Name: direct protein delivery to mammalian cells using cell-permeable cys2-his2 zinc-finger domains
Uploaded: 2015-03-25T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains at JoVE.com

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (DP1CA174426 لكارلوس F. BARBAS) وجامعة ShanghaiTech، شنغهاي، الصين (لJL). تم إنشاؤها باستخدام الرسومات الجزيئية PyMol.

1. الاستنساخ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول بإصبعين المجالات زيف-استبداله ألانين التي تم المستنسخة الفرعية في النظام ناقلات التعبير PET-28 وهي متاحة عند الطلب (PET-2F-زيف) (34). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR تضخيم EmGFP من البلازميد الزمرد-pBAD مع ا...

<ol>
	<li>Berg, A., Dowdy, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+transduction+domain+delivery+of+therapeutic+macromolecules.">Protein transduction domain delivery of therapeutic macromolecules.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 22, 888-893 (2011).</li><li>Lindsay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Peptide-mediated+cell+delivery:+application+in+protein+target+validation.">Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation.</a> Curr. Opin. Pharmacol. 2, 587-594 (2002).</li><li>Luo, D., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+DNA+delivery+systems.">Synthetic DNA delivery systems.</a> Nat. Biotechnol. 18, 33-37 (2000).</li><li>Guo, X., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+nonviral+vectors+for+gene+delivery.">Recent advances in nonviral vectors for gene delivery.</a> Acc. Chem. Res. 45, 971-979 (2012).</li><li>Thomas, C. E., Ehrhardt, A., Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+problems+with+the+use+of+viral+vectors+for+gene+therapy.">Progress and problems with the use of viral vectors for gene therapy.</a> Nat. Rev. Genet. 4, 346-358 (2003).</li><li>Frankel, A. D., Pabo, C. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+of+the+tat+protein+from+human+immunodeficiency+virus.">Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus.</a> Cell. 55, 1189-1193 (1988).</li><li>Elliott, G., O'Hare, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intercellular+trafficking+and+protein+delivery+by+a+herpesvirus+structural+protein.">Intercellular trafficking and protein delivery by a herpesvirus structural protein.</a> Cell. 88, 223-233 (1997).</li><li>Derossi, D., Joliot, A. H., Chassaing, G., Prochiantz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+helix+of+the+Antennapedia+homeodomain+translocates+through+biological+membranes.">The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes.</a> J. Biol. Chem. 269, 10444-10450 (1994).</li><li>Smith, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimally+cationic+cell-permeable+miniature+proteins+via+alpha-helical+arginine+display.">Minimally cationic cell-permeable miniature proteins via alpha-helical arginine display.</a> J. Am. Chem. Soc. 130, 2948-2949 (2008).</li><li>Daniels, D. S., Schepartz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intrinsically+cell-permeable+miniature+proteins+based+on+a+minimal+cationic+PPII+motif.">Intrinsically cell-permeable miniature proteins based on a minimal cationic PPII motif.</a> J. Am. Chem. Soc. 129, 14578-14579 (2007).</li><li>Karagiannis, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rational+design+of+a+biomimetic+cell+penetrating+peptide+library.">Rational design of a biomimetic cell penetrating peptide library.</a> ACS Nan. 7, 8616-8626 (2013).</li><li>Gao, S., Simon, M. J., Hue, C. D., Morrison, B., 3r, S., Banta, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+unusual+cell+penetrating+peptide+identified+using+a+plasmid+display-based+functional+selection+platform.">An unusual cell penetrating peptide identified using a plasmid display-based functional selection platform.</a> ACS Chem. Biol. 6, 484-491 (2011).</li><li>Fuchs, S. M., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arginine+grafting+to+endow+cell+permeability.">Arginine grafting to endow cell permeability.</a> ACS Chem. Biol. 2, 167-170 (2007).</li><li>Cronican, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potent+delivery+of+functional+proteins+into+mammalian+cells+in+vitro+and+in+vivo+using+a+supercharged+protein.">Potent delivery of functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo using a supercharged protein.</a> ACS Chem. Biol. 5, 747-752 (2010).</li><li>Panyam, J., Labhasetwar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+nanoparticles+for+drug+and+gene+delivery+to+cells+and+tissue.">Biodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 329-347 (2003).</li><li>Zelphati, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+delivery+of+proteins+with+a+new+lipid-mediated+delivery+system.">Intracellular delivery of proteins with a new lipid-mediated delivery system.</a> J. Biol. Chem. 276, 35103-35110 (2001).</li><li>Kaczmarczyk, S. J., Sitaraman, K., Young, H. A., Hughes, S. H., Chatterjee, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+using+engineered+virus-like+particles.">Protein delivery using engineered virus-like particles.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 108, 16998-17003 (2011).</li><li>Voelkel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+transduction+from+retroviral+Gag+precursors.">Protein transduction from retroviral Gag precursors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 107, 7805-7810 (2010).</li><li>Sinha, V. R., Trehan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biodegradable+microspheres+for+protein+delivery.">Biodegradable microspheres for protein delivery.</a> J. Control Release. 90, 261-280 (2003).</li><li>Liu, J., Gaj, T., Patterson, J. T., Sirk, S. J., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+TALEN+proteins+via+bioconjugation+for+genome+engineering.">Cell-penetrating peptide-mediated delivery of TALEN proteins via bioconjugation for genome engineering.</a> PLoS One. 9, e85755 (2014).</li><li>Ramakrishna, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+disruption+by+cell-penetrating+peptide-mediated+delivery+of+Cas9+protein+and+guide+RNA.">Gene disruption by cell-penetrating peptide-mediated delivery of Cas9 protein and guide RNA.</a> Genome Res. 24, 1020-1027 (2014).</li><li>Fuchs, S. M., Raines, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyarginine+as+a+multifunctional+fusion+tag.">Polyarginine as a multifunctional fusion tag.</a> Protein Sci. 14, 1538-1544 (2005).</li><li>Mai, J. C., Shen, H., Watkins, S. C., Cheng, T., Robbins, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficiency+of+protein+transduction+is+cell+type-dependent+and+is+enhanced+by+dextran+sulfate.">Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate.</a> J. Biol. Chem. 277, 30208-30218 (2002).</li><li>Al-Taei, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+traffic+and+fate+of+protein+transduction+domains+HIV-1+TAT+peptide+and+octaarginine.+Implications+for+their+utilization+as+drug+delivery+vectors.">Intracellular traffic and fate of protein transduction domains HIV-1 TAT peptide and octaarginine. Implications for their utilization as drug delivery vectors.</a> Bioconjug. Chem. 17, 90-100 (2006).</li><li>Jones, S. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterisation+of+cell-penetrating+peptide-mediated+peptide+delivery.">Characterisation of cell-penetrating peptide-mediated peptide delivery.</a> Br. J. Pharmacol. 145, 1093-1102 (2005).</li><li>Urnov, F. D., Rebar, E. J., Holmes, M. C., Zhang, H. S., Gregory, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+editing+with+engineered+zinc+finger+nucleases.">Genome editing with engineered zinc finger nucleases.</a> Nat. Rev. Genet. 11, 636-646 (2010).</li><li>Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+with+zinc-finger+nucleases.">Genome engineering with zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 188, 773-782 (2011).</li><li>Guo, J., Gaj, T., Barbas, C. F., 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+evolution+of+an+enhanced+and+highly+efficient+FokI+cleavage+domain+for+zinc+finger+nucleases.">Directed evolution of an enhanced and highly efficient FokI cleavage domain for zinc finger nucleases.</a> J. Mol. Biol. 400, 96-107 (2010).</li><li>Gaj, T., Guo, J., Kato, Y., Sirk, S. J., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+knockout+by+direct+delivery+of+zinc-finger+nuclease+proteins.">Targeted gene knockout by direct delivery of zinc-finger nuclease proteins.</a> Nat. Methods. 9, 805-807 (2012).</li><li>Gersbach, C. A., Gaj, T., Barbas, C. F., 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+zinc+finger+proteins:+the+advent+of+targeted+gene+regulation+and+genome+modification+technologies.">Synthetic zinc finger proteins: the advent of targeted gene regulation and genome modification technologies.</a> Acc. Chem. Res. 47, 2309-2318 (2014).</li><li>Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ZFN,+TALEN,+and+CRISPR/Cas-based+methods+for+genome+engineering.">ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering.</a> Trends Biotechnol. 31, 397-405 (2013).</li><li>Perez-Pinera, P., Ousterout, D. G., Gersbach, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+targeted+genome+editing.">Advances in targeted genome editing.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 16, 268-277 (2012).</li><li>Cronican, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+human+proteins+that+deliver+functional+proteins+into+mammalian+cells+in+vitro+and+in+vivo.">A class of human proteins that deliver functional proteins into mammalian cells in vitro and in vivo.</a> Chem. Biol. 18, 833-838 (2011).</li><li>Gaj, T., Liu, J., Anderson, K. E., Sirk, S. J., Barbas, C. F., 3rd, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+delivery+using+Cys2-His2+zinc-finger+domains.">Protein delivery using Cys2-His2 zinc-finger domains.</a> ACS Chem. Biol. 9, 1662-1667 (2014).</li><li>Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basics+of+flow+cytometry.">Basics of flow cytometry.</a> Methods Mol. Biol. 91, 1-24 (1998).</li><li>Mercer, A. C., Gaj, T., Sirk, S. J., Lamb, B. M., Barbas, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+endogenous+human+gene+expression+by+ligand-inducible+TALE+transcription+factors.">Regulation of endogenous human gene expression by ligand-inducible TALE transcription factors.</a> ACS Synth. Biol. 3, 723-730 (2014).</li><li>Segal, D. J., Crotty, J. W., Bhakta, M. S., Barbas, C. F., Horton, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+Aart,+a+designed+six-finger+zinc+finger+peptide,+bound+to+DNA.">Structure of Aart, a designed six-finger zinc finger peptide, bound to DNA.</a> J. Mol. Biol. 363, 405-421 (2006).</li></ol>

هنا، يتم تقديم بروتوكول خطوة بخطوة لتسليم البروتين باستخدام الزنك الاصبع (زيف) نطاقات خلية قابلة للاختراق. المجال زيف لا يقلل من نشاط تنصهر البضائع الأنزيمية 34؛ يسمح لإنتاج وتنقية البروتينات في عائدات متطابقة تقريبا لتلك التي لوحظت مع البروتين معدلة. ويمكن نق?...

استراتيجيات فعالة للغاية وتنوعا تسليم البروتين حاسمة بالنسبة لكثير من البحوث الأساسية والتطبيقات العلاجية. النقل المباشر لتنقية البروتينات في خلايا يمثل واحدة من أسلم وأسهل الطرق لتحقيق ذلك. وخلافا 1،2 الاستراتيجيات التي تعتمد على التعبير الجيني من الأحماض النووية، 3-5 تسليم البروتين يشكل أي خطر من الطفرات إقحامي، مستقلة عن الخلوية النسخ / الآلات الترجمة وتسمح لها تأثير فوري. ومع ذلك، فإن عدم وجود طرق بسيطة وللتعميم عن ومنح النشاط لاختراق الخلية على البروتينات يفند بشكل روتيني دخولهم المباشر في الخلايا. تستند الأساليب الحالية لتسهيل داخل الخلايا تسليم البروتين على استخدام تحدث بشكل طبيعي 6-8 أو تصميم الببتيد اختراق الخلية، 9-12 المجالات التنبيغ السوبر، 13،14 النانوية 15 والجسيمات الشحمية، 16 للفيروسات مثل الجزيئات 17،18 </سوب&gt; والمواد البوليمرية المكروية (19). لسوء الحظ، العديد من هذه الطرق ما يعرقل انخفاض معدلات امتصاص الخلوية، 20،21 الاستقرار الفقراء، 22 غير مقصودة الخلية من نوع خصوصية، 23 خصائص الهروب منخفض endosomal 24 وسمية. 25 وبالإضافة إلى ذلك، فإن العديد من البروتين تقنيات التنبيغ تقلل من النشاط الحيوي من البروتينات تسليمها. 14 لدينا مختبر أظهرت في وقت سابق ان نوكلياز الزنك الاصبع (ZFN) بروتينات - تقييد خيالية endonucleases تتألف من السيستئين 2 العاهل 2 الزنك والبروتين إصبع ملزم DNA للبرمجة والمجال انشقاق من FokI تقييد نوكلياز داخلية 26-28 - هم الخلوي بطبيعتها قابلة للاختراق. وقد أظهرت 29 هذا النشاط لاختراق الخلية من المستغرب أن تكون خاصية ذاتية للمجال الزنك إصبع مصمم خصيصا، منصة ملزم DNA التي برزت كأداة قوية لاستهداف الجينوم ENgineering، 30-32 والتي تعتبر نتيجة لكوكبة من ستة بقايا موجبة على سطح البروتين. في الواقع، وقد ثبت عدة البروتينات الحمض النووي ملزم، بما في ذلك ج يونيو وN-دك لامتلاك قدرة فطرية لعبور أغشية الخلايا. 33 وفي الآونة الأخيرة، توسع المختبر لدينا على هذه النتائج وأظهرت أن النشاط لاختراق الخلية من zinc- يمكن الاستدانة الإصبع (زيف) المجالات لداخل الخلايا تسليم البروتين. الانصهار الوراثي إما واحد أو بإصبعين المجالات زيف إلى البضائع البروتين محددة أدى إلى امتصاص الكفاءة التي تجاوزت العديد من أنظمة تسليم الببتيد اختراق الخلية التقليدية. 34 وأبرزها، زيف بوساطة تسليم لا تمس النشاط من البضائع الأنزيمية تنصهر وسهلت مستويات عالية من تسليم عصاري خلوي. بشكل جماعي، تؤكد هذه النتائج على إمكانات المجال زيف لتسهيل التنفيذ الفعال وسطحي من البروتينات، وأنواع يحتمل أن تكون أكثر تنوعا من ماكروالجزيئات، في الخلايا. هنا، يتم تقديم خطوة بخطوة بروتوكول مفصلة حول كيفية تنفيذ تكنولوجيا زيف للتسليم البروتين في خلايا الثدييات. نحن شيدت من قبل مجموعة من واحد، اثنان، ثلاثة، وأربعة، خمس وستة أصابع المجالات زيف التي تفتقر إلى القدرة على ربط الحمض النووي، ويرجع ذلك إلى استبدال كل من المخلفات ملزم DNA-α حلزونية، ولكن هي قادرة على تقديم البروتينات في خلايا 34 (الشكل 1). يوصف إنتاج وتنبيغ الزمرد GFP (EmGFP) في خلايا هيلا باستخدام بإصبعين زيف المجال. هذا البروتوكول هو للمد إلى ما يقرب من أي بروتين قادر على التعبير القابلة للذوبان في القولونية وأي نوع من الخلايا الثدييات تقريبا. وتقدم النتائج المتوقعة وتناقش أيضا استراتيجيات لتحقيق أقصى قدر من الأداء لهذا النظام.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>XmaI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0180L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SacI</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>R0156L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Expand High Fidelity PCR system</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11759078001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTPs</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>N0446S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-20% Tris-Glycine Mini protein gels, 1.5 mm, 10 wells</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>EC6028BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2x Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T4 DNA Ligase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15224-017</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BL21 (DE3) Competent E. coli</td>
			<td>New England Biolabs</td>
			<td>C2527I</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IPTG</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>R0391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zinc Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>208086-5G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kanamycin Sulfate</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP906-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270-100G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Base</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP152-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9888-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>PR-V3151&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PMSF</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>36978</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ni-NTA Agarose Resin</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>30210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G5516-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imidazole</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>I5513-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units</td>
			<td>EMO Millipore</td>
			<td>UFC900324</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11966-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10437-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Antibiotic-Antimycotic&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15240-062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-Well Flat Bottom Plate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS3527-100EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly-Lysine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, No Calcium, No Magnesium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>21600010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparan Sulfate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4777</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>25300054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hela cells</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>CCL-2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano Drop ND-1000 spectrophotometer&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick PCR Purification Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>QIAquick Gel Extraction Kit</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>28704</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

direct protein delivery to mammalian cells using cell-permeable cys2-his2 zinc-finger domains

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged as useful tools for targeted genome engineering. Like many other DNA-binding proteins, zinc-fingers also possess the innate ability to cross cell membranes. We recently demonstrated that this intrinsic cell-permeability could be leveraged for intracellular protein delivery. Genetic fusion of zinc-finger motifs leads to efficient transport of protein and enzyme cargo into a broad range of mammalian cell types. Unlike other protein transduction technologies, delivery via zinc-finger domains does not inhibit enzyme activity and leads to high levels of cytosolic delivery. Here a detailed step-by-step protocol is presented for the implementation of zinc-finger technology for protein delivery into mammalian cells. Key steps for achieving high levels of intracellular zinc-finger-mediated delivery are highlighted and strategies for maximizing the performance of this system are discussed.

ويمكن التعبير عن بإصبعين زيف-EmGFP البروتينات الانصهار في E. القولونية مع&gt; 95٪ التجانس وعوائد عالية (&gt; 25 ملغ / مل) (الشكل 2). بشكل عام، واحدة وبإصبعين يمكن أن تنتج زيف البروتينات الانصهار في كميات مماثلة تقريبا لتلك التي من النوع البري غير معدل البروتين. ومع ...

Watch this Scientific Journal Video about Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains at JoVE.com

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

المجالات الزنك الاصبع هي في جوهرها خلايا قابلة للاختراق وقادرة على التوسط تسليم البروتين في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا الثديية. هنا، يتم تقديم خطوة بخطوة بروتوكول مفصلة لتنفيذ تكنولوجيا الزنك والإصبع للداخل الخلايا تسليم البروتين.

البروتين التسليم المباشر للخلايا الثدييات عن طريق خلية قابلة للاختراق السيستئين<sub&gt; 2</sub&gt; العاهل<sub&gt; 2</sub&gt; مجالات الزنك الاصبع

Due to their modularity and ability to be reprogrammed to recognize a wide range of DNA sequences, Cys2-His2 zinc-finger DNA-binding domains have emerged ...

Research

JoVE Journal

Biology

Direct Protein Delivery to Mammalian Cells Using Cell-permeable Cys2-His2 Zinc-finger Domains

Long-term Imaging Mammalian Cells using Wide-Field Microscopy

التصوير خلايا الثدييات على المدى الطويل باستخدام الميكروسكوب واسعة الميدانية

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

Trypsinizing Subculturing وخلايا الثدييات

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Engineering Cell-permeable Protein

هندسة الخلايا المنفذة للبروتين

The protein transduction technique enables the direct delivery of biologically active material into mammalian cells [for review see 1,2]. For this one can ...

Using the GELFREE 8100 Fractionation System for Molecular Weight-Based Fractionation with Liquid Phase Recovery

باستخدام نظام التقطير GELFREE 8100 لتقطير الوزن الجزيئي وبناء مع مرحلة الانتعاش السائل

The GELFREE 8100 Fractionation System is a novel protein fractionation system designed to maximize protein recovery during molecular weight based ...

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

الجينوم التحرير مع مخصص Nucleases CompoZr فنجر الزنك (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

siRNA Screening to Identify Ubiquitin and Ubiquitin-like System Regulators of Biological Pathways in Cultured Mammalian Cells

سيرنا فحص لتحديد اليوبيكويتين واليوبيكويتين مثل المنظمين نظام مقررات تمهيدية البيولوجية في خلايا الثدييات مثقف

Post-translational modification of proteins with ubiquitin and ubiquitin-like molecules (UBLs) is emerging as a dynamic cellular signaling network that ...

Identification of Protein Interaction Partners in Mammalian Cells Using SILAC-immunoprecipitation Quantitative Proteomics

تحديد الشركاء التفاعل البروتين في خلايا الثدييات عن طريق SILAC مناعي الكمي البروتيوميات

Quantitative proteomics combined with immuno-affinity purification, SILAC immunoprecipitation, represent a powerful means for the discovery of novel ...

Zinc-finger Nuclease Enhanced Gene Targeting in Human Embryonic Stem Cells

الزنك الاصبع نوكلياز المحسن استهداف الجينات في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

One major limitation with current human embryonic stem cell (ESC) differentiation protocols is the generation of heterogeneous cell ...

Examination of Proteins Bound to Nascent DNA in Mammalian Cells Using  BrdU-ChIP-Slot-Western Technique

فحص البروتينات ملزمة لالوليدة DNA في خلايا الثدييات عن طريق BrdU رقاقة فتحة للغرب تقنية

Histone deacetylases 1 and 2 (HDAC1,2) localize to the sites of DNA replication. In the previous study, using a selective inhibitor and a genetic ...

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

واجهة المستخدم الرسومية لتتبع بمساعدة برنامج تركيز البروتين في النتوءات الخلوية الديناميكية

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...