Name: method for measuring the activity of deubiquitinating enzymes in cell lines and tissue samples
Uploaded: 2015-05-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples at JoVE.com

نود أن نشكر مختبر لي من جامعة مينيسوتا لتقديم الماوس في العمود الفقري عينات الأنسجة الحبل التي تم استخدامها. وأيد هذا العمل من قبل وزارة الدفاع برنامج سرطان المبيض البحوث (OCRP) OC093424 لMB، من صندوق أبحاث السرطان والجماعة راندي آلة الحلاقة لMB ومينيسوتا سرطان المبيض التحالف (موكا) إلى ميغا بايت. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة.

1. إعداد تحلل العازلة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل السكروز في منزوع الأيونات (DI) الماء لصنع محلول المخزون 2 M. تصفية 2 M حل السكروز باستخدام فراغ مدفوعة 0.22 ميكرون فلوريد البولي فينيل (PVDF) التصفية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل dithiothreitol (DTT) في المياه D...

<ol>
	<li>Ovaa, H., Kessler, B. M., Rol&#233;n, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-+based+ubiquitin-specific+(USP)+profiling+of+virus-infected+and+malignant+human+cells.">Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).</li><li>Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+deubiquitination:+Targeting+of+proteins+for+degradation+by+the+proteasome.">Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome.</a> Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).</li><li>Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+proteolysis+by+human+deubiquitinating+enzymes.">Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes.</a> Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).</li><li>Rol&#233;n, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+Profiling+of+Deubiquitinating+Enzymes+in+Cervical+Carcinoma+Biopsies+and+Cell+Lines.">Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines.</a> Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).</li><li>Borodovsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry-Based+Functional+Proteomics+Reveals+Novel+Members+of+the+Deubiquitinating+Enzyme+Family.">Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family.</a> Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).</li><li>Andersson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+Parkinson&#8217;s-disease-associated+mutations+on+the+deubiquitinating+enzyme+UCH-L1.">The effect of Parkinson&#8217;s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1.</a> J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).</li><li>Poon, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Amyloid+(A&#946;)+oligomers+impair+brain-derived+neurotrophic+factor+retrograde+trafficking+by+down-regulating+ubiquitin+C-terminal+hydrolase+UCH-L1.">&#946;-Amyloid (A&#946;) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1.</a> J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).</li><li>Nijman, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deubiquitinating+enzyme+USP1+regulates+the+Fanconi+anemia+pathway.">The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway.</a> Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).</li><li>Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deubiquitinating+enzyme+USP2a+regulates+the+p53+pathway+by+targeting+Mdm2.">The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2.</a> EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).</li><li>Coughlin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+RA-9+inhibits+proteasome-associated+DUBs+and+ovarian+cancer+in+vitro+and+in+vivo+via+exacerbating+unfolded+protein+responses.">Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses.</a> Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).</li><li>Colla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+Reticulum+Stress+Is+Important+for+the+Manifestations+of+&#945;-Synucleinopathy+In.">Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of &#945;-Synucleinopathy In.</a> Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).</li></ol>

منذ ubiquitination هو النشاط الخلوي الأساسي، وفهم آليات تنظيمية يمكن أن يكون المفتاح لنبش عمليات الأمراض وعلم الأمراض. استخدام HA الموسومة UB المستمدة من الموقع موجه تحقيقات نشطة ذكرت هنا يوفر وسيلة سهلة، ولكن ينطبق إلى حد كبير لدراسة UB بوساطة تدهور البروتين. هذا الأسلوب هو ?...

نظام بتحول-proteasome و(UPS) بمثابة واحد من مسارات التحلل الرئيسية في خلايا الثدييات. ركائز متجهة الى تدهور في proteasome ويتم تمييزها تساهميا مع البوليمرات من بتحول (UB) 1. قبل الركيزة المستهدفة تدخل proteasome وللتدهور، يجب إزالة علامة بولي بتحول. وهناك فئة من الإنزيمات المعروفة باسم deubiquitinating الأنزيمات (يصف) هي المسؤولة عن إزالة وإعادة تدوير جزيئات اليوبيكويتين 2. وقد توقع عليه من الجينوم البشري أن هناك ما يقرب من مائة يصف العمل في الخلية 3. مع هذا العدد الكبير من يصف السيطرة على العمليات الخلوية يو بي بوساطة، ودراسة هذه الإنزيمات يمثل تحديا منذ تقنيات مرنا لا تعطي معلومات عن النشاط والنشاف الغربي يعطي معلومات عن مستويات التعبير فقط. استخدام راصة دموية الإنفلونزا (HA) الموسومة، يو بي المستمدة من الموقع موجه تحقيقات نشطة يسمح لوزارة الدفاع التساهميةification من يصف الوظيفي، وبالتالي يعطي رؤية مباشرة لنشاط هذه الإنزيمات على لطخة غربية 4. تحقيقات لديها مجموعة رد الفعل ثيول-C المحطة التي هي بمثابة الركيزة الانتحار لموقع نشط السيستين بقايا 5. مع هذه التحقيقات، فمن الممكن لدراسة النشاط والتعبير المحتمل للكثير من يصف في إطار كل من الحالات المرضية والفسيولوجية للخلية. قد تورطت التغيرات في النشاط DUB في مجموعة من الحالات المرضية مثل الشلل الرعاش والزهايمر، وفقر الدم والسرطانات المختلفة 10/06. وتوفر هذه التقنية أداة قوية لدراسة المرض. في هذه الورقة، نقدم لك مجموعة من تطبيق هذه التقنية في خلايا هيلا وM17 التي تم هي lysed باستخدام الخرز الزجاجي. بالإضافة إلى ذلك، فإننا الخطوط العريضة لكيفية استخدام هذا الأسلوب في الماوس الحبل الشوكي عينات الأنسجة. المعلومات التي تم الحصول عليها من هذه التقنية يمكن أن تستخدم كنقطة انطلاق لتحديدالأهداف العلاجية فضلا عن وضع نماذج لدراسة الحالات المرضية المختلفة. الأداة المساعدة الحقيقية لهذه التقنية تكمن في قدرتها على تقديم معلومات عن يصف متعددة في فحص واحد.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:615px;" width="615">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PowerGen 125 ( Homogenizer)</td>
			<td style="width:113px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-261-02P</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacuum-driven filters .22&#181;M&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td style="width:119px;">BPV2210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass beads, acid washed &#8804;106&#181;m (~140 U.S. sieve)</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G4649-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:113px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S6-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DL-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trizma hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:113px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:113px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue culture flask 75cm2 w/ filter cup 250 ml 120/ cs</td>
			<td style="width:113px;">Cellstar</td>
			<td style="width:119px;">T-3001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:113px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HI FBS</td>
			<td style="width:113px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Monoclonal Anti-HA antibody produced in mouse</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H9658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag)</td>
			<td style="width:113px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">BML-UW0155-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Laemmli&#39;s SDS-Sample Buffer (4X, reducing)</td>
			<td style="width:113px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-110R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:113px;">ThermoScientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for measuring the activity of deubiquitinating enzymes in cell lines and tissue samples

وقد تم مؤخرا تورط النظام بتحول-proteasome وفي أمراض مختلفة منها أمراض الاعصاب والسرطان. في ضوء ذلك، وتقنيات لدراسة آلية تنظيمية لهذا النظام ضرورية لتوضيح العمليات الخلوية والجزيئية للأمراض المذكورة أعلاه. استخدام راصة دموية المستمدة تحقيقات بتحول والواردة في هذه الورقة بمثابة أداة قيمة لدراسة هذا النظام. تفاصيل هذه الورقة الطريقة التي تمكن المستخدم من إجراء فحوصات التي تعطي رؤية مباشرة من deubiquitinating نشاط انزيم. الانزيمات Deubiquitinating تتحكم تدهور proteasomal وتبادل التماثل الوظيفي في مواقعهم النشطة، والتي تسمح للمستخدم للتحقيق في نشاط الأنزيمات متعددة في فحص واحد. ويتم الحصول لست] من خلال طيف تمزيق الخلايا الميكانيكية وحضنت مع موقع نشط تحقيقات توجيهات. يتم تمييزها الانزيمات وظيفية مع تحقيقات في حين تبقى الأنزيمات الخاملة غير منضم. بواسطة المدىنينغ هذا الاختبار، يحصل المستخدم على معلومات حول كل من النشاط والتعبير المحتمل لعدة إنزيمات deubiquitinating بطريقة سريعة وسهلة. الأسلوب الحالي بشكل ملحوظ أكثر فعالية من استخدام الأجسام المضادة الفردية لتوقع مائة deubiquitinating الإنزيمات في الخلايا البشرية.

وكان حصاد الخلايا M17 وهيلا مثقف باستخدام طريقة تفصيله في (حصاد ​​خلية 3.) بروتوكول والأنسجة الماوس الحبل الشوكي تم الحصول عليها. وضعت / نسيج الحبل الشوكي بيليه الخلية في أنبوب مع تحلل العازلة الموضحة في قسم إعداد كاشف. وهي lysed الكريات الخلايا باستخدام الخرز الزجاجي <stro...

Watch this Scientific Journal Video about Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples at JoVE.com

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples (Video) | JoVE

البروتوكول الحالي تفاصيل طريقة لقياس نشاط الانزيمات وظيفيا deubiquitinating مثلي. تحقيقات متخصصة تعديل تساهميا الانزيم وتسمح للكشف. يحمل هذا الأسلوب القدرة على تحديد أهداف علاجية جديدة.

طريقة لقياس آخر من Deubiquitinating الانزيمات في خطوط الخلايا وعينات الأنسجة

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin (Video) | JoVE

أكتين المشارك الترسيب الفحص ، وبالنسبة للتحليل البروتين ملزمة لF - أكتين

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃŽÂ³H2AX Foci in Tissue Samples (Video) | JoVE

الكميات بؤر γH2AX في عينات الأنسجة

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase (Video) | JoVE

على الفحص لقياس نشاط القولونية محرض يسين Decarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks 

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks (Video) | JoVE

افعل ذلك بنفسك جهاز لاستخراج العينات Cryopreserved سقطت سهوا في صهاريج التخزين المبردة

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization (Video) | JoVE

قياس<em&gt; في المختبر</em&gt; أتباز آخر لالأنزيمية توصيف

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines (Video) | JoVE

مقارنة بين ثلاث طرق مختلفة لتحديد انتشار الخلايا في خطوط خلايا سرطان الثدي

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab (Video) | JoVE

قياس النشاط الأنزيمي اللاكتاز في مختبر التدريس

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples (Video) | JoVE

الهجين قطع: طريقة محسنة باجتزاء لعينات الأنسجة النباتية المتمردة

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis (Video) | JoVE

تشريح السمعية بولا بعد الولادة في الفئران: عزل العظام الأذن الوسطى وتحليل النسيجي

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines

Anaerobic Growth and Maintenance of Mammalian Cell Lines (Video) | JoVE

نمو اللاهوائية وصيانة خطوط خلايا الثدييات

Most mucosal surfaces along with the midpoints in tumors and stem cell niches are geographic areas of the body that are anoxic. Previous studies show that ...