Name: isolation and characterization of satellite cells from rat head branchiomeric muscles
Uploaded: 2015-07-20T14:00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles at JoVE.com

This study was funded by a Mosaic grant (017.009.009) from The Netherlands Organization for Scientific Research (NWO) and a Start grant (S-13-167C) for young investigators from the AO Foundation. Z.Y.R is supported by the National Institutes of Health (grant # AG021566, AG035377, NS090051).

Alla experiment som beskrivs häri har godkänts av den lokala styrelsen för djurförsök från Radboud University Nijmegen i enlighet med holländska lagar och förordningar (RU-dec 2013 till 205). 1. Extracellulär Matrix Gel Ställen <ol><li> Utför följande steg en dag före isolering: <ol><li> Tina en alikvot extracellulär matrisgel (100 | il) vid 4 ° C under minst 1,5 h. Späd 1:10 i Dulbeccos modifierade Eagles medium; med 4500 mg / I glukos, 4 mM L-glutamin, och 110 mg / ml natriumpyruvat (DMEM). Håll den extracellulära matrisen gel vid 4 ° C vid alla tidpunkter. Obs: Plötsliga temperaturförändringar kommer att resultera i ojämn beläggning och kristallbildning. </li><li> Håll den utspädda extracellulär matris gellösningen på is under 15 minuter. </li><li> Pre-chill en 20 pl mikropipett under 10 minuter. </li><li> Put 8-brunnars kammarobjektglas i en 100 mm petriskål och flytta över skålen på en kall yta (t.ex. en kylklamp) under 10 min.</li><li> Använd pre-kylda mikropipett att sätta en droppe av 10 pl extracellulärmatrix gel i varje brunn. Håll petriskål på den kalla ytan i minst ytterligare 7 minuter (Figur 1A). </li><li> Helt ta bort den återstående extracellulära matrisgel (Figur 1B), och torka brunnarna vid 37 ° C över natten. </li></ol></li></ol> 2. Dissektion av Head Muscles (tugg, Digastric och Levator Veli Palatini) <ol><li> Före dissektion, förbereda 50 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kompletterad med 2% penicillin-streptomycin (P / S). Håll på is. </li><li> Efter avlivning av en ung vuxen råtta (9 veckor) med CO2 / O2, halshugga huvudet och ta bort huden från huvudet. Överför huvudet till iskall PBS kompletterat med 2% P / S i ett 50 ml rör. </li><li> Tuggmuskel (som härrör från den 1: a brankiala bågen) <ol><li> Placera huvudet med ena sidan upp på en silikon pad och fixa med injektions needles (Figur 2A). </li><li> Identifiera öronspottkörteln och ansiktsnerven (Figur 2A). Exponera den djupa fascia täcker körteln. Skär fascia och ta bort genomföringen med dissektion sax. Identifiera den yttre hörselgången. Spåra ansiktsnerven från stylomastoid foramen och försiktigt bort tids, zygomatic och buckala grenar med en skalpell blad nr 15. </li><li> Frigör den ytliga chef för tuggmuskel genom att ta bort fascia. Identifiera både ytliga och djupa cheferna för tuggmuskel. Spåra ytliga huvudet tills dess tjocka tendinöst aponeurosis in i zygomatic process av överkäken. </li><li> Separera senan från sitt ursprung på zygomatic process med en rak pincett. Skär det med ett skalpellblad nr 15 eller dissektion sax och försiktigt liv det (Figur 2B). </li><li> Dissekera ytliga chef för tugg tills dess införande i vinkel och sämre halvan av than sidoyta ramus av underkäken med ett skalpellblad nr 15 (figur 2C). Nu, helt ta bort muskeln. </li></ol></li><li> Posterior buk digastric muskeln (härledd från 2: a brankiala bågen) <ol><li> Placera huvudet i ryggläge på silikon pad och fixa med kanyler (Figur 3A). </li><li> Ta bort underhudsfett liggande både sublingual och submandibular körtlar. Ta sedan bort den ytliga fascian och körtlar som använder dissektion sax. Exponera digastric muskeln (främre och bakre mage). </li><li> Håll den främre senan av den bakre magen med en rak pincett, skära, och dissekera den försiktigt tills sitt ursprung i trum bulla (Figur 3B). Gör samma sak på den kontralaterala sidan. </li></ol></li><li> Levator veli palatini muskel (härledd från den 4: e brankiala bågen) <ol><li> Efter dissektion av den bakre magen av digastric muskeln, Lokalisera stylohyoid muskler, dra den i sidled, och försiktigt bort det (Figur 4A). </li><li> Lokalisera senan av levator veli palatini som infogar vid trum bulla (Figur 4A). Dissekera försiktigt och skär den på båda sidor. </li><li> Leta efter luftstrupen och matstrupen som körs bakom den. Lyft matstrupen, och exponera svalget, struphuvudet och mjuka gommen. </li><li> Lokalisera det område av den mjuka gommen där levator Veli palatini sätts in och skär loss (Figur 4B). Obs: Direkt efter dissektion, försiktigt bort senor och bindväv från varje muskel under lupp. Sänk alla prover snabbt i etanol 70%, och överföra dem till iskall PBS kompletterad 2% P / S i ett 15 ml rör. </li></ol></li></ol> 3. Isolering av satellit celler <ol><li> Utför följande framställningsstegen för SC isolering från 3 muskelgrupper: <ol><li>Bered 7,5 ml av 0,1% pronas i DMEM. Filtrera lösningen genom ett 0,22 pm filter. Pre-värma lösningen vid 37 ° C i ett vattenbad under 10 minuter före isolering. </li><li> Bered 35 ml DMEM kompletterat med 10% hästserum (HS) och ett% P / S. Även pre varm vid 37 ° C i ett vattenbad. </li><li> Bered 15 ml odlingsmedium, som består av DMEM kompletterat med 20% fetalt bovint serum (FBS), 10% HS, 1% P / S och 1% kycklingembryo extrakt (CEE). Pre-varm vid 37 ° C i ett vattenbad. </li><li> Pre-coat sex plastpipetter (10 ml) med HS och torra i minst 10 minuter före användning. </li></ol></li><li> I kulturen huv, överföra varje muskel i en brunn i en 6-brunnsplatta. Använda dissektion sax, klippa muskel i små bitar av ca 2 mm. Var noga med att inte finhacka vävnaden för mycket. </li><li> Tillsätt försiktigt 2,5 ml av 0,1% pronas lösning till varje brunn och inkubera vid 37 ° C under 60 minuter. Skaka försiktigt plattan efter 20, 40 och 60 minuter. Obs: Den exakta duration av inkuberingen beror på faktorer som ålder och stam av djuren. </li><li> Övervaka under mikroskop. Kontrollera muskelfragment och stoppa den enzymatiska nedbrytning när fibrerna buntar får en lossade utseende (Figur 5). </li><li> Lägg 2,5 ml DMEM kompletterad med 10% HS och 1% P / S. Överför till en 15 ml rör och centrifugera rören vid 400 xg under 5 minuter. Kasta bort supernatanten genom dekantering. </li><li> Tillsätt 5 ml DMEM kompletterat med 10% HS och 1% P / S. Pipet lösningen upp och ner med en 10 ml plastpipett (rivning) under minst 20 gånger för att homogenisera vävnaden. </li><li> Centrifugera rören vid 200 xg under 4 minuter. Samla upp supernatanten och överför till en 15 ml tub. </li><li> Tillsätt 5 ml DMEM kompletterat med 10% HS och 1% P / S. Pipettera igen med en 10 ml plastpipett tills vävnadsfragment passerar lätt genom pipetten. </li><li> Centrifugera rören vid 200 xg under 4 min och samla supernatanten i en 15 ml tub. </li><li> Put en cell sil (40 um) på en 50 ml rör och överför supernatanten innehållande de dissocierade celler på filtret. Tvätta med 1 ml DMEM för maximal cellåterhämtning. </li><li> Centrifugera rören vid 1000 x g under 10 min och häll bort supernatanten med en pipett. </li><li> Återsuspendera pelleten i 300 | il odlingsmedium och räkna cellerna i en hemocytometer. </li></ol> 4. Differentiering av satellitceller på Extracellulär matrisgel Ställen <ol><li> Späd cellsuspensionen för att erhålla 1,5 x 10 3-celler i 10 | il odlingsmedium. </li><li> Säkra locken av kamrarna glider med tejp och markera fläckarna med en svart markering på undersidan av objektet glas. </li><li> Med hjälp av en mikropipett, placera en droppe av 10 pl cellsuspension på den extracellulära matrisgel plats. Kontrollera under mikroskop huruvida droppe cellsuspensionen har placerats korrekt på plats. Inkubera under sex timmar vid 37 ° C. </li><li> Försiktigly lägga 400 pl odlingsmedium (DMEM kompletterat med 20% FBS, 10% HS, 1% P / S och 1% CEE) och inkubera under tre dagar vid 37 ° C. Notera: Vid denna punkt, är nyligen isolerade SC utsätts för massiv trauma (enzymatisk Digest och hårda rivning) och de måste återhämta sig. Stör inte cellerna under de första tre dagarna 37. Därefter kan odlingsmediet ändras beroende på vilken typ av experiment. Den extracellulära matrisen gel fläckar kan ympas med en hög celltäthet (1,5-2,5 x 10 3/20 il) för differentieringsanalys. Odlingsmedium (DMEM kompletterat med 20% FBS, 10% HS, 1% P / S och 1% kycklingembryo extrakt) kan bytas var tredje dag. </li><li> Alternativt, om expansion och passerar önskas följande steg: <ol><li> Tina en alikvot extracellulär matrisgel (500 | il) vid 4 ° C under minst 1,5 h. Späd 1:10 i DMEM och följa rekommendationerna i punkt 1.1.1. </li><li> Förhands kyla en 10 ml pipett under 10 min vid 4 &amp;# 176; C. </li><li> Överför tre T75-kolvar på en kall yta (t.ex. en kylklamp) under 10 min. </li><li> Använd pre-kylda pipett att sätta 1 ml extracellulära matrisgel i varje kolv. Kontrollera att ytan täcks helt. Håll kolvarna på den kalla ytan i minst ytterligare 7 minuter (Figur 1A). </li><li> Helt ta bort den återstående extracellulära matrisen gel med en 10 ml pipett, och torka brunnarna vid 37 ° C under 1 timme. </li><li> Efter att ha räknat, resuspendera nyisolerade kaster i 10 ml odlingsmedium (DMEM kompletterat med 20% FBS, 10% HS, 1% P / S och 1% kycklingembryo extrakt) och utsäde i förväg belagda T75-kolvar. </li><li> Efter tre dagar, ändra mediet (och var tredje dag) tills 80% konfluens uppnåtts. För passage, tvätta T75-kolvar tre gånger med PBS. Nästa tillsätt 1 ml 0,25% trypsin-lösning och inkubera under tre minuter vid 37 ° C. Resuspendera i 9 ml odlingsmedium (DMEM kompletterat med 20% FBS, 10% HS, 1% P / Soch en% kycklingembryoextrakt) och centrifugera vid 200 xg under 5 minuter. Kasta bort supernatanten. Efter att ha räknat, resuspendera 1 x 10 6 celler av 1000 il odlingsmedium och frysa cellerna. </li></ol></li></ol>

The authors have no conflicting interests to disclose.

SC från olika branchiomeric huvudet muskler isolerades från en 9 veckor gammal Wistar-råtta och odlades direkt på extracellulär matrix gel fläckar utan föregående expansion och passaging. Efter isolering räknades cellerna och såddes vid samma celltäthet. För den parallella isolering av tre olika muskler, tar denna metod ca 4 h. För att undvika kontaminering kultur, är ett kritiskt steg i snabb tvättning i alkohol 70% efter dissektion av musklerna. Under SC isolering är det viktigt att skära muskelvävnaden i små bitar (ca 2 mm) men undvika för mycket mals eftersom detta kommer att resultera i en liten cellutbyte på grund av cellskada. Dessutom måste varaktigheten av den enzymatiska digere kontrolleras noggrant under mikroskop för att undvika ytterligare skador. Syftet med matsmältning är att dissociera myofibers. Eftersom mer än 90% av de isolerade cellerna uttrycker Pax7, behövs ingen ytterligare rening behövs (figurerna 6-8).Detta undviker extra reningssteg i andra metoder såsom pre-plating på obelagda rätter 14,37,38, fraktionering på Percoll 39,40, eller fluorescent- eller magnetisk cellsortering 41,43. För finfördelning är det viktigt att inducera skjuvning mellan vävnadsfragment och öppnandet av pipettspetsen eftersom detta tillåter den mekaniska frikopplingen av kaster. Om finfördelning med en 10 ml pipett (innerdiameter tips: 1 mm) är svårt, en 5 ml (innerdiameter spets: 2 mm) kan pipett användas först. Alternativt kan glas Pasteur pipetter skäras vid önskad diameter och användas. Denna metod är enkel, effektiv och tillåter samtidig isolering av SC från olika muskelprover. Odlingsplattorna för SCS kan också beläggas med gelatin eller kollagen, men våra tidigare studier visar att extracellulär matris gel är mycket bättre för underhåll av den myogena potential än kollagen 38. De extracellulära matris gel fläckar avmillimeterstorlek (10 | j, l / O 2 mm eller 20 | j, l / O 4 mm) möjliggör studiet av proliferation och differentiering av SCS med begränsade mängder celler. För differentiering analysen omkring 8 till 20 gånger färre celler erfordras jämfört med en 24-brunnsplatta (Ø 15,6 mm), och ca 80 till 200 gånger färre jämfört med 35 mm Petri-skålar (ø 35 mm) 14,38. Eftersom extracellulär matrisgel är dyrt, är denna metod också mer kostnadseffektiva. Dessutom kan de kammare diabilder ersättas av plasttäckglas för att ytterligare minska kostnaderna. För framställning av den extracellulära matrisen gelén fläckar torkning över natten av kammarobjektglasen är viktigt. Eftersom den extracellulära matrisen gel fläckar är transparenta, är det nödvändigt att märka de fläckar vid bottensidan med hjälp av bakgrundsbelysning. Kamrarna glasen fixeras i en petriskål för enkel hantering. Ytterligare expansion cellodling är inte nödvändigt, vilket ger möjlighet att studera kaster av smalLer muskler eller små muskelprover. Alternativt, t.ex. PCR eller muskel konstruktioner om fler celler behövs, kan de nyisolerade kaster först utökas i T75-kolvar som anges ovan. SC isoleras med hjälp av detta protokoll är inte lämpliga för ytterligare rening med flödescytometri omedelbart efter isolering. Uppslutningen med pronas orsakar omfattande nedbrytning av ytan antigener 14. Hästserum och fetalt bovinserum som används för cellodling måste först vara ordentligt karakteriseras före isolering, såsom olika partinummer differentiellt påverkas myoblaster proliferation och differentiering. Under de senaste åren, finns det ett växande intresse för musklerna som härrör från brankiala valv och huvudet mesoderm (t.ex. de extraokulära muskler) 24. Det har tydligt visat att huvud och lem muskler har mycket olika egenskaper. Tuggmuskel från gamla djur tycks återTain deras förnyelseförmåga i jämförelse med lem muskler 25,26. SC från extraokulära muskler har en robust tillväxt och differentiering kapacitet jämförbar med kaster från huvudet muskler, och visar en större inympning potential än lem muskel SCS 24. Fördelningen och myosin fibertyp sammansättning varierar mellan muskelgrupper och även mellan olika arter. Muskler som härrör från den första brankiala bågen hos människa innehåller både långsamma och snabba fibrer (subtyper IIA och IIx), neonatal myosiner och myosiner typiska för att utveckla hjärtmuskeln. Hos gnagare dessa muskler innehåller ca 95% snabba fibrer myosin IIA och IIb) 44-46. Studier på fågel muskler visar att kaster från olika muskelfibertyper varierar i differentieringskapacitet. SC från snabba fibrer bara differentiera till snabba muskelfibrer, medan kaster från långsamma fibrer kan differentiera till både fibertyper 47. Dessutom har andelen SC i snabb muskelfibrer är lägre än i långsam muskelfibrerna 48,49. Detta tyder på att fördelningen fibertypen måste tas hänsyn till studier på muskler i kraniofacial området. I likhet med gomspalt muskler, det bilproduktionen i gnagare innehåller nästan uteslutande snabba fibrer 50. Av den anledningen, kaster från LVP är lämpliga för prekliniska studier inom gomspalt. Detta protokoll ger nya möjligheter att studera kaster härrör från branchiomeric huvudet muskler eller andra mindre muskler eller mindre muskler prover. Detta kommer att underlätta utvecklingen av nya behandlingsmetoder för att förbättra regenerering av muskler i maxillofacial område under förhållanden som gomspalt, utan även i andra förhållanden som påverkar mindre muskler.

An erratum was issue for <a href="http://www.jove.com/video/52802">Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles</a>. The fourth figure was updated to explain the isolation of the LVP better.

Erratum: Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Om 1: 500 till 1: 1000 nyfödda uppvisar en klyfta omfattar läppen och / eller gomspalt (CLP); varför detta är den vanligaste medfödda missbildningar hos människor 1. Musklerna i mjuka gommen är kritiska för driften av den mjuka gommen under tal, svälja och suga. Om en kluven av den mjuka gommen är närvarande, är dessa muskler onormalt insatt i den bakre änden av den palatala benet. Den mjuka gommen rör sig upp och ned under tal, vilket förhindrar luft att strömma ut genom näsan. Barn med en klyfta i gommen har inte denna kontrollfunktion som resulterar i ett fenomen som kallas velopharyngeal dysfunktion 2,3. Även om behandlingsprotokoll är rörlig, tar kirurgisk reparation av mjuka gommen plats i den tidiga barndomen (6-36 månader) 4. De onormalt insatta musklerna i mjuka gommen kan kirurgiskt korrigeras 5-7, dock kvarstår velopharyngeal dysfunktion hos 7% till 30%av patienterna 2,3,8-10. Förmågan hos skelettmuskel att regenerera genom verkan av satellit celler (SCS) är väl etablerad 11,12. Vid muskelskada är SCS aktiveras och migrera till platsen för skadan. De sedan föröka sig, differentiera och smälta för att bilda nya myofibers eller reparera skadade de 13. Inaktiva SCS uttrycker transkriptionsfaktor Pax7 14,15, medan deras avkomma, de förökar myoblasts dessutom uttrycka myogenic bestämningsfaktor 1 (MyoD) 16. Skilja myoblaster börjar uttrycka myogenin (MyoG) 17. Den terminala differentieringen av myoblaster markeras genom bildning av myofibers, och uttrycket av muskelspecifika proteiner, såsom myosin tung kedja (MyHC) 16,18. På senare tid har flera strategier använts i regenerativ medicin för att förbättra muskelregenerering av lem muskler 19-23. Specifika studierbranchiomeric huvudet muskler är också viktigt eftersom det var nyligen visat att de skiljer sig från andra muskler i flera avseenden 24. I motsats till lem muskler, har det föreslagits att branchiomeric huvudet muskler innehåller färre SCS 25, regenererar långsammare, och mer fibrös bindväv bildas efter skada 26 Dessutom prolifererande SC från branchiomeric huvudet muskler också uttrycka andra transkriptionsfaktorer. Till exempel är Tcf21, en ​​transkriptionsfaktor för kraniofaciala muskelbildning uttrycks starkt i regenererande huvudet muskler men knappast i regenere lem muskler 25. Musklerna i mjuka gommen av CLP patienter är oftast mindre och mindre välorganiserade jämfört med normala palatinala muskler 27,28. Långsamma och snabba fibrer båda är närvarande i den mjuka gommen muskler men de långsamma fibrerna är mer riklig. Däremot kluven muskler innehålla en högre andel snabba fibrer och även en minskad kapillär tillförseljämfört med normala mjuka gommen muskler 29-31. Snabba fibrer är mer benägna att kontraktion-inducerade skador 31-33. Den medföljande dålig kapillär utbudet kan också främja fibros 34,35. Alla dessa aspekter kan bidra till de fattiga förnyelse av mjuka gommen muskler efter kirurgisk kluven stängning 36. Mot bakgrund av detta är av avgörande betydelse ett protokoll för isolering och karaktärisering av branchiomeric huvudet muskler kaster. Detta ger möjlighet att studera SC biologi branchiomeric huvudet muskler. Dessutom kan nya behandlingsmetoder baserade på vävnadsteknik utvecklas för att främja muskel återhämtning efter kirurgi i CLP och andra villkor komprometterande den kraniofaciala området. I allmänhet kan SCS erhållas efter dissociation av muskelvävnad 14. Malning, enzymatisk uppslutning, och rivning i allmänhet krävs för att frigöra kaster från sin nisch. SC kan renas genom pre-plating på obelagda rätter 14,37,38, fractionation på Percoll 39,40, eller fluorescent- eller magnetisk cellsortering 41-43. Här presenterar vi en ny ekonomisk och snabb protokoll för isolering av satellitceller från branchiomeric huvudet musklerna i unga vuxna råttor. Detta protokoll är baserad på en tidigare manuskript 14 och speciellt anpassad för små vävnadsprover. Isoleringen av kaster från representativa muskler härrör från den 1: a, 2: a och 4: e brankiala valv beskrivs. Efter isolering, lågt antal satellitceller odlas på extracellulära matris gel fläckar av millimeterstorlek för att studera deras differentiering. Detta tillvägagångssätt undviker kravet på expansion och passage av kaster.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hypodermic Needle 25G 0,5x25m</td>
			<td>BD Microlance</td>
			<td>300400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting scissors</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BC154R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro forceps straight</td>
			<td>Braun</td>
			<td>BD330R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Scalpel Blade No.15</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0205</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alcohol 70%</td>
			<td>Denteck</td>
			<td>2,010,005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Permanox Slide, 8 Chamber</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>177445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well cell culture plate</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>657160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Dishes (100 x 20 mm)</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>664160</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 ml sterile conical centrifuge tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352097</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml sterile conical centrifuge tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer (40 &#956;m)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL serological pipette</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>607180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20&#181;L FT20</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>774288</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matrigel, Phenol-Red Free</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>356237</td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Calbiochem</td>
			<td>53702</td>
			<td>10KU</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium, high glucose, GlutaMAX Supplement, pyruvate&#160;</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10569-010</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum&#160;&#160;</td>
			<td>Fisher Scientific&#160;</td>
			<td>3600511</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>26050088</td>
			<td>500 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140-122</td>
			<td>100 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chicken Embryo Extract</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>2850145</td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and characterization of satellite cells from rat head branchiomeric muscles

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent problems in speech, swallowing, and sucking. In vitro culture systems that allow the study of satellite cells (myogenic stem cells) from head muscles are crucial to develop new therapies based on tissue engineering to promote muscle regeneration after surgery. These systems will offer new perspectives for the treatment of cleft palate patients. A protocol for the isolation, culture and differentiation of satellite cells from head muscles is presented. The isolation is based on enzymatic digestion and trituration to release the satellite cells. In addition, this protocol comprises an innovative method using extracellular matrix gel coatings of millimeter size, which requires only low numbers of satellite cells for differentiation assays.

Med hjälp av detta protokoll, tuggmuskel (en sida) ger 0,8-1 x 10 6 celler, digastric muskeln (bakre mage) ger 1,5-2 x 10 5 celler, och levator Veli palatini muskel ger 1-1,5 x 10 5 celler. Cellutbyten beror på muskeltypen, stam, och ålder av djuret. För jämförelse mellan de tre muskelgrupper, var nyligen isolerade kaster såddes vid samma celltäthet (1,5 x 10 3/10 il). Direkt efter isolering, mer än 90% av de nyligen isolerade cellerna uttrycker Pax7 (Figur 6). Dag 4, 7 och 10 kulturerna färgades med antikroppar mot Pax7, MyoD, MyoG och MyHC immunofärgning. Fem godtyckliga fält räknades per kultur med hjälp av en 20X mål. Vid dag 4 Pax 7 och Myo D uttrycks i alla muskelgrupper (figurerna 6 och 7 och 8), men avkomma SatCs från tugg och digastric muskler börjar Expressjunger myogenin tidigare än levator Veli palatini muskel (Figur 9). Vid dag 10, är uttrycket av MyoG kraftigt reduceras i alla grupper (figur 9). Några dagar efter ympning på den extracellulära matrisen gel fläckar, de prolifererande cellerna börjar att smälta och bilda multikärnförsedda myotuber som uttrycker myosin-tung kedja. Små myotuber syns tydligt vid dag 7 (Figur 10). Vid dag 10, kan observeras ryckningar i myotuber (Video 1). <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig1.jpg" /> Figur 1:. Extracellulära matris gel fläckar i en kammarobjektglas (A) för enkel hantering, placera 8-brunnars kammarobjektglas i ett 100 mm petriskål. Pipet 10 il extracellulärmatrix gel i varje kammare och lägga den på en kall yta (7 min). (B) avdelningen glida efter överskottet extracellulärmatrix gel avlägsnas. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig2.jpg" /> Figur 2:. Dissekering av tuggmuskel (A) chef för djuret i en sidovy. Ear (E), öronspottkörteln (P) och ansiktsnerven (VII). (B) tendinöst aponeurosis (Te) i ytliga chef för tuggmuskel (MS) och temporal muskel (T). Separera senan från dess införande med en tång. (C) dissekera försiktigt muskeln tills dess införande vid ramus av underkäken. E: öra, P: öronspottkörteln, VII: ansiktsnerven, T: Temporal muskel, MS: ytlig chef för tuggmuskel, Te: senan, Mp: djup chef för tuggmuskel. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig3.jpg" /> Figur 3: Dissekering av den bakre magen av digastric muskeln (.A) chef för djuret i ryggläge. Lokalisera submandibular körteln (SG), tuggmuskel (M), ansiktsnerven (VII) och sternocleidomastoideus (SCM). Ta bort submandibulära körteln. (B) Lokalisera digastric muskel främre (AD) och bakre mage (PD). Med en rak pincett, ta den främre senan av den bakre buken, skär den och dissekera den försiktigt tills sitt ursprung i trum bulla (ty). E: öra, Sg: submandibular körteln, VII: ansiktsnerven, M: tuggmuskeln, SMC: sternocleidomastoideus, AD: anterior mage digastric muskel, PD: bakre mage digastric muskel, Ty: Tympanic bulla. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig4.jpg" /> Figur 4:. Dissekering av levator Veli palatini muskel (A) Generalen beskådar efter dissektion av digastric muskeln (bakre magen). Stylohyoid muskel (St) och sena i levatorveli palatini kan lokaliseras. Notera luftstrupen (T) och esofagus (Es) som löper bakom den. (B) Efter att lyfta luftstrupen och matstrupen svalget (P) är utsatt. Insättningen av levator veli palatini i den mjuka gommen är nu synlig. Pilen indikerar dissekerade mjuka gommen med levator Veli palatini musklerna vid båda sidor. E: öra, St: stylohyoid muskel, VII: ansiktsnerven, M: tuggmuskeln, AD: anterior mage digastric muskel, PD: bakre mage digastric muskel, T: luftstrupe, Es: matstrupen, P: svalg, * levator veli palatini muskel . <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig5.jpg" /> Figur 5: Utseende av muskelvävnad (A) före och (B) efter enzymatisk uppslutning med pronas. Lägg märke till att muskelknippen verkar lossas efter enzymatisk spjälkning. Figur 6: Pax 7 immunofärgning Nyligen isolerade SCS, som tillämpas på extracellulär matrix gel vid slutet av isoleringen (ca 6 timmar efter den första vävnads spjälkning).. Fem godtyckliga fält räknades med hjälp av en 10X mål med ett genomsnitt på 210 celler per fält. Cirka 90% av cellerna är Pax 7 positiva. DAPI: blå, Pax7: rött. Skalstreck, 100 | j, m. <img alt="Figur 7" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" width="700" /> Figur 7:. Pax 7, MyoD immunofärgning Dag 4, 7 och 10 kulturerna färgades med antikroppar mot Pax7 och MyoD immunfärgning. (A - C) och (D - F) Representativa mikrofotografier av dag 4 och 7 kulturer från tuggmuskel. (G och H </strong&gt;) Antalet Pax7 + och MyoD + kärnor per mikroskopiska fält räknades och uttryckt i procent av det totala antalet kärnor (DAPI). DAPI: blå, Pax7: rött, och MyoD: grön. Vågar bar, 100 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig7highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 8" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" width="700" /> Figur 8:. Fördelning av Pax7 ± / MyoD ± i kulturer från mononukleära celler i odlingar från tugg, digastric och levator Veli palatine muskel (A - C) Dag 4, 7 och 10 kulturer färgades med antikroppar mot Pax7 och MyoD immun. Det totala antalet celler är baserad på av det totala antalet kärnor (DAPI). (D) Data kvantifiering av Pax7 ± / MyoD ± cells. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig8highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> <img alt="Figur 9" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" width="700" /> Figur 9:. Myogenin immunfärgning Dag 4, 7 och 10 kulturerna färgades med antikroppar mot myogenin. (A - D) Representativa mikrofotografier av dag 4 och 7 kulturer från levator Veli palatine muskler. (E) Antalet MyoG + kärnor per mikroskopiskt fält räknades och uttrycktes som en procentandel av det totala antalet kärnor (DAPI). (F) Data kvantifiering av MyoG + celler. DAPI: blå, myogenin: grön. Vågar bar, 100 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig9highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur</a>e. <img alt="Figur 10" src="/files/ftp_upload/52802/52802fig10.jpg" /> Figur 10:. Myosin tung kedja immunfärgning Dag 4, 7 och 10 kulturerna färgades med antikroppar mot myosin tung kedja (MyHC). Representativa mikrofotografier av dag 4, 7 och 10 kulturer från den digastric (DIG) muskel. Vid dag 7, små myotuber finns samtidigt dag 10 långa och väl organiserade myotuber är uppenbara. Vågar bar, 200 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/52802fig10large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a> Video 1:.. Myotube ryckningar Exempel på två representativa fält med ryckningar myotuber visas för dagen 10 kulturer från digastric muskel <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52802/Video1.mpg" target="_blank">Klicka här för att se filmen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles at JoVE.com

Isolation and Characterization of Satellite Cells from Rat Head Branchiomeric Muscles

Detta protokoll beskriver isolering av satellitceller från branchiomeric huvudet musklerna i en 9 veckor gammal råtta. Musklerna har sitt ursprung från olika brankiala valv. Därefter satellitcellerna odlas på en plats beläggning av millimeterstorlek för att studera deras differentiering. Detta tillvägagångssätt undviker expansion och passage av satellitceller.

Isolering och karakterisering av satellitceller från råtta Head Branchiomeric Muskler

Fibrosis and defective muscle regeneration can hamper the functional recovery of the soft palate muscles after cleft palate repair. This causes persistent ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Isolation and Quantitative Immunocytochemical Characterization of Primary Myogenic Cells and Fibroblasts from Human Skeletal Muscle

Isolering och Kvantitativ Immuncytokemiska karakterisering av primära myogena celler och fibroblaster från Human skelettmuskulatur

The repair and regeneration of skeletal muscle requires the action of satellite cells, which are the resident muscle stem cells. These can be isolated ...

Isolation of Neural Stem/Progenitor Cells from the Periventricular Region of the Adult Rat and Human Spinal Cord

Isolering av neurala stamceller / progenitorceller från periventrikulär regionen vuxen råtta och humant ryggmärgs

Adult rat and human spinal cord neural stem/progenitor cells (NSPCs) cultured in growth factor-enriched medium allows for the proliferation of ...

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

Isolering och karakterisering av enskilda celler från zebrafiskembryon

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

Isolation and Characterization of Mesenchymal Stromal Cells from Human Umbilical Cord and Fetal Placenta

Isolering och karakterisering av mesenkymala stromala celler från human navelsträng och Fetal Placenta

The human umbilical cord (UC) and placenta are non-invasive, primitive and abundant sources of mesenchymal stromal cells (MSCs) that have increasingly ...

Isolation of Type I and Type II Pericytes from Mouse Skeletal Muscles

Isolering av typ I och typ II pericyter från muskelsmuskler

Pericytes are perivascular multipotent cells that show heterogeneity in different organs or even within the same tissue. In skeletal muscles, there are at ...

Isolation and Characterization of Primary Rat Valve Interstitial Cells: A New Model to Study Aortic Valve Calcification

Isolering och karakterisering av primära råtta ventil interstitiella celler: en ny modell att studera aortaklaffen förkalkning

Calcific aortic valve disease (CAVD) is characterized by the progressive thickening of the aortic valve leaflets. It is a condition frequently found in ...

Identification of Skeletal Muscle Satellite Cells by Immunofluorescence with Pax7 and Laminin Antibodies

Identifiering av skelettmuskulaturen satellit celler genom immunofluorescens med Pax7 och Laminin antikroppar

Immunofluorescence is an effective method that helps to identify different cell types on tissue sections. In order to study the desired cell population, ...

Isolation and Characterization of Cardiac Mesenchymal Stromal Cells from Endomyocardial Bioptic Samples of Arrhythmogenic Cardiomyopathy Patients

Isolering och karakterisering av hjärt mesenkymala stromaceller från endomyokardiella Bioptic prover av Högerkammarfunktion kardiomyopati patienter

A normal adult heart is composed of several different cell types, among which cardiac mesenchymal stromal cells represent an abundant population. The ...

Isolation and Characterization of Human Umbilical Cord-derived Mesenchymal Stem Cells from Preterm and Term Infants

Isolering och karakterisering av navelsträngen-derived mesenkymala stamceller från prematura och benämner spädbarn

Mesenchymal stem cells (MSCs) have considerable therapeutic potential and attract increasing interest in the biomedical field. MSCs are originally ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

I Vitro Generation av Somite derivat från mänskliga inducerade stamceller pluripotenta

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...