Name: isolation and characterization of satellite cells from rat head branchiomeric muscles
Uploaded: 2015-07-20T14:00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles at JoVE.com

This study was funded by a Mosaic grant (017.009.009) from The Netherlands Organization for Scientific Research (NWO) and a Start grant (S-13-167C) for young investigators from the AO Foundation. Z.Y.R is supported by the National Institutes of Health (grant # AG021566, AG035377, NS090051).

Alle forsøkene beskrevet her ble godkjent av det lokale styret for dyreforsøk fra Radboud University Nijmegen i samsvar med nederlandske lover og forskrifter (RU-desember 2013-205). 1. Ekstracellulær Matrix Gel Spots <ol><li> Utfør følgende trinn én dag før isolering: <ol><li> Tine en delmengde ekstracellulær matriks gel (100 pl) ved 4 ° C i minst 1,5 timer. Fortynn 1:10 i Dulbeccos modifiserte Eagles medium; med 4,500 mg / l glukose, 4 mM L-glutamin, og 110 mg / ml natriumpyruvat (DMEM). Hold den ekstracellulære matriks gel ved 4 ° C til alle tider. Merk: Brå temperaturendringer vil føre til ujevn belegg og krystalldannelse. </li><li> Hold den fortynnede ekstracellulære matriks geloppløsning på is i 15 min. </li><li> Pre-chill en mikropipette 20 ul i 10 min. </li><li> Sett 8-brønners kammerobjektglass i en 100 mm petriskål og overføre fatet på en kald overflate (for eksempel fryseelementer) i 10 minutter.</li><li> Bruk pre-kjølt mikropipette å sette en dråpe av 10 pl ekstracellulære matrise gel i hver brønn. Hold petriskål på den kalde overflaten i minst 7 min (figur 1A). </li><li> Fullstendig å fjerne det gjenværende ekstracellulære matriks-gel (figur 1B), og tørk brønnene ved 37 ° C over natten. </li></ol></li></ol> 2. Dissection av hodet Muskler (masseter, digastric, og Levator Veli Palatini) <ol><li> Før disseksjon, fremstille 50 ml fosfat-bufret saltvann (PBS) supplert med 2% penicillin-streptomycin (P / S). Hold på is. </li><li> Etter avliving av en ung voksen rotte (9 uker) med CO 2 / O 2, halshogge hodet og fjerne huden fra hodet. Overfør hodet til is-kald PBS supplert med 2% P / S i et 50 ml rør. </li><li> Tyggemuskelen (avledet fra det første branchial arch) <ol><li> Plasser hodet med den ene siden opp på en silikonmatte og fest med sprøyte needles (Figur 2A). </li><li> Identifiser parotidkjertelen og ansikts nerve (Figur 2A). Utsett dype fascia dekker kjertelen. Skjær fascia og fjerne kjertelen bruker disseksjon saks. Identifisere ytre øregangen. Spore ansikts nerve fra stylomastoid foramen og forsiktig fjerne time, kinnbens, og bukale greiner med en skalpell blad nr 15. </li><li> Frigjøre overfladisk leder av tyggemuskelen ved å fjerne fascia. Identifisere både overfladiske og dype hoder av tyggemuskelen. Spore den overfladiske hodet til sin tykke sene aponeurosis satt inn i zygomatic ferd med maxilla. </li><li> Separer senen fra sin opprinnelse på zygomatic prosessen med en rett pinsett. Klippe det med en skalpell blad nr 15 eller disseksjon saks og forsiktig liv det (figur 2B). </li><li> Dissekere overfladisk hodet på tygge før innsetting i vinkelen og dårligere halvdel av tHan sideflate av ramus av kjeven med et skalpellblad nr 15 (figur 2C). Nå fjerne muskelen. </li></ol></li><li> Posterior magen av digastric- (avledet fra 2 nd branchial arch) <ol><li> Plasser hodet i liggende stilling på silikon pad og fikse med sprøyte nåler (figur 3A). </li><li> Ta av underhudsfett som ligger over både sublingual og submandibular kjertler. Deretter fjerner den overfladiske fascia og kjertler som bruker disseksjon saks. Utsett digastric- (fremre og bakre buk). </li><li> Hold fremre sene av bakre magen med en rett pinsett, klippe det, og dissekere den nøye før sin opprinnelse i tromme bulla (figur 3B). Gjør det samme på motsatt side. </li></ol></li><li> Levator veli palatini muskel (avledet fra 4. branchial arch) <ol><li> Etter disseksjon av bakre buk digastric-, Lokalisere stylohyoid-, dra den sidelengs, og forsiktig fjerne det (Figur 4A). </li><li> Lokalisere sene av levator veli palatini som setter på tromme bulla (Figur 4A). Dissekere den nøye og klippe det på begge sider. </li><li> Se etter luftrøret og spiserøret som går bak den. Løft spiserøret, og utsett svelg, strupehodet og den bløte ganen. </li><li> Lokalisere området av den bløte ganen der levator veli palatini er satt inn og klippe den løs (4B). Merk: Rett etter disseksjon, fjerne sener og bindevev nøye fra hver muskel under stereomikroskop. Senk alle prøver raskt i etanol 70%, og overføre dem til iskald PBS supplert 2% P / S i en 15 ml tube. </li></ol></li></ol> 3. Isolering av satellitten celler <ol><li> Utfør følgende forberedelsestrinnene for SC isolasjon fra tre grupper av muskler: <ol><li>Forberede 7,5 ml 0,1% pronase i DMEM. Filtrer løsningen gjennom et 0,22 um filter. Pre-varme oppløsningen ved 37 ° C i et vannbad i 10 minutter før isolering. </li><li> Forbered 35 ml av DMEM supplert med 10% hesteserum (HS), og 1% P / S. Også forhånds varm ved 37 ° C i et vannbad. </li><li> Forbered 15 ml kulturmedium som består av DMEM supplert med 20% føtalt bovint serum (FBS), 10% HS, 1% P / S og 1% kyllingembryo ekstrakt (CEE). Pre-varm ved 37 ° C i et vannbad. </li><li> Pre-frakk seks plastpipetter (10 ml) med HS og tørke i minst 10 min før bruk. </li></ol></li><li> I hetten kultur, overføres hver muskel i en brønn i en 6-brønns plate. Ved hjelp av disseksjon saks, klippe muskelen i små biter av ca 2 mm. Vær forsiktig med å hakke vevet for mye. </li><li> Tilsett forsiktig 2,5 ml 0,1% pronase-løsning til hver brønn og inkuber ved 37 ° C i 60 min. Rist platen etter 20, 40, og 60 min. Merk: Den nøyaktige duratioN av inkubasjonen er avhengig av faktorer som alder og belastning av dyrene. </li><li> Overvåk under mikroskopet. Kontroller muskelfragmenter og stoppe den enzymatiske fordøyelse Når fibrene buntene får løsnet utseende (figur 5). </li><li> Legg 2,5 ml DMEM supplert med 10% HS og 1% P / S. Overfør til et 15 ml rør og sentrifuger rørene ved 400 xg i 5 minutter. Kast supernatanten ved dekantering. </li><li> Tilsett 5 ml DMEM supplert med 10% HS og 1% P / S. Pipettere løsningen opp og ned med en 10 ml plast pipette (finmaling) i minst 20 ganger for å homogenisere vevet. </li><li> Sentrifuger rørene ved 200 xg i 4 min. Samle supernatanten og overføre til en 15 ml tube. </li><li> Tilsett 5 ml DMEM supplert med 10% HS og 1% P / S. Pipetten på nytt med en 10 ml plast pipette inntil vevfragmenter passerer lett gjennom pipetten. </li><li> Sentrifuger rørene ved 200 xg i 4 min, og samle supernatanten i et 15 ml rør. </li><li> Putca et cellefilter (40 um) på et 50 ml rør og overføre supernatanten inneholdende de dissosierte cellene på filteret. Vask med 1 ml DMEM for maksimal celle utvinning. </li><li> Sentrifuger rørene ved 1000 xg i 10 min, og supernatanten kastes med en pipette. </li><li> Resuspender pelleten i 300 ul kulturmedium og tell cellene i et hemocytometer. </li></ol> 4. Differensiering av satellitten celler på Ekstracellulær Matrix Gel Spots <ol><li> Fortynn cellesuspensjonen for å oppnå 1,5 x 10 3-celler i 10 pl dyrkingsmedium. </li><li> Fest dekslene av kamrene lysbilder med tape og markere flekker med en svart markør på undersiden av objektet glass. </li><li> Ved hjelp av en mikropipette, sette en dråpe 10 mL cellesuspensjon på ekstracellulære matrise gel spot. Sjekk under mikroskopet om slipp av cellesuspensjonen er plassert riktig på plass. Inkuber i seks timer ved 37 ° C. </li><li> Forsiktigly Tilsett 400 ul dyrkningsmedium (DMEM supplert med 20% FBS, 10% HS, 1% P / S og 1% CEE) og inkuberes i tre dager ved 37 ° C. Merk: På dette punktet, er nylig isolert SC utsatt for massive traumer (enzymatisk fordøye og hard gniing) og de trenger å komme seg. Ikke forstyrre cellene i løpet av de tre første dagene 37. Deretter kan dyrkningsmediet endres avhengig av type eksperiment. Den ekstracellulære matriks gel flekker kan sådd med en høy celletetthet (1,5 til 2,5 x 10 3/20 ul) for differensiering assay. Dyrkningsmedium (DMEM supplert med 20% FBS, 10% HS, 1% P / S og 1% kyllingembryo ekstrakt) kan skiftes ut hver tredje dag. </li><li> Alternativt, hvis ekspansjon og bestått ønskes følg de neste trinnene: <ol><li> Tine en delmengde ekstracellulær matriks gel (500 pl) ved 4 ° C i minst 1,5 timer. Fortynnet 1:10 i DMEM og følger anbefalingene i punkt 1.1.1. </li><li> Pre-chill en 10 ml pipette i 10 minutter ved 4 &amp;# 176; C. </li><li> Overfør tre T75-kolber på en kald overflate (for eksempel fryseelementer) i 10 minutter. </li><li> Bruk pre-kjølt pipette til å sette en ml ekstracellulære matrise gel i hver kolbe. Kontroller at overflaten blir dekket fullstendig. Hold flaskene på den kalde overflaten i minst 7 min (figur 1A). </li><li> Fullstendig å fjerne det gjenværende ekstracellulære matriks-gel med en 10 ml pipette, og tørk brønnene ved 37 ° C i 1 time. </li><li> Etter telling, resuspender nyisolerte SC&#39;er i 10 ml dyrkningsmedium (DMEM supplert med 20% FBS, 10% HS, 1% P / S og 1% kylling embryo ekstrakt) og frø i pre-belagt T75 kolber. </li><li> Etter tre dager endrer medium (og hver tredje dag) til 80% konfluens er nådd. For aging, vaske T75 kolber tre ganger med PBS. Deretter tilsettes 1 ml 0,25% trypsin-løsning og inkuberes i tre minutter ved 37 ° C. Resuspender i 9 ml dyrkningsmedium (DMEM supplert med 20% FBS, 10% HS, 1% P / Sog 1% kyllingembryo ekstrakt) og sentrifuger ved 200 xg i 5 min. Kast supernatanten. Etter telling, suspendere en x 10 6 celler i 1000 mL av kulturmedium og fryse cellene. </li></ol></li></ol>

The authors have no conflicting interests to disclose.

SC&#39;er fra forskjellige branchiomeric hode muskler ble isolert fra en 9 uker gamle Wistar-rotte, og dyrket direkte på ekstracellulær matriks gel flekker uten forutgående ekspansjon og aging. Etter isolering ble cellene tellet og podet på samme celletetthet. For parallell isolering av tre forskjellige muskler, tar denne fremgangsmåte omtrent 4 timer. For å unngå forurensning kultur, er et kritisk trinn rask vasking i alkohol 70% etter disseksjon av musklene. Under SC isolasjon er det viktig å skjære muskelvev i små biter (ca. 2 mm), men unngå for mye hakking, da dette vil resultere i en liten celle utbytte på grunn av celleskade. Dessuten må varigheten av den enzymatiske fordøyelse kontrolleres nøye under mikroskopet for å unngå ytterligere skade. Formålet med fordøyelsen er å dissosiere myofibers. Siden mer enn 90% av de isolerte celler uttrykker Pax7, er ingen ytterligere rensning er nødvendig (figurene 6-8).Dette unngår ekstra rensetrinn i andre metoder som pre-plating på ubestrøket retter 14,37,38, fraksjonering på Percoll® 39,40, eller fluorescent- eller magnetisk celle sortering 41,43. For finfordeling er det viktig å indusere skjær mellom vevfragmenter og åpningen av pipettespissen da dette gjør den mekaniske frigjøring av SCS. Dersom triturering med en 10 ml pipette (innvendig diameter tip: 1 mm) er vanskelig, en 5 ml (indre diameter: 2 mm spiss) kan pipette brukes først. Alternativt kan glass Pasteur pipetter kappes i ønsket diameter og benyttes. Denne metoden er enkel, effektiv og tillater samtidig isolering av SC fra forskjellige muskelprøver. Kulturplatene for SC&#39;er kan også være belagt med gelatin eller kollagen, men våre tidligere studier viser at ekstracellulære matriks gel er langt bedre for vedlikehold av myogenisk potensial enn 38 kollagen. Den ekstracellulære matrise gel flekker avmillimeter størrelse (10 ul / Ø 2 mm eller 20 ul / o 4 mm) tillater studiet av proliferasjon og differensiering av SC&#39;er med et begrenset antall celler. For differensiering analysen omtrent 8 til 20 ganger færre celler er nødvendige i forhold til en 24-brønns plate (Ø 15,6 mm), og 80 til 200 ganger mindre sammenlignet med 35 mm petriskåler (35 mm) 14,38. Siden ekstracellulære matrise gel er dyrt, er denne metoden også mer kostnadseffektiv. I tillegg kan kammers objektglass erstattes av plastdekkglass for å redusere omkostningene ytterligere. For fremstilling av den ekstracellulære matriks gelen ble over natten tørking av kammers objektglass er viktig. Som de ekstracellulære matrise gel flekker er gjennomsiktig, er det nødvendig å markere flekker på undersiden ved hjelp av bakgrunnsbelysning. Kamrene lysbildene er løst i en petriskål for enkel manipulasjon. Videre cellekultur utvidelse ikke er nødvendig, som tilbyr muligheten til å studere SC&#39;er av smalLER muskler eller små muskelprøver. Alternativt, f.eks PCR eller muskel-konstruksjonene hvis flere celler er nødvendig, kan den nylig isolerte SC&#39;er først ekspanderes i T75-kolber som angitt ovenfor. SC&#39;er isolert ved anvendelse av denne protokollen er ikke egnet for ytterligere rensing med flowcytometri umiddelbart etter isolering. Nedbrytning med pronase forårsaker omfattende oppslutning av overflateantigener 14. Hesteserum og føtalt bovint serum som blir benyttet for cellekultur, må først være riktig karakteriseres før isolasjon, som forskjellige partinummer differensielt påvirkes myoblaster proliferasjon og differensiering. I de senere årene, er det en økende interesse i musklene avledet fra branchial buer og hodet mesoderm (f.eks extraocular muskler) 24. Det har blitt tydelig demonstrert at hode og lem muskler har svært forskjellige egenskaper. Tyggemuskelen fra gamle dyr ser ut til å reholde sin evne til reproduksjon i sammenligning med lem muskler 25,26. SC&#39;er fra extraocular musklene har en robust spredning og differensiering kapasitet sammenlignes SC&#39;er fra hode muskler, og viser en større engraftment potensial enn lem muskel SC&#39;er 24. The fiber type fordeling og myosin sammensetning varierer mellom muskelgrupper og også mellom arter. Muskler som stammer fra den første branchial arch hos mennesker inneholde både langsomme og raske fibre (subtyper IIA og IIx), neonatale myosins og myosins typiske for utvikling av hjertemuskelen. I gnagere disse musklene inneholder ca 95% raske fibre myosin IIA og IIB) 44-46. Studier på avian muskler viser at SC&#39;er fra ulike muskelfibertyper varierer i differensiering kapasitet. SC&#39;er fra raske fibre bare differensiere til raske muskelfibre, mens SC&#39;er fra langsomme fibre kan differensiere i begge fibertyper 47. I tillegg er den prosentandel av SC&#39;er i fast muskelFibrene er lavere enn i langsomme muskelfibrene 48,49. Dette indikerer at fibertypen fordelingen må tas i betraktning for studier av muskler i kraniofaciale området. I likhet med ganespalte muskler, LVP hos gnagere inneholder nesten utelukkende raske fibre 50. Av den grunn SC&#39;er fra LVP er egnet for pre-kliniske studier innen ganespalte. Denne protokollen gir nye muligheter for å studere SC&#39;er avledet fra branchiomeric hode muskler eller andre mindre muskler eller mindre muskler prøver. Dette vil lette utviklingen av nye behandlingsformer for å bedre regenerering av muskler i kjeveområdet i forhold som ganespalte, men også i andre forhold som påvirker mindre muskler.

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52802">Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles</a>. The fourth figure was updated to explain the isolation of the LVP better.

Erratum: Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Om 1: 500 til 1: 1000 nyfødte utviser en kløft som involverer leppe og / eller ganespalte (CLP); dermed er dette den vanligste medfødte misdannelser hos mennesker en. Musklene i den bløte ganen er kritiske for driften av den bløte ganen under tale, svelge, og suger. Hvis en kløft av den myke ganen er til stede, er disse musklene unormalt innsatt i den bakre enden av palatinal benet. Den myke ganen beveger seg opp og ned i løpet av tale, hindrer luft å slippe gjennom nesen. Barn med en kløft i gane har ikke denne kontrollfunksjon som resulterer i et fenomen som er kjent som velopharyngeal dysfunksjon 2,3. Selv om behandlingsprotokoller er variable, tar kirurgisk reparasjon av den bløte ganen sted i tidlig barndom (6-36 måneders alder) 4. De unormalt innsatte musklene i den bløte ganen kan korrigeres kirurgisk 5-7, men vedvarer velopharyngeal dysfunksjon hos 7% til 30%av pasientene 2,3,8-10. Evnen til skjelettmuskel for å regenerere ved virkningen av satellittceller (SCS) er vel etablert 11,12. Ved muskelskader, er SC&#39;er aktivert og migrere til skadestedet. De deretter spre seg, skille, og smelte til å danne nye myofibers eller reparere skadet seg 13. Stillestående SC&#39;er uttrykke transkripsjonsfaktor Pax7 14,15, mens deres avkom, prolifererende myoblaster, i tillegg uttrykke myogenisk fastsettelse faktor 1 (myod) 16. Skille myoblaster begynne å uttrykke myogenin (MyoG) 17. Den terminale differensiering av myoblaster er preget av dannelsen av myofibers, og ekspresjonen av muskel-spesifikke proteiner som myosin tung kjede (MyHC) 16,18. Nylig har flere strategier blitt brukt i regenerativ medisin for å forbedre muskel regenerering av lem muskler 19-23. Spesifikke studier påbranchiomeric hode muskler er også viktig fordi det ble nylig demonstrert at de skiller seg fra andre muskler i flere aspekter 24. I motsetning til lem muskler, har det blitt foreslått at branchiomeric hode muskler inneholder mindre SC&#39;er 25, regenerere langsommere, og mer fibrøst bindevev er dannet etter skade 26 I tillegg prolifererende SC&#39;er fra branchiomeric hode muskler uttrykker også andre transkripsjonsfaktorer. For eksempel er Tcf21, en ​​transkripsjonsfaktor for craniofacial muskeldannelse sterkt uttrykt i regenererende hode muskler, men neppe i regenererende lem muskler 25. Musklene i den bløte ganen av CLP pasienter er vanligvis mindre og mindre godt organisert i forhold til normal palatal muskler 27,28. Langsomme og raske fibre er begge til stede i den bløte ganen muskler, men de langsomme fibrene er mer rikelig. I motsetning til dette, hare muskler inneholder en høyere andel av raske fibre og også en redusert kapillær tilførselsammenlignet med vanlige myke ganen muskler 29-31. Raske fibre er mer utsatt for sammentrekning-indusert skade 31-33. Den medfølgende dårlig kapillær forsyningen kan også gi fibrose 34,35. Alle disse aspektene kan bidra til dårlig regenerering av bløte gane muskler etter kirurgisk kløft nedleggelse 36. I lys av dette, er en protokoll for isolering og karakterisering av branchiomeric hode muskel SC&#39;er avgjørende. Dette gir mulighet til å studere SC biologi branchiomeric hode muskler. I tillegg kan nye behandlingsformer basert på tissue engineering utvikles for å fremme muskel regenerasjon etter operasjonen i CLP og andre forhold kompromitterende kraniofaciale området. Generelt kan SC&#39;er oppnås etter dissosiasjon av muskelvev 14. Hakking, enzymatisk fordøyelse, og maling er vanligvis nødvendig for å frigjøre SC&#39;er fra sin nisje. SC&#39;er kan renses ved pre-plating på ubestrøket retter 14,37,38, fractionation på Percoll 39,40, eller fluorescent- eller magnetisk celle sortering 41-43. Her presenterer vi en ny økonomisk og hurtig protokoll for isolering av satellittceller fra branchiomeric hode musklene i unge voksne rotter. Denne protokollen er basert på en tidligere manuskript 14 og spesielt tilpasset for små vevsprøver. Isolering av SC&#39;er fra representative muskler som stammer fra den 1., 2., og 4. branchial buer er beskrevet. Etter isolering, lavt antall satellitt celler dyrkes på ekstracellulære matrise gel flekker av millimeter størrelse for å studere deres differensiering. Denne tilnærmingen unngår behovet for utvidelse og passaging av SC&#39;er.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle 25G 0,5x25m</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>300400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BC154R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps straight</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BD330R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel Blade No.15</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol 70%</td>
			<td>Denteck</td>
			<td>2,010,005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanox Slide, 8 Chamber</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>177445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes (100 x 20 mm)</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml sterile conical centrifuge tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml sterile conical centrifuge tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (40 &#956;m)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#181;L FT20</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>774288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, Phenol-Red Free</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356237</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>53702</td>
			<td>10KU</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>3600511</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050088</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Embryo Extract</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2850145</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of satellite cells from rat head branchiomeric muscles

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.

Ved hjelp av denne protokollen, tyggemuskelen (én side) gir 0,8-1 x 10 6 celler, digastric- (posterior magen) gir 1,5-2 x 10 5 celler, og levator Veli palatini muskel avkastning 1-1,5 x 10 5 celler. Celleutbytter avhenger av muskeltypen, stamme, og alder på dyret. For sammenligning mellom de tre muskelgruppene, ble nylig isolerte SC&#39;er sådd med den samme celletetthet (1,5 x 10 3/10 ul). Direkte etter isolering, mer enn 90% av de nyisolerte celler uttrykker Pax7 (figur 6). Dag 4, 7 og 10 kulturer ble farget med antistoffer mot Pax7, myod, MyoG og MyHC immunofarging. Fem vilkårlige felt ble telt per kultur ved hjelp av en 20X objektiv. På dag 4 Pax 7 og Myo D er uttrykt i alle muskelgrupper (figur 6 og 7 og 8), men avkommet av SatCs fra tygge og digastric musklene begynner expressynge myogenin tidligere enn levator veli palatini muskelen (figur 9). På dag 10, er et uttrykk for MyoG sterkt redusert i alle grupper (figur 9). Et par dager etter såing på ekstracellulære matrise gel flekker, prolifererende celler begynner å smelte og danne flerkjerneholdige myotubes som uttrykker myosin tung kjede. Små myotubes er klart synlige på dag 7 (figur 10). På dag 10, kan rykninger i myotubes holdes (Video 1). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig1.jpg" /> Figur 1:. Ekstracellulære matriks gel flekker i et kammer lysbilde (A) For enkel manipulasjon, plasser åtte-brønns kammer lysbilde i en 100 mm petriskål. Pipette 10 mL ekstracellulære matrise gel i hvert kammer og sette den på en kald overflate (7 min). (B) Chamber lysbilde etter det overskytende ekstracellulære matrise gel er fjernet. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig2.jpg" /> Figur 2:. Disseksjon av tyggemuskelen (A) Leder av dyret i en sidevisning. Ear (E), parotidkjertelen (P) og ansikts nerve (VII). (B) tendinous aponeurosis (Te) av overfladiske hodet på tyggemuskelen (Ms) og tidsmessige muskel (T). Separer senen fra sin innsetting med en tang. (C) dissekere muskelen forsiktig opp til sitt innsetting på ramus av kjeven. E: øre, P: parotidkjertelen, VII: ansikts nerve, T: Temporal muskel, Ms: overfladisk leder av tyggemuskelen, Te: sene, Mp: deep leder av tyggemuskelen. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig3.jpg" /> Figur 3: Dissection av bakre buk digastric- (.A) Leder av dyret i liggende stilling. Lokalisere submandibularis (SG), tyggemuskelen (M), ansikts nerve (VII) og sternocleidomastoideus (SCM). Fjern submandibularis. (B) Lokaliser den digastric- anterior (AD) og posterior magen (PD). Med rett pinsett, ta anterior sene av bakre buk, klippe det og dissekere den nøye før sin opprinnelse i tromme bulla (ty). E: øre, Sg: submandibularis, VII: ansikts nerve, M: tyggemuskelen, SMC: sternocleidomastoideus, AD: anterior magen digastric-, PD: posterior magen digastric-, Ty: Tromme bulla. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig4.jpg" /> Figur 4:. Disseksjon av levator Veli palatini muskel (A) General view etter disseksjon av digastric- (posterior magen). Stylohyoid- (St) og sene i levatorveli palatini kan lokaliseres. Legg merke til luftrøret (T) og spiserør (Es) som kjører bak. (B) etter løfting av luftrøret og spiserøret svelget (P) blir blottlagt. Innsetting av levator Veli palatini i den bløte ganen er nå synlig. Pilen indikerer dissekert bløte ganen med levator Veli palatini musklene på begge sider. E: øre, St: stylohyoid-, VII: ansikts nerve, M: tyggemuskelen, AD: anterior magen digastric-, PD: posterior magen digastric-, T: luftrør, Es: spiserør, P: svelg, * levator veli palatini muskel . <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig5.jpg" /> Figur 5: Utseende av muskelvev (a) før og (b) etter enzymatisk spaltning med pronase. Legg merke til at muskelbunter synes å løsnes etter enzymatisk oppslutning. Figur 6: Pax 7 immunofarging nyisolerte SCS anvendt på ekstracellulær matriks gel ved slutten av isoleringen (ca. 6 timer etter innledende vev spaltning).. Fem vilkårlig felt ble telt ved bruk av et 10X objektiv med et gjennomsnitt på 210 celler per felt. Omtrent 90% av cellene er positive Pax 7. DAPI: blå, Pax7: rødt. Scale bar, 100 mikrometer. <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" width="700" /> Figur 7:. Pax 7, myod immunofarging Dag 4, 7 og 10 kulturer ble farget med antistoffer mot Pax7 og myod farging. (A - C) og (D - F) Representative photomicrographs av dag 4 og 7 kulturer fra tyggemuskelen. (G og H </strong&gt;) Antallet Pax7 + og myod + kjerner pr mikroskopisk felt ble talt og uttrykt som en prosentandel av det totale antall kjerner (DAPI). DAPI: blå, Pax7: rød, og myod: green. Scales bar, 100 mikrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 8" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" width="700" /> Figur 8:. Fordeling av Pax7 ± / myod ± i kulturer fra mononukleærerte celler i kulturer fra tygge, digastric og levator Veli Palatine muskel (A - C) Dag 4, 7 og 10 kulturer ble farget med antistoffer mot Pax7 og myod farging. Det totale antall celler er basert på for det totale antall kjerner (DAPI). (D) data kvantifisering av Pax7 ± / myod ± cells. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 9" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" width="700" /> Figur 9:. Myogenin immunofarging Dag 4, 7 og 10 kulturer ble farget med antistoffer mot Myogenin. (A - D) Representative photomicrographs av dag 4 og 7 kulturer fra levator veli palatine muskel. (E) Antallet MyoG + kjerner pr mikroskopisk felt ble talt og uttrykt som en prosentandel av det totale antall kjerner (DAPI). (F) data kvantifisering av MyoG + celler. DAPI: blå, Myogenin: green. Scales bar, 100 mikrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figur</a>e. <img alt="Figur 10" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig10.jpg" /> Fig. 10: Myosin tung kjede immunofarging dag 4, 7 og 10 kulturer ble farget med antistoffer mot myosin tung kjede (MyHC). Representative photomicrographs av dag 4, 7 og 10 kulturer fra digastric (DIG) muskler. På dag 7 små myotubes er til stede, mens på dag 10 lange og velorganiserte myotubes er tydelig. Scales bar, 200 mikrometer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig10large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> Video 1:.. Myotube rykninger Eksempler på to representative felt med rykninger myotubes vises for dagen 10 kulturer fra digastric- <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/Video1.mpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se denne videoen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles at JoVE.com

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Denne protokollen beskriver isolering av satellittceller fra branchiomeric hode musklene i en 9 uker gamle rotter. Musklene kommer fra forskjellige branchial buer. Deretter satellitt dyrkes cellene på en flekk belegg av millimeterstørrelse for å studere deres differensiering. Denne tilnærmingen unngår ekspansjon og passaging av satellitten celler.

Isolering og karakterisering av satellitten celler fra Rat Leder Branchiomeric Muskler

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolasjon og Kvantitativ immunocytokjemisk Karakterisering av Primære myogenic celler og fibroblaster fra Menneskelig Skeletal Muscle

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Isolering av Neural Stem / stamceller fra periventricular Region of Adult Rat and Human Spinal Cord

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering og karakterisering av enkeltceller fra sebrafisk embryo

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Isolering og karakterisering av Mesenchymale stromale celler fra human navlestreng og Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Isolering av type I og type II pericytter fra muskelsmuskler

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Isolering og karakterisering av primære rotte ventil interstitielle cellene: en ny modell å studere Aortaklaff forkalkninger

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identifikasjon av Skjelettmuskel satellitt celler av Immunofluorescence med Pax7 og Laminin antistoffer

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

Isolering og karakterisering av Cardiac Mesenchymal Stromal celler fra Endomyocardial Bioptic prøver av Arrhythmogenic kardiomyopati pasienter

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Isolering og karakterisering av menneskelig navlestreng-avledet Mesenchymal stamceller fra premature og Term spedbarn

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro generasjon av Somite derivater fra menneske indusert stamceller Pluripotent

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...