska dissociation reagens vid 30% späddes med PBS användes för Fett och fibroblast härlett iPSC kultur beskrivs här. </li><li> Placera en ny, förvärmda 37 ° C extracellulär matrisgel belagda 96-brunnsplatta i sängen ställning 5. </li><li> Avlägsna 96-brunnars stamcellskoloniplatta lock, såväl som den nya 96-brunnars lockplattan och placera dem både i PLHR. </li><li> Använda robotstyrning pekplattan genom att trycka på följande kombination av knapparna: <ol><li> Tryck på &quot;Kör ett protokoll&quot;. </li><li> Välj &quot;Colony Split 01:12 Kolumn 1&quot; och tryck på nästa. </li><li> Användar beslut: Tryck &quot;testkörning&quot; för att användasteg-för-steg-guiden för att i förväg testa det valda programmet. Obs: Roboten går inte utan programmet testar protokoll för problem med programvara. Med etablerade protokoll, knacka, &quot;hoppa över steget inställningar&quot; är acceptabelt. </li><li> Tryck &quot;Run Protocol&quot;. </li></ol></li><li> När passagen protokollet är klar, åter täcka båda plattorna. </li><li> Tillval: Märk den nya plattan med nödvändig information (dvs. datum, cellinje, passage nummer, mediatyp, användarnamn etc.). </li><li> Återgå båda plattorna till 37 ° C, 5% CO2, fuktad inkubator tills nästa utfodring eller passagen krävs. Obs: Nästa utfodring är vanligen efter 24 timmar. Obs: Celler och kolonier bör fästa till plattan inom 2-3 timmar att dela upp och ser mycket spritt ut. Detta beror på närvaron av Rho-kinashämmare och cellerna kommer att kondensera och uppvisar den karakteristiska stamcells morfologi (dvs., kullerstens packade kolonier with småcellig volym till stor kärna ratio) efter den första Rho-kinashämmare matning. </li></ol> 6. Skörd 96-brunnar stamceller för produktion Obs: Stem cellkolonier kan skördas för användning när som helst under odling. Vanligtvis inträffar när cellerna är redo att passagen (se protokoll 5). Detta protokoll beskriver hur man skörda elva kolumner från en 96-väl stamcellskoloniplattan. <ol><li> Undersök 96 brunnar stamcellskoloniplattan under ett mikroskop för att se till att det inte finns någon förorening. </li><li> Placera 96-brunnars stamcellskoloniplattan i sängen ställning 3 på en sluttande, 37 ° C ramp. </li><li> Last kolumner 11 och 12 i spetsen lastning rack i sängen position 1 med RT 200 l pipettspetsar. </li><li> Placera en 4-väl tråg i sängen position 2. </li><li> Lämna tråg brunn 1 tom, sätta 8,5 ml SCGM väl 2, satte 3,5 ml 30% proteolytiska och kollagenolytisk dissociation reagens (eller EDTA baserat dissociation reagens) i väl3, satte 4,5 ml PBS i brunn 4. Obs: Alla reagens kan vara vid RT eller 37 ° C. </li><li> Ta ut 96-väl stamcellskoloniplatta lock och plats i PLHR. </li><li> Använda robotstyrning pekplattan genom att trycka på följande kombination av knapparna: <ol><li> Tryck på &quot;Kör ett protokoll&quot;. </li><li> Välj &quot;Colony Harvest Kolumnerna 2-12&quot; och tryck på nästa. </li><li> Användar beslut: Tryck &quot;testkörning&quot; för att använda steg-för-steg guide för att i förväg testa det valda programmet. Obs: Roboten går inte utan programmet testar protokoll för problem med programvara. Med etablerade protokoll, knacka, &quot;hoppa över steget inställningar&quot; är acceptabelt. </li><li> Tryck &quot;Run Protocol&quot;. Obs: När uppsamlingsproceduren är klar, kommer cellerna att vara i tråg och 2 och redo för avhämtning. </li></ol></li></ol>

Författarna MKC, MJG, EEB, NJD och RO är eller var vid tidpunkten för utvecklings anställda InvivoSciences, INC som utformades och utvecklat robot protokoll som beskrivs här. TW är CSO för InvivoSciences INC. SH är anställd hos Gilson INC.

I den aktuella studien har vi utvecklat en metod för robot kultur för iPSC produktion som miniatyriserar och automatiserar utfodring och passage i en 96-brunnar format samtidigt möjliggör en effektiv skala upp. En vätskehanteringsrobot användes för att rutinmässigt mata IPSC kolonier och passage dem med jämna mellanrum genom enzymatisk dissociation. Roboten har också programmerad för att producera extracellulär matrix gel belagda plattor och utföra en sådd densitetsgradient. När fibroblaster och fett härrör iPSCs odlades i detta system under mer än 20 passager, ca 3 månader, var pluripotens hållna, som var stabila karyotyper. Båda cellinjerna var i stånd att differentiering till hjärtmuskelceller. Tillsammans insamling av protokoll som beskrivs här gör det möjligt för användare med mycket liten stamcellskultur erfarenhet eller begränsad tillgång till specialiserad kultur utrustning, att odla stamceller och uppnå hög cellproduktion eller flera linjer hantering med minimal arbete och kostnader. <p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Den robotiserade protokoll beskrivs här ger en metod för ekonomisk skala av iPSC produktion och hantering. En fördel är skalbar stamcellskultur i en etablerad platta baserat format visat här och tidigare 44,47 - 49 för att bibehålla pluripotens. Medan andra format av skalbar stamcellkultur yield pluripotenta celler 20,23,29 denna platta baserad metod kräver väsentligen ingen förändring i odlings format, som anpassning till suspension, användningen av skumdämpande kemikalier eller långvarig användning av Rho-kinashämmare 20. Denna platta baserad metod kan därför snabbt och förutsägbart, rymma nya linjer eftersom odlingsbetingelser är likartade. Eftersom användningen av iPSCs för sjukdoms modellering ökar 4,6,19,50, är nya IPSC linjer kontinuerligt genereras. De metoder som beskrivs här är bäst lämpade att odla nya linjer i medelstora till stora volymer och genomströmning eftersom hinder för övergången till formatet är läg. Detta är också sant för arbetskraft och utrustning som krävs för att upprätthålla kolonierna. Slutligen, eftersom formatet och hantering liknar miljön används för att härleda och validera IPSC linjer, kultur prestanda, såsom riktad differentiering, kommer sannolikt att vara mer förutsägbart. Figur 8 illustrerar en strategi för uppskalning av stamcellsproduktion i 96-brunnsplattor. En platta (cykel 0) används för att robot frö 12 nya plattor, en 12-faldig ökning (cykel 0 till 1). Efter flera dagars utfodring, en av de tolv plattor är passerades att ympa en annan uppsättning av tolv plattor (cykel 1 till cykel 2). Resterande elva plattorna finns nu tillgängliga för andra ändamål och representerar komponenttillverkning i systemet. I den här takten kommer passage av en platta ger 11 plattor varje cykel, eller var 3-4 dagar. Denna metod kan skalas mer när flera plattor är passe såsom visas i övergången från cykel 2 till cykel 3. I cykel 3, två plattor äralltid används för att upprätthålla kolonin och utsäde 24 nya plattor. De återstående 22 plattorna är sedan tillgängliga för användning efter varje passage cykel. Vid varje punkt i underhållscykel kan användaren utsäde fler plattor för att öka produktionen. Ett exempel skulle vara att passagen varje kolumn två tillväxtcykler. Den första passagen omvandlar en platta in i tolv plattor, och var och en av de tolv plattor används för att ympa 144 plattor. I detta fall startar en användare med en platta och efter två passager, eller ungefär 1,5 till 2 veckors odling, har 144 plattor. Exempelvis kan fibroblast och adipösa IPSC linjer bildning cirka 25 till 75.000.000 celler per 96-brunnars platta när redo att passagen. 144 plattor kan därför utgöra ca 4-7 x 10 9 celler. Vad är arbetsbördan för att bära 144 96 brunnar robot? Ett av målen för detta arbete var skalbar stamcellsproduktion som minskad arbetskraft jämfört med traditionell (dvs 6-brunnar) stamcellskultur. Roboten enlomplishes detta genom att minska behovet av att fysiskt hantera varje platta under utfodring och passage. Även om 96-brunnar produktions skalor linjärt som det skulle i traditionella 6-brunnsplattor, den tid en tekniker tillbringar arbetar med plattorna är betydligt mindre med hjälp av robot kultur. Produktionseffektiviteten för robot kultur härleds från denna skillnad (figur 9). Det konstaterades tekniker kunde ta bort en 6-brunnar från inkubatorn, kolla upp det på mikroskopet, sedan aspirera och foder plattan i cirka 3,5 minuter. I jämförelse, tekniker tillbringar ungefär 30 sekunder att ta bort en 96-brunnar från inkubatorn och inspektera den på mikroskopet för densitet och föroreningar innan den placeras på roboten. Med en utökad matnings protokoll liknande det som beskrivits ovan, kan sex 96-brunnars plattor lastas och matas, vilket tar ungefär 21 minuter, eller 3,5 min per platta. Den totala förflutna tiden att föda en platta är jämförbara mellan robotic och manuella metoder, men till hands foder 6 plattor en tekniker krävs för alla 21 minuter medan teknikern spenderar endast 3 min hantering av sex plattor för roboten (30 sek inspektion per platta). Som figur 9 visar den tid en tekniker tillbringar hanterar 144 plattor med hjälp av roboten är ca 1,2 tim i stället för 8 timmar manuellt och roboten kommer aldrig att göra ett misstag hanterar plåtarna eller överföring av vätskor. De 96 brunnar IPSC odlingsmetoder som beskrivs här ger en lätthanterlig plattform för komplexa screeninguppgifter. Eftersom varje brunn är genetiskt identiska och såddes med samma täthet från samma ursprungliga poolen, kan variabler fördelas över plattan och underhålls av roboten med kommersiellt tillgängliga reservoarer att segregera villkor. Detta skulle vara användbart för experiment, såsom stamcellstillväxt medieutvecklingen 34,35,47, substrat eller odlingsbetingelser testning och toxicitetsstudier utnyttjar stamceller51. Eftersom varje stamcellslinje är unik när det gäller optimala koloni storlek och passage krav, kan man använda detta system för att modulera såddtäthet, utfodring frekvens och passage hantering genom att manipulera kolumnerna skördats, den mekaniska agitation under passage och matningsfrekvensen. Iterera genom dessa variabler gör det möjligt för användaren att snabbt hitta en rad förhållanden som är lämpliga för odling av en ny linje eller utveckla nya odlingstekniker. Robot systemet är också förmåga att bibehålla 96 parallella men oberoende stamcellskolonier. När iPSC härrör från somatiska celler eller klonade efter genetisk manipulation, är många parallella kloner screenas för att ge potentiella IPSC linjer. När enskilda celler sås i 96-brunnsplattor, kan detta system foder och passage de 96-brunnsplattor som håller varje koloni segregerade. Detta möjliggör mycket hög genomströmning vid val potentiella kloner och eliminerar svårigheten att fysiskt odling 96 parallella linjer. Denna metod även ettllows skalas upp produktionen av varje klon så att materialet är lätt tillgängliga för parallell analys. Slutligen, föreställer vi oss att integrera dessa odlingstekniker med en robotplatta handel system som levererar plattor till och från inkubatorn möjliggör helautomatisk kultur. Detta kan åstadkommas med mer komplexa robotar som möjliggör större expansion eftersom de grundläggande protokoll som beskrivs här är överföras till andra plattbaserade system. De första kritiska stegen för att ta itu med i protokollen är sådana som förebygger och kontrollerar för förorening som steg 1,5 och 4,2. Föroreningar, som diskuterats ovan, kan framgångsrikt undvikas om god sterilteknik och sunt förnuft används. Det är absolut nödvändigt, oavsett stamcellskultur format, att operatören check för kontaminering och att göra det i detta protokoll på de angivna steg avsevärt kommer att minska risken för kontaminering. Korrekt extracellulära matrisgel ansökan är en andra essrential- steg till den totala framgången för detta protokoll. Utan korrekt belägga 96-brunnsplattor, kommer stamcellerna inte växa. En vanlig fråga är ofullständig och beläggning. Erfarenheten har visat att luftbubblor, elektrostatisk attraktion och kapillärverkan hindra komplett bra beläggning. Den förvätning steg (1,6) har utvecklats för att avsevärt förbättra brunnsbotten beläggning och bör inte hoppas över. Denna förvätning steg visas för att minska den skenbara hydrofobiciteten hos plast 96-brunnsplatta så att när den extracellulära matrisen gelbeläggningen appliceras det är jämnt fördelat över brunnens botten och sidor. Det rekommenderas också att försiktigt trycka på 96-brunnsplattor mot en ren handen en gång belagt att säkerställa jämn extracellulärmatrix gellösning distribution. Dissociation parametrarna är också viktigt att optimera. Förlängd inkubering med enzym eller EDTA baserad dissociation reagens kommer att resultera i enstaka celler som kan eller inte kan vara målet under passagen. Därför operatörenbör ägna särskild uppmärksamhet åt hur dissociation tid, finfördelning kraft och tvätta upprepningar påverkar kolonimorfologi och hälsa och justera därefter. Förstå begränsningar de metoder som beskrivs här är avgörande för framgångsrik verksamhet. Som i alla andra cellkultur inställning, användning av 96-brunnsplattor uppvisar en relativt hög risk för kontaminering. Som beskrivits ovan, är en tekniker att hantera varje platta under utfodring och passager; till exempel, när locket öppnas, sätta plattan på robot sängen, och kontroll av plattan på mikroskopet. Därför, som noterades efter steg 1,5, är det absolut nödvändigt att inte röra vid insidan av varje platta lock eller utsätta denna del till något potentiellt förorenade ytan såsom lutande värmeblock eller vertikala stift på sängen. Under protokoll utveckling denna begränsning upptäcktes och gav impulsen att utveckla ett rack för att hålla plåtlock för att upprätthålla sterilitet. Likaså, tråg reservoarer, pipettspetsar och ovriga varor på vätskehantering robot säng är potentiella föroreningskällor, eftersom de är öppna för miljö och hanteras av tekniker. Därför bör god sterilteknik användas såsom att minska rörelser över exponerade kulturmaterial eller öppna vätskor. En annan begränsning är att när protokollet skalas upp, visuellt kontroll av varje brunn i&gt; 100 96-brunnars plattor är besvärlig. Detta kan hanteras genom visuell inspektion av hela plattan efter tecken på förorening, såsom grumlig medier, för att identifiera misstänkta brunnar. För framtida skala upp, kommer användning av ett automatiserat mikroskop och indikator på celltillväxt och eventuella föroreningar införlivas. Sammanfattningsvis, den hög genomströmning 96-brunnars baserad plattform som beskrivs här erbjuder ett reproducerbart, high fidelity metod för stamcellkultur och produktion i ett plattformat. Denna metod minskar den erfarenhet som krävs, utrustning som krävs och arbetstid ägnas åt stamcells kulturen samtidigtbevarande av fördelarna med traditionella vidhäftande kultur.

Användningen av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) har ökat betydligt sedan sin härledning 2007 1 för förening testning, regenerativ medicin och sjukdom modellering 2-6. Denna efterfrågan kommer från iPSC förmåga att ge ett stort antal pluripotenta celler som kan differentieras i somatiska celler vid en enastående mängd. Som riktade differentiering teknik förbättrar 7 - 10 och utveckling av mänsklig cell eller vävnad modellering och cellterapi ökar från 11 till 14, så gör kravet på massproduktion av hög kvalitet iPSCs. Det är allmänt hänvisas till att bland andra sjukdomar, kommer hjärtinfarkt eller B-cell funktionell ersättning kräver hundratals miljoner till miljarder iPSC härrör somatiska celler 15-18. Dessutom alltmer komplexa 3D vävnad modellering för läkemedelsutveckling och therapy kommer att kräva ett stort antal celler 9,13,19. I alla dessa exempel, definierade, enhetliga och reproducerbara iPSCs måste vara tillgänglig och lätt att producera. För att framställa stamcells härrör biofarmaci och celler för tissue engineering och transplantation, är en kostnadseffektiv cell-tillverkningsteknik viktigt. Scaled produktion av iPSCs har fokuserat på suspensionskultur 20-25 eller suspension med användning av micro substrat 26 - 28 delvis eftersom dessa tekniker framgångsrikt användas för storskalig, icke-iPSC, eukaryot baserad produktion. Flera grupper har visat suspensionskultur system som ger pluripotenta stamceller 20,21,23,24,29. Men dessa metoder använder dyra och komplexa system inte är lätt tillgängliga för forskare utvecklar nya differentieringsprogram, kör vävnadsteknik och göra Laboratory forskning. Dessutom, fjädring och mikrobärarkulturer IPSC kulturer kräver anpassning och tekniker eller kemikalier som inte finns i traditionella anhängare iPSC kultur som kontinuerlig användning av Rho-kinashämmare, skumdämpande medel och filtrering för att reglera aggregering. Fysisk stress till cellerna är vanligare i suspensionskultur, som infördes genom mekanisk omröring samt under mikrobärare kollision. Dessa frågor begränsar förutsägbarheten och hastigheten med vilken nygenererade stamcellslinjer kan odlas i suspension. Andra har utvecklat robotplåthanteringssystem som efterliknar plattodlingstekniker 30,31 men dessa plattformar kräver betydande investeringar för utrustning och expertis för att arbeta vid sidan av de grundläggande utmaningar som är förknippade med stamcellskultur. Följande arbete beskriver utvecklingen och bruket av en skalbar iPSC kultursystem som utnyttjar en fristående, standard 8-kanals robot vätskahandler och 96-brunnsplattor. Denna metod har utformats för att överbrygga laboratorieskala iPSC kultur och stora volymer iPSC produktion (t.ex. 10 7-1,5 x 10 9 celler per vecka tekniker) som gör det möjligt dem att utveckla nya IPSC teknik för att enkelt skala upp produktionen utan stora hårdvara eller arbets investeringar. Denna metod är relativt billigt att installera, kräver lite eller ingen stamcellskultur, programmering eller teknisk erfarenhet, har en liten utrustning fotavtryck utan behov av en särskild cellkultur huva, och använder standard cellodling utrustning för att medelhög till hög genomströmning automatiserad cellproduktion. Syftet var att utveckla ett system som kan skalstamcellskultur som kan användas av laboratorier nya stamcellskultur, de som tycker manuell odling ett hinder för att utveckla sina idéer eller dem som vill ha ett ekonomiskt sätt att producera stora mängder stamceller. Plattformen presenteras här avlägsnar teknikern inflytande påstamcellsodling och normaliserar utfodring och passage förfaranden för att möjliggöra konsekvent stamcellsproduktion.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>96-well plates</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3596</td>
			<td>96-well; Well volume: 360uL; Cell growth area: 0.32cm2; Individually wrapped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seahorse Trough</td>
			<td>SeahorseBio</td>
			<td>201308-100</td>
			<td>Reservoir 4 Clear Part Poly Proplene 73Ml 25/Cs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson Tips</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F167023</td>
			<td>10 racks gilson 96tips D200 tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12500062</td>
			<td>DMEM/F12 powder.&#160; Resuspend in 1 L purified, cell culture grade water and sterile filter.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Growth Factor Reduced Matrigel</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354230</td>
			<td>Referred to as, &#34;extracellular matrix gel&#34; in the text.&#160; Matrigel GFR, 10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mTeSR1</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5857</td>
			<td>mTeSR1 Complete Kit for hES Maintenance.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>E8 Media</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>5940</td>
			<td>TeSR-E8 Kit for hESC/hiPSC Maintenance</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632</td>
			<td>AdooQ BioScience</td>
			<td>A11001-50</td>
			<td>Rock inhinitor Y-27632 2HCI</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Innovative Cell Technologies</td>
			<td>ACCUTASE</td>
			<td>Referred to as, &#34;proteolytic and collagenolytic dissociation reagent&#34; in the text.&#160; Accutase 500 mL sterile cell solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>SH30256FS</td>
			<td>PBS w/o CA MG 500 mL, 6/pk</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gilson PIPETMAX</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>PIPETMAX</td>
			<td>http://www.gilson.com/en/AI/Products/13.290/Default.aspx#.VCGwRBZmYSk</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

scalable 96-well plate based ipsc culture and production using a robotic liquid handling system

Fortsatt avancemang i pluripotenta stamceller kultur överbrygga klyftan mellan bänk och säng för att använda dessa celler inom regenerativ medicin, läkemedelsutveckling och säkerhetstester. För att framställa stamcells härrör biofarmaci och celler för tissue engineering och transplantation, är en kostnadseffektiv cell-tillverkningsteknik viktigt. Underhåll av pluripotens och stabil prestanda av celler i tillämpningar i efterföljande led (t.ex. celldifferentiering) över tid är avgörande för storskalig kroppar. Men det kan vara svårt att uppnå särskilt om cellerna odlas manuellt där operatören kan införa betydande variation samt vara oöverkomligt dyrt att skala upp. För att möjliggöra hög genomströmning, storskalig stamcellsproduktion och ta bort operatörens påverkan roman stamcellsodlingsprotokoll med användning av en bänk-topp flerkanalig vätska hanteringsrobot utvecklades som kräver minimal tekniker inblandning eller erfarenhet. Meddessa protokoll mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) odlades i matarfria betingelser direkt från en fryst stam och bibehölls i 96-brunnsplattor. Beroende på cellinje och önskad skala upp hastigheten kan föraren enkelt bestämma när passage baserad på en serie bilder som visar de optimala kolonitätheten för delning. Sedan de nödvändiga reagenserna är beredda att göra en koloni split till nya plattor utan ett centrifugeringssteg. Efter 20 passager (~ 3 månader), två IPSC linjer bibehålls stabila karyotyper uttryckte stamcellmarkörer, och differentieras till hjärtmuskelceller med hög verkningsgrad. Systemet kan utföra efterföljande high-throughput screening av nya differentierings protokoll eller genmanipulation avsedda för 96-brunnsplattor. Denna teknik kommer att minska arbete och teknisk börda för att producera ett stort antal identiska stamceller för en mängd olika tillämpningar.

Watch this Scientific Journal Video about Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System at JoVE.com

Scalable 96-well Plate Based iPSC Culture and Production Using a Robotic Liquid Handling System

The protocols described allow laboratories to perform scalable, adherent stem cell culture in high throughput with minimal labor, experience and equipment investment cost using a programmable liquid handling robot and 96-well plates. iPSCs passaged more than 20 times on this system maintained pluripotency, normal karyotypes and differentiated into cardiomyocytes.

Skalbar 96-brunnar Baserat iPSC kultur och produktion med hjälp av en Robotic Vätskehantering System

Continued advancement in pluripotent stem cell culture is closing the gap between bench and bedside for using these cells in regenerative medicine, drug ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Alginate Encapsulation of Pluripotent Stem Cells Using a Co-axial Nozzle

Alginat inkapsling av pluripotenta stamceller med hjälp av en Co-axial munstycke

Pluripotent stem cells (PS cells) are the focus of intense research due to their role in regenerative medicine and drug screening.  However, the ...

Method of Studying Palatal Fusion using Static Organ Culture

Metod för att studera Palatal Fusion använder statiska orgel kultur

Cleft lip and palate are among the most common of all birth defects. The secondary palate forms from mesenchymal shelves covered with epithelium that ...

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Functional Cloning Using a Xenopus Oocyte Expression System

Funktionell kloning med hjälp av en<em&gt; Xenopus</em&gt; Oocyte Expression System

Identification of genes responsible for embryonic induction poses a number of challenges; to name a few, secreted molecules of interest may be low in ...

Tracking Cells in GFP-transgenic Zebrafish Using the Photoconvertible PSmOrange System

Spåra celler i GFP-transgen zebrafisk Använda Photoconvertible PSmOrange System

The rapid development of transparent zebrafish embryos (Danio rerio) in combination with fluorescent labelings of cells and tissues allows visualizing ...

Large-Scale Production of Cardiomyocytes from Human Pluripotent Stem Cells Using a Highly Reproducible Small Molecule-Based Differentiation Protocol

Storskalig produktion av Cardiomyocytes från Human pluripotenta stamceller med hjälp av en mycket reproducerbar liten molekyl baserad differentiering protokoll

Maximizing the benefit of human pluripotent stem cells (hPSCs) for research, disease modeling, pharmaceutical and clinical applications requires robust ...

The Production of Pluripotent Stem Cells from Mouse Amniotic Fluid Cells Using a Transposon System

Produktionen av pluripotenta stamceller från mus fostervatten celler med användning av en transposon System

Induced pluripotent stem (iPS) cells are generated from mouse and human somatic cells by forced expression of defined transcription factors using ...

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

En anordning för utförande Cell Migration / Sårläkning i en platta med 96 brunnar

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

Definierade Xeno-fri och Feeder-fri odlingsbetingelser för den Generation av mänskliga iPSC-derived Retinal cellmodeller

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

An In Vitro Model of a Parallel-Plate Perfusion System to Study Bacterial Adherence to Graft Tissues

En In Vitro -modell av ett parallell-plattan Perfusion System att studera bakteriell vidhäftning för att ympa vävnader

Various valved conduits and stent-mounted valves are used for right ventricular outflow tract (RVOT) valve replacement in patients with congenital heart ...

Three-dimensional Angiogenesis Assay System using Co-culture Spheroids Formed by Endothelial Colony Forming Cells and Mesenchymal Stem Cells

Tredimensionellt Angiogeneshämningssystem med hjälp av Samkulturspheroider som bildas av Endotelkolonibildande celler och mesenkymala stamceller

Studies in the field of angiogenesis have been aggressively growing in the last few decades with the recognition that angiogenesis is a hallmark of more ...