Name: method for measuring the activity of deubiquitinating enzymes in cell lines and tissue samples
Uploaded: 2015-05-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples at JoVE.com

我々は、使用されたマウスの脊髄の組織サンプルを提供するためのミネソタ大学の李研究室に感謝したいと思います。この作品は、MBにMBに、ランディシェーバーがん研究とコミュニティ基金MBにミネソタ卵巣癌アライアンス（MOCA）による国防総省の卵巣癌研究プログラム（OCRP）OC093424によってサポートされていました。資金提供者は、研究デザイン、データ収集と分析、公開することを決定または原稿の準備で何の役割も持っていません。

1.溶解緩衝液の調製<ol><li> 2 Mのストック溶液を作るために、脱イオン（DI）水にスクロースを溶解します。 0.22μmのポリフッ化ビニリデン（PVDF）フィルタを駆動し、真空を用いて、スクロースの2M溶液をフィルタリングします。 </li><li>嫌気条件下で500 mMのストック溶液およびストアを作成するためにDI水にジチオスレイトール（DTT）を溶解します。 100mMのストック溶液を作製するためにDI水?...

<ol>
	<li>Ovaa, H., Kessler, B. M., Rol&#233;n, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-+based+ubiquitin-specific+(USP)+profiling+of+virus-infected+and+malignant+human+cells.">Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).</li><li>Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ubiquitination+and+deubiquitination:+Targeting+of+proteins+for+degradation+by+the+proteasome.">Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome.</a> Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).</li><li>Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+proteolysis+by+human+deubiquitinating+enzymes.">Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes.</a> Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).</li><li>Rol&#233;n, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+Profiling+of+Deubiquitinating+Enzymes+in+Cervical+Carcinoma+Biopsies+and+Cell+Lines.">Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines.</a> Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).</li><li>Borodovsky, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemistry-Based+Functional+Proteomics+Reveals+Novel+Members+of+the+Deubiquitinating+Enzyme+Family.">Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family.</a> Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).</li><li>Andersson, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+Parkinson&#8217;s-disease-associated+mutations+on+the+deubiquitinating+enzyme+UCH-L1.">The effect of Parkinson&#8217;s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1.</a> J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).</li><li>Poon, W. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=&#946;-Amyloid+(A&#946;)+oligomers+impair+brain-derived+neurotrophic+factor+retrograde+trafficking+by+down-regulating+ubiquitin+C-terminal+hydrolase+UCH-L1.">&#946;-Amyloid (A&#946;) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1.</a> J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).</li><li>Nijman, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deubiquitinating+enzyme+USP1+regulates+the+Fanconi+anemia+pathway.">The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway.</a> Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).</li><li>Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+deubiquitinating+enzyme+USP2a+regulates+the+p53+pathway+by+targeting+Mdm2.">The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2.</a> EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).</li><li>Coughlin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+RA-9+inhibits+proteasome-associated+DUBs+and+ovarian+cancer+in+vitro+and+in+vivo+via+exacerbating+unfolded+protein+responses.">Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses.</a> Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).</li><li>Colla, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+Reticulum+Stress+Is+Important+for+the+Manifestations+of+&#945;-Synucleinopathy+In.">Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of &#945;-Synucleinopathy In.</a> Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).</li></ol>

ユビキチン化は、基本的な細胞活動であるので、調節機構を理解することは、疾患や病態のプロセスを発掘するための鍵である可能性があります。 HAの使用は、UB-媒介タンパク質分解を研究するための簡単​​な、しかし非常に適用可能な方法を提供し、ここで報告したUb由来の活性部位特異的プローブをタグ付け。この方法は、個別のDUBのそれぞれの研究よりも速く、安価です。 <p class=...

ユビキチン - プロテアソームシステム（UPS）は、哺乳動物細胞内の主要な分解経路の一つとして機能します。プロテアソームで分解のためにバインドされた基板は、共有結合、ユビキチン（Ubが）1のポリマーとタグ付けされています。標的基質は、分解のためのプロテアソームに入る前に、ポリユビキチンタグを削除する必要があります。脱ユビキチン化酵素として知られる酵素のクラス（のDUB）はユビキチン分子2の除去とリサイクルを担当しています。これは、セル3内の作業約100のDUBがあることがヒトゲノムから予測されています。 UB-媒介細胞プロセスを制御するのDUBのような大規模な数と、これらの酵素を研究するだけで発現レベルに関する情報を提供するmRNA技術が活性およびウェスタンブロッティングの情報を与えないので、課題を提示します。 インフルエンザ赤血球凝集素（HA）の使用は、共有結合を可能にするMOD活性部位指向プローブをUB-由来、タグ付け機能のDUBのification、したがって、ウェスタンブロット4のこれらの酵素の活性の直接可視化を提供します。プローブは、活性部位のシステイン残基5ため自殺基質として作用するC末端のチオール反応性基を有します。これらのプローブによれば、細胞の病理学的および生理学的状態の両方で、多くのDUB活性の潜在的な発現を研究することが可能です。 DUB活性の変化は、パーキンソン病、アルツハイマー病、貧血および様々な癌6-10のような病理学的条件の範囲に関与しています。この技術は、疾患の研究のための強力なツールを提供します。本論文では、ガラスビーズを用いて溶解されているHeLa細胞およびM17細胞におけるこの技術の適用を示します。さらに、我々は、マウスの脊髄組織サンプルでこのメソッドを使用する方法の概要を示します。この技術から得られた情報を識別するための出発点として使用することができ治療標的ならびに異なる疾患状態の研究のためのモデルを確立します。この技術の真の有用性は、単一のアッセイで複数のDUBに関する情報を提供する能力にあります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:615px;" width="615">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">PowerGen 125 ( Homogenizer)</td>
			<td style="width:113px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">14-261-02P</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Vacuum-driven filters .22&#181;M&#160;</td>
			<td style="width:113px;"></td>
			<td style="width:119px;">BPV2210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Glass beads, acid washed &#8804;106&#181;m (~140 U.S. sieve)</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">G4649-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Sucrose</td>
			<td style="width:113px;">Fischer Scientific</td>
			<td style="width:119px;">S6-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DL-Dithiothreitol</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">D0632</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Magnesium Chloride</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Adenosine 5&#39;-triphosphate disodium salt hydrate</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A26209</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trizma hydrochloride&#160;</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td style="width:113px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">11965-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Phosphate Buffered Saline</td>
			<td style="width:113px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Tissue culture flask 75cm2 w/ filter cup 250 ml 120/ cs</td>
			<td style="width:113px;">Cellstar</td>
			<td style="width:119px;">T-3001-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">0.05% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:113px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">25300-054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">HI FBS</td>
			<td style="width:113px;">Life technologies</td>
			<td style="width:119px;">16140-071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Monoclonal Anti-HA antibody produced in mouse</td>
			<td style="width:113px;">Sigma-aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H9658</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ubiquitin vinyl sulfone (HA-tag)</td>
			<td style="width:113px;">Enzo Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">BML-UW0155-0025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Laemmli&#39;s SDS-Sample Buffer (4X, reducing)</td>
			<td style="width:113px;">Boston BioProducts</td>
			<td style="width:119px;">BP-110R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pierce BCA Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:113px;">ThermoScientific</td>
			<td align="right" style="width:119px;">23225</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

method for measuring the activity of deubiquitinating enzymes in cell lines and tissue samples

ユビキチン - プロテアソーム系は、最近、神経変性疾患および癌を含む種々の病態に関与しています。この観点から、このシステムの調節機構を研究するための技術は、上記疾患の細胞および分子プロセスを解明するために不可欠です。本稿で概​​説した赤血球凝集素由来のユビキチンプローブの使用は、このシステムの研究のための貴重なツールとして機能します。本稿では、酵素活性を脱ユビキチン化の直接的な可視化を与えるアッセイを実行することを可能にする方法を詳述します。脱ユビキチン化酵素は、プロテアソーム分解を制御し、ユーザーが1つのアッセイで複数の酵素の活性を調査することができ、それらの活性部位での機能的相同性を共有します。溶解物を、穏やかな機械的な細胞破壊を介して得られた活性部位指向プローブと共にインキュベートします。非アクティブな酵素が結合していないままで機能的酵素は、プローブでタグ付けされています。実行で寧このアッセイは、ユーザが迅速かつ簡単な方法で活動し、複数の脱ユビキチン化酵素の潜在的な発現の両方の情報を取得します。現在の方法は、ヒト細胞における予測百脱ユビキチン化酵素のための個々の抗体を使用するよりも大幅に効率的です。

培養M17およびHeLa細胞は、プロトコル（3細胞収穫）に詳述する方法を用いて回収し、マウスの脊髄組織が得られました。細胞ペレット/脊髄組織は、試薬調製の項に記載の溶解緩衝液を用いて管に入れました。細胞ペレットをホモジナイザー（ 図1B）を用いてホモジナイズしたガラスビーズ（ 図1A）およびマウス脊髄組織サンプルを用いて溶解しました。溶解または均...

Watch this Scientific Journal Video about Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples at JoVE.com

Method for Measuring the Activity of Deubiquitinating Enzymes in Cell Lines and Tissue Samples

現在のプロトコルは、機能的に相同脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法を詳述します。特殊なプローブは、共有結合酵素を変更し、検出を可能にします。この方法は、新たな治療標的を同定する可能性を保持しています。

細胞株および組織試料中の脱ユビキチン化酵素の活性を測定する方法

The ubiquitin-proteasome system has recently been implicated in various pathologies including neurodegenerative diseases and cancer. In light of this, ...

Research

JoVE Journal

Biology

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

アクチン共沈降アッセイ、F -アクチンへの結合タンパク質の解析のための

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

生物学

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of &#947;H2AX Foci in Tissue Samples

組織サンプルのγH2AX病巣の定量

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

An Assay for Measuring the Activity of Escherichia coli Inducible Lysine Decarboxyase

の活性を測定するアッセイ大腸菌誘導性リジンDecarboxyase

Escherichia coli is an enteric bacterium that is capable of growing over a wide range of pH values (pH 5 - 9)1 and, incredibly, is able to survive extreme ...

Do-It-Yourself Device for Recovery of Cryopreserved Samples Accidentally Dropped into Cryogenic Storage Tanks

凍結保存サンプルの回復のための日曜大工のデバイスが誤って低温貯蔵タンクに落とし

Liquid nitrogen is colorless, odorless, extremely cold (-196 &deg;C) liquid kept under pressure. It is commonly used as a cryogenic fluid for long term ...

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

Measuring In Vitro ATPase Activity for Enzymatic Characterization

計測<em&gt;インビトロ</em酵素特性評価のための&gt; ATPase活性

Adenosine triphosphate-hydrolyzing enzymes, or ATPases, play a critical role in a diverse array of cellular functions. These dynamic proteins can generate ...

Comparison of Three Different Methods for Determining Cell Proliferation in Breast Cancer Cell Lines

乳癌細胞株における細胞増殖を決定するための3つの異なる方法の比較

Measuring cell proliferation can be performed by a number of different methods, each with varying levels of sensitivity, reproducibility and compatibility ...

Measuring Lactase Enzymatic Activity in the Teaching Lab

教育実習でラクターゼ酵素活性の測定

Understanding how enzymes work, and relating this to real life examples, is critical to a wide range of undergraduate degrees in the biological and ...

Hybrid-Cut: An Improved Sectioning Method for Recalcitrant Plant Tissue Samples

ハイブリッドカット：手に負えない植物組織試料のための改善されたセクショニング方法

Maintaining plant section integrity is essential for studying detailed anatomical structures at the cellular, tissue, or even organ level. However, some ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

生後マウスにおける聴覚ブラの解剖：中耳の骨の単離および組織学的解析

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

隔離の乳酸脱水素酵素試金-哺乳類細胞における一括 Autophagic 隔離活動を決定するシンプルで信頼性の高い方法

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...