Name: treatment of platelet products with riboflavin and uv light: effectiveness against high titer bacterial contamination
Uploaded: 2015-08-24T14:00:00
Duration: 10 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination at JoVE.com

The authors have no acknowledgements.

1. Bakterier Suspension Förberedelser: <ol><li> Från en strimmig odlingsplatta, aseptiskt ympa en enda koloni i en 250 ml steril flaska innehållande 100 ml av den lämpliga tillväxtmedia (tabell 1) genom steril inokulering slinga. </li><li> Placera flaskan i en orbital skakinkubator vid lämpliga betingelser (tabell 1) under 1-2 dagar, kontroll för tillväxt med jämna mellanrum. Ställ skakapparaten hastigheten till 140 RPM. </li><li> Överför aseptiskt bakteriesuspensionen i två sterila 50 ml koniska rör och centrifugera rören vid 3000 xg under 20 min vid 23 ° C. </li><li> Aspirera supernatanten och återsuspendera varje bakteriella pelleten med 15 ml sterilt peptonvatten. Vortex vid behov. Kombinera den suspenderade bakteriekultur i ett rör / behållare. </li><li> Titrera stamkulturen i tre exemplar per avsnitt 4 för att bestämma stamkulturen titer. </li><li> Kylskåp i upp till 2 veckor vid 477; 2 ° C tills de behövdes. Åter titer kulturen vid tidpunkten för användning, se steg 4.8. </li></ol> 2. Platelet Produkt Förberedelser: <ol><li> Samla en standard aferes human blodplättsprodukt vid ett ackrediterat blodbank. Den blodplättsprodukt måste uppfylla följande insamlings specifikationer: 90-360 ml volym och 0,8 -3,8 x 10 6 trombocyter / ul koncentration. <ol><li> Säkerställa att produkten plätt har vilat under minst 2 h före behandling för minskning av patogener. Lagra produkterna vid 22 ± 2 ° C i en blodplätts inkubator utan omrörning under dessa två timmar. Efter två timmar säkerställa trombocytprodukt omröres vid 22 ± 2 ° C i en blodplätts inkubator. Använd produkten i upp till 22 timmar efter insamling. </li></ol></li><li> Med användning av en 3 ml spruta bort en 2 ml prov för att mäta pH-22C av blodplättsprodukt. Använd en blodgas analysator för att säkerställa att produkten har ett pH&gt; 6,6. Använd samma prov för att mäta koncentrationen av den blodplättsprodukt med användning av en hematologisk analysator trombocyter. Se till att produkten uppfyller 0.80-3.8 x 10 6 trombocyter / kravet på il samlingen koncentrationen. </li><li> Utvärdera visuellt virvel av produktens trombocyter. Om produkten har en &quot;0&quot; snurra produkten kasseras. </li><li> Håll blodplättsbehållaren upp under ett direkt vita ljuskälla och pressa blodplättsbehållaren kort. Observera visuellt virvelmönster prov trombocyter. Betyg produkten med hjälp av följande skala. OBS: 2 - Positiv Swirl: Virvlande inhomogenitet synlig under hela påsen med stark kontrast. 1 - Intermediate Swirl: Vissa inhomogenitet synliga, men bara på några få ställen och med dålig kontrast. 0 - Negativ Swirl: Grumligt homogenitet som återstår innan och efter klämma blodplättsbehållaren </li></ol> 3. Riboflavin och UV-ljus Process: <ol><li> TranSfer blodplätt produkten till en riboflavin och UV-ljus belysning och förvaringsväska med hjälp av en steril slang dockningsenhet. Efter överföring bort den tomma blodplättsenheten uppsamlingspåse med hjälp av en slang sealer och kasta den tomma påsen som biologiskt avfall. </li><li> Ta en 35 ml påse med 500 iM riboflavin lagerlösning från sin lätt skyddande yttre hölje. Sterila Dock riboflavin satsen på inloppsledningen av behandlingen och förvaringsväska. Låt innehållet rinna in i enheten trombocyter. </li><li> Häng riboflavin påse / behandling och förvaringsväska in från riboflavin påsen och försiktigt uttrycker kvarvarande luft ur behandling och förvaringsväska och in i riboflavin påsen. Säkerställa en liten mängd blodplättsprodukt uttrycks också i riboflavin påsen att skölja eventuella rest riboflavin i produkt trombocyter. Låt riboflavin och blodplättslösning rinna tillbaka in i behandling och förvaringsväska och sedan klämma inloppsledningen. Ta bort den tomma riboflavin påsen ossing en slang sealer och kasta den tomma påsen som biologiskt avfall. </li><li> Sterila docka en 6 &quot;slang linje med kvinnliga spruta kontakt på inloppsledningen av belysningen och förvaringsväska. Bifoga en 10 ml sprutcylinder (ta bort kolven) på kvinnliga sprutan kontakten. </li><li> Aseptiskt 5 ml av stock bakterier i sprutcylindern via en pipett. Öppna klämman på inloppsledningen och låta bakterier att rinna in i blodplätts produkt. Skölj sprutcylindern genom att tillåta vissa blodplätts produkt att strömma tillbaka in i 10 ml sprutan. Ta ut 10 ml sprutan. </li><li> Fäst med aseptisk teknik en 30 ml spruta och spola ingångsporten minst två gånger för att säkerställa aktie bakterierna blandas in i blodplättsprodukt. När produkten är väl blandat, använd en ren 5-10 ml sprutan och ta en 2 ml förbehandling prov. Med hjälp av en ny spruta se någon luft införs från ympning steg eller provtagning steg bort. <ol><li> Titrera förbehandlings prov per avsnitt 4. </li></ol></li><li> Ta inloppsledningen från behandling och förvaringsväska och väger produkten. </li><li> Placera produkten i belysnings och följ skärmen kommandon för att starta en behandling vanlig blodplättar. <ol><li> Ange i användar-ID. </li><li> Säkra och montera påsen till belysningsplattan. </li><li> Ange Prov-ID i belysnings antingen streckkodsläsaren eller manuell inmatning knappsats. </li><li> Scan produkttyp. </li><li> Stäng kvartsklämma. </li><li> Belysningsanordningen automatiskt leverera 6,24 J / ml energi. Den typiska behandlingstiden tar 5-10 minuter. </li></ol></li><li> Efter behandling steril docka en 6 &quot;slang linje med kvinnliga spruta kontakt på provkolven raden av behandling och förvaringsväska. Se till att produkten är väl blandat och sedan bifoga en 5 ml spruta och ta bort en 2 ml efterbehandlingsprov. <ol><li> Titrera efterbehandling samniskor per avsnitt 4. </li></ol></li></ol> 4. Bakteriell Titer <ol><li> Uppskatta titer av förbehandlings och efterbehandlingsprover och förbereda lämpligt antal 5 ml spädningsrör behövs för att utföra en slutpunkt serieutspädning av varje prov. Aseptiskt fylla de nödvändiga rören med 1,8 ml pepton vatten. </li><li> Titer varje prov med användning av en 10-faldig seriespädning system. Överför aseptiskt 0,2 ml från det outspädda provet till den första spädröret (10 -1). Vortex denna utspädning rör och överföra 0,2 ml till nästa utspädningsröret. Fortsätt serieutspädning genom erforderligt antal utspädningar. <ol><li> Överför aseptiskt 100 pl av varje spädning som skall pläteras till en lämplig agarplatta (tabell 1). </li></ol></li><li> Med hjälp av en steril cellspridare, jämnt fördela provet på varje agarplatta. </li><li> Vänd och Inkubera plattorna vid lämpliga villkor ( <strong&gt; Tabell 1) 1-2 dagar checkar för tillväxt med jämna mellanrum. </li><li> Räkna plattor med 30-300 kolonier. Plattor innehållande mer än 300 kolonier anses alltför många för att räkna (TNTC). Plattor innehållande mindre än 30 kolonier anses ligga under kvantifieringsgränsen (LOQ). </li><li> Beräkna titern av varje testprov och registrera resultaten som CFU / ml. <ol><li> Använd följande ekvation för att beräkna CFU / ml: <img alt="Ekvation 1" fo:content-width="2.5in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq1.jpg" width="250" /></li><li> Om det inte finns några kolonier på lägsta utspädningsplattan, använd följande ekvation för att beräkna detektionsgräns (LOD): <img alt="Ekvation 2" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq2.jpg" width="100" /> och <img alt="Ekvation 3" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/52820/52820eq3.jpg" width="100" /> Var: N = lägsta antalet partiklar (CFU) i produkt som kan detekteras med tillförsikt. P = sannolikheten för att en mikroorganism kommer att vara oupptäckt; 95% statistisk säkerhet påvisar en mikroorganism, P = 0,05. V = den totala produktvolym i ml v = volymen pläterad (ml) x spädnivå platta </li></ol></li><li> För negativ kontroll, platta 0,5 ml av pepton vatten som används för seriespädningarna på vardera av två agarplattor. Använd samma plattyp som de prover som skall testas. Vänd och inkubera plattan vid de rätta förutsättningarna för 1-2 dagar kontroll av tillväxt med jämna mellanrum. <ol><li> Om tillväxten observeras på antingen agarplatta, måste flaska peptonvatten används kasseras; resultaten av studien också ogiltigförklaras. </li></ol></li><li> För positiv kontroll, åter titer beståndet bakteriekultur som användes. Vänd och Inkubera plattorna vid de rätta förutsättningarna för 1-2 dagar kontroll av tillväxt med jämna mellanrum. Titern skall vara ± 1,0 log CFU / ml av postened lager titer (se avsnitt 1.5) för studien skall anses som giltigt. </li></ol>

<ol>
	<li>Brecher, M. E., Hay, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+contamination+of+blood+components.">Bacterial contamination of blood components.</a> Clin. Microbiol. Rev. 18 (1), 195-204 (2005).</li><li>Brecher, M. E., Holland, P. V., Pineda, A. A., Tegtmeier, G. E., Yomtovian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+of+bacteria+in+inoculated+platelets:+implications+for+bacteria+detection+and+the+extension+of+platelet+storage.">Growth of bacteria in inoculated platelets: implications for bacteria detection and the extension of platelet storage.</a> Transfusion. 40 (11), 1308-1312 (2000).</li><li>Cardo, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+inactivation+of+Leishmania+donovani+infantum+in+plasma+and+platelet+concentrates+using+riboflavin+and+ultraviolet+light.">Pathogen inactivation of Leishmania donovani infantum in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light.</a> Vox Sang. 90 (2), 85-91 (2006).</li><li>Cardo, L. J., Salata, J., Mendez, J., Reddy, H., Goodrich, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathogen+inactivation+of+Trypanosoma+cruzi+in+plasma+and+platelet+concentrates+using+riboflavin+and+ultraviolet+light.">Pathogen inactivation of Trypanosoma cruzi in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light.</a> Transfus. Apher. Sci. 37 (2), 131-137 (2007).</li><li>Dodd, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+viral+risks+of+blood+and+blood+products.">Current viral risks of blood and blood products.</a> Ann. Med. 32 (7), 469-474 (2000).</li><li>Dodd, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+contamination+and+transfusion+safety:+experience+in+the+United+States.">Bacterial contamination and transfusion safety: experience in the United States.</a> Transfus. Clin. Biol. 10 (1), 6-9 (2003).</li><li>Dumont, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+single-donor+apheresis+platelets+for+bacterial+contamination:+the+PASSPORT+study+results.">Screening of single-donor apheresis platelets for bacterial contamination: the PASSPORT study results.</a> Transfusion. 50 (3), 589-599 (2010).</li><li>Goodrich, R. P., Gilmour, D., Hovenga, N., Keil, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+laboratory+comparison+of+pathogen+reduction+technology+treatment+and+culture+of+platelet+products+for+addressing+bacterial+contamination+concerns.">A laboratory comparison of pathogen reduction technology treatment and culture of platelet products for addressing bacterial contamination concerns.</a> Transfusion. 49 (6), 1205-1216 (2009).</li><li>Greco-Stewart, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serratia+marcescens+strains+implicated+in+adverse+transfusion+reactions+form+biofilms+in+platelet+concentrates+and+demonstrate+reduced+detection+by+automated+culture.">Serratia marcescens strains implicated in adverse transfusion reactions form biofilms in platelet concentrates and demonstrate reduced detection by automated culture.</a> Vox Sang. 102 (3), 212-220 (2012).</li><li>Keil, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inactivation+of+Plasmodium+spp.+in+plasma+and+platelet+concentrates+using+riboflavin+and+ultraviolet+light.">Inactivation of Plasmodium spp. in plasma and platelet concentrates using riboflavin and ultraviolet light.</a> Transfusion. 53 (10), 2278-2286 (2013).</li><li>Kleinman, S., Chan, P., Robillard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Risks+associated+with+transfusion+of+cellular+blood+components+in+Canada.">Risks associated with transfusion of cellular blood components in Canada.</a> Transfus. Med Rev. 17 (2), 120-162 (2003).</li><li>Larsen, C. P., Ezligini, F., Hermansen, N. O., Kjeldsen-Kragh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Six+years'+experience+of+using+the+BacT/ALERT+system+to+screen+all+platelet+concentrates,+and+additional+testing+of+outdated+platelet+concentrates+to+estimate+the+frequency+of+false-negative+results.">Six years' experience of using the BacT/ALERT system to screen all platelet concentrates, and additional testing of outdated platelet concentrates to estimate the frequency of false-negative results.</a> Vox Sang. 88 (2), 93-97 (2005).</li><li>Mundt, J. M., Rouse, L., Van den Bossche, J., Goodrich, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+and+Biological+Mechanisms+of+Pathogen+Reduction+Technologies.">Chemical and Biological Mechanisms of Pathogen Reduction Technologies.</a> Photochem. Photobiol. , (2014).</li><li>Murphy, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+platelet+concentrates+for+bacterial+contamination:+low+numbers+of+bacteria+and+slow+growth+in+contaminated+units+mandate+an+alternative+approach+to+product+safety.">Screening platelet concentrates for bacterial contamination: low numbers of bacteria and slow growth in contaminated units mandate an alternative approach to product safety.</a> Vox Sang. 95 (1), 13-19 (2008).</li><li>Brien, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+incidence+and+residual+risk+of+HIV,+HBV+and+HCV+at+Canadian+Blood+Services.">Current incidence and residual risk of HIV, HBV and HCV at Canadian Blood Services.</a> Vox Sang. 103 (1), 83-86 (2012).</li><li>Pearce, S., Rowe, G. P., Field, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+of+platelets+for+bacterial+contamination+at+the+Welsh+Blood+Service.">Screening of platelets for bacterial contamination at the Welsh Blood Service.</a> Transfus. Med. 21 (1), 25-32 (2011).</li><li>Ramirez-Arcos, S., Kou, Y., Perkins, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+a+universal+point-of-issue+assay+for+bacterial+detection+in+buffy+coat+platelet+components.">Evaluation of a universal point-of-issue assay for bacterial detection in buffy coat platelet components.</a> Vox Sang. 107 (2), 192-195 (2014).</li><li>Reddy, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxicity+testing+of+a+novel+riboflavin-based+technology+for+pathogen+reduction+and+white+blood+cell+inactivation.">Toxicity testing of a novel riboflavin-based technology for pathogen reduction and white blood cell inactivation.</a> Transfus. Med. Rev. 22 (2), 133-153 (2008).</li><li>Ruane, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+inactivation+of+selected+viruses+and+bacteria+in+platelet+concentrates+using+riboflavin+and+light.">Photochemical inactivation of selected viruses and bacteria in platelet concentrates using riboflavin and light.</a> Transfusion. 44 (6), 877-885 (2004).</li><li>Tonnetti, L., Proctor, M. C., Reddy, H. L., Goodrich, R. P., Leiby, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+the+Mirasol+pathogen+reduction+technology+system+against+Babesia+microti+in+apheresis+platelets+and+plasma.">Evaluation of the Mirasol pathogen reduction technology system against Babesia microti in apheresis platelets and plasma.</a> Transfusion. 50 (5), 1019-1027 (2010).</li><li>Vanlandingham, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photochemical+inactivation+of+chikungunya+virus+in+plasma+and+platelets+using+the+Mirasol+pathogen+reduction+technology+system.">Photochemical inactivation of chikungunya virus in plasma and platelets using the Mirasol pathogen reduction technology system.</a> Transfusion. 53 (2), 284-290 (2013).</li><li>Walther-Wenke, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+bacterial+contamination+of+blood+components+in+Germany:+effect+of+contamination+reduction+measures.">Monitoring bacterial contamination of blood components in Germany: effect of contamination reduction measures.</a> Vox Sang. 100 (4), 359-366 (2011).</li></ol>

Alla författarna till detta dokument är för närvarande anställd av Terumo BCT, utvecklare och tillverkare av Mirasol spårtaxisystem. Publiceringsersättningar för video artikeln har betalats av Terumo BCT.

Bakteriell screening har blivit vanligt i blod banker och för många platser det fungerar som den primära metoden för att förhindra transfusion av bakteriellt kontaminerade blodplättar. Även bakteriell screening interdicts typiskt de flesta snabbt växande gramnegativa bakterier som S. marcescens, E. coli och E. cloacae, kämpar det att upptäcka långsamt växande grampositiva bakterier som S. aureus, Streptococcus spp. och S. epidermidis 8. Tyvärr är dessa tre grampositiva bakterier inblandade i uppemot 50% av alla förorenade enheter blodplättar och transfusion av blodplättar som innehåller dessa tre organismer har lett till patientdödlighet 1. Bakteriell rastrering förlitar sig på den bakteriella titer i en blodplättsprodukt vara tillräckligt tillräckligt hög så att åtminstone en organism som finns i typiska 4-8 ml screeningprov. Om bakterie titer är inte tillräckligt hög för att en bakterie som ska fångas i 4-8 ml provvolym är enheten felaktigt flaggas som negativ och det släpps för transfusion. Ett alternativt tillvägagångssätt för bakteriell screening skulle kunna vara att använda en proaktiv process som kan utföras på alla blodplättsenheter och som kan göra de kontaminerande organismer som icke-funktionella. I denna studie har höga halter av bakterier avsiktligt läggs till blodplätts enheter för att testa den totala kapacitetsminskningen av riboflavin och UV-ljus patogener reduktionsprocess. Även bakterie belastningar testas i denna studie vida överstiger de som normalt återfinns i blodprodukter i samband med donationen, hjälper denna studie för att visa att riboflavin och UV-ljus process kan avsevärt minska titer av levande bakterier i ett förorenat enhet blodplätts av 2,6 till 5,4 log (99,7-99,9996% reduktion av kontaminerande bakterier) (Figur 2). För att erhålla en Accurate log värdeminskning, är det viktigt att operatören har god aseptisk teknik tillsammans med exakt pipettering kompetens när de utför de bakteriella titer stegen. Oprecis pipettering vid utförande serieutspädningar kan leda till en ackumulering av fel, således en felaktig titer mätning. De uppgifter som samlats in i denna studie stöder tidigare arbete med riboflavin och UV-ljus, som utmanade systemet mot låg nivå, kliniskt relevant bakteriemi (&lt;20 CFU / enhet). Den tidigare studien var utformad för att efterlikna en verklig klinisk förorening händelse och resultaten visade riboflavin och UV-ljus var effektivt för att förhindra bakterietillväxt under 7-dagars lagring av blodplättar period. Modellering baserad på data från den tidigare studien tyder på att de nuvarande riskbedömningar av bakteriell kontaminering av blodplättar produkter skulle kunna minskas med så mycket som 98% från nuvarande nivåer 8. Den riboflavin och UV-ljus process kan jämföras med bakteriell skärmIng, som endast visade en 66% effektivitet för att detektera bakteriella föroreningar i blodplätts enheter när de utsattes för en kliniskt relevant bakteriehalten 8. Som med all teknik, till PRT behandling av blodplättsprodukter förhindra komplikationer i samband med bakteriellt kontaminerade enheter blodplätts har sina begränsningar. Spårtaxisystem är inte effektiva mot bakteriesporer och inte inaktivera endotoxin, vilket även om ett spårtaxisystem kan inaktivera höga titrar av gramnegativa bakterier resterande endotoxin kan fortfarande orsaka septisk chock hos mottagaren. PRT är bäst utförs tidigt under lagring innan bakterierna kan fortplanta sig till höga titrar. Sammanfattningsvis, vilket framgår av en kombination av dessa två studier är riboflavin och UV-ljus process effektiva för att minska bakterie laster av både gramnegativa och grampositiva organismer och kan erbjuda ett alternativ till bakteriell screening. Rutinmässigt treating trombocytprodukter med riboflavin och UV-ljus har också den fördelen att minska den potentiella överföringen av andra blodburna medel såsom virus och parasiter.

Transfusion av blodplättar, plasma, packade RBC och hela blodprodukter spelar en viktig roll i modern medicin och kan användas för att behandla olika sjukdomstillstånd, byt vitala vätskor och i slutändan rädda liv. Trombocyter är en cellulär produkt som antingen isoleras från helblod och poolas till en transfusable dos eller uppsamlas genom processen av blodplätts aferes. Huvuduppgiften för blodplättar i kroppen är att stoppa blödning vid sårställen och för att upprätthålla hemostas. Patienter som lider av ett lågt antal blodkroppar (trombocytopeni) är känsliga för spontana blödningar och transfusion med blodplättar att ta med sig blodplättar cell räkna tillbaka till ett normalt intervall. Insamlade trombocyter lagras i högst 5-7 dagar och förvaras vid 22 ± 2 ° C under konstant omrörning. Trots livräddande egenskaper hos trombocyttransfusioner kvarstår en liten risk för transfusionsmottagare på grund av contamination av dessa produkter från parasiter, bakterier och virus 11. Genomförandet av viral nukleinsyra testning (NAT) har minskat avsevärt risken för virusöverföring av stora blodburna medel, såsom hepatit C-virus (HCV), hepatit B-virus (HBV) och humant immunbristvirus (hiv) 5. En färsk publikation från de kanadensiska Blood Services uppskattar kvarstående risk för dessa medel att vara en per 8000000 donationer för HIV, en per 6,7 miljoner donationer för HCV och 1 per 1,7 miljoner donationer för HBV 15. Även bakterier samla typiskt mindre uppmärksamhet hos allmänheten, har frekvensen av bakteriell förorening trombocytprodukter uppskattats vara så hög som 1: 1000 7 och eftersom miljontals blodplättsprodukter transfusion varje år många mottagare utsätts för potentiellt livshotande komplikationer liknande sepsis 6. Forskning tyder på att den bakteriella belastningen vid tidpunktenför kontaminering är låg, &lt;100 kolonibildande enheter (CFU) / produkt 2,16, men näringsrika miljön och rumstemperatur lagring gör kontaminerande bakterier att föröka sig till farligt höga halter före transfusion. För närvarande är den enda godkända metoder för att förhindra bakteriellt kontaminerade produkter från att nå en blodplätt mottagare med hjälp av kulturbaserade system och hastig punkt av patientnära testning. I korthet, för kulturbaserade system trombocytprodukter lagras på en bländare vid 22 ° C under 12 till 24 timmar för att tillåta bakterierna att föröka sig i produkten, på vilken en 4-8 ml prov avlägsnas från blodplättsprodukt och inokulerades i en flaska innehållande näringsmedier. Flaskan placeras i ett instrument som övervakar flaskan för bakterietillväxt. Om instrumentet detekterar bakterietillväxt i flaskan den flaggas och motsvarande enhet blodplättskasseras. Även om denna process är tämligen framgångsrik i att upptäcka snabb groving organismer, många av de långsamt växande arter växer inte till en tillräckligt hög titer som skall detekteras, vilket skapar potential för falskt negativa enheter att släppas för transfusion 7,12,14,16,22. Till skillnad från kulturbaserade detektionssystem, är hastig punkt av omsorg som testar vanligen utförs senare i lagringsplätt period då bakteriehalten har ökat markant. De högre titer krävs eftersom punkt vård test är mindre känsliga än odlings baserade system, och endast tillförlitligt detektera bakterier när de når en titer ≥1 x 10 3 CFU / ml 17. Sådana tester kan dock ge resultat inom en timmes provtagning. Variationen i utförandet av dessa tester har lett till utsläpp av ett falskt negativt produkt, vilket orsakar en dödlig septisk reaktion hos mottagaren 9. Ett alternativt sätt att bekämpa problemet med bakteriell kontaminering av blodplättsprodukter är genom rutinmässig användning av en reduktion av patogener process som kan inaktivera kontaminerande bakterier i stället för att försöka upptäcka dem. Använda riboflavin som en fotosensibilisator, i kombination med UV-ljus, har visats reducera infektiviteten av ett brett spektrum av patogena blodburna kontaminanter, innefattande bakterier 3,4,8,10,19-21 .Det användning av riboflavin och UV ljus för patogenreduktion är giftfri och icke-mutagena, och riboflavin och UV-ljus-behandlade komponenter har visat sig vara säkert för transfusionsmottagare såväl som för dem som hanterar blodprodukter 18. I korthet kan riboflavin molekyler associerar med nukleinsyrorna (DNA och RNA) av bakterier, parasiter, virus och eventuella kärnförsedd cell (t.ex. vita blodkroppar). Exponering för UV-ljus aktiveras riboflavin, vilket orsakar en kemisk förändring till funktionella grupper hos nukleinsyrorna (främst guanin baser), vilket således förhindrar replikation och / eller transkription av nukleinsyrorna och lämnar organismen inaktive 13. Kärnfria celler som plattalåter och röda blodkroppar påverkas inte av riboflavin kemi på grund av bristen av nukleinsyra. Tidigare arbete med riboflavin och UV-ljusteknik utvärderas en utvald grupp av bakterier med hjälp av en experimentell design avsedd att efterlikna en plätt produkt förorenad med en kliniskt relevant bakteriehalten (&lt;20 CFU / produkt) 8. Målet med denna studie var att utvärdera riboflavin och UV-ljus process mot hög titer bakteriell kontamination (&gt; 1,0 x 10 5 CFU / ml) i produkter blodplätts behandlats i plasma för att mäta den totala bakteriekapacitetsminskning i systemet. Baserat på data insamlade från hemovigilance studier 1, var en panel av vanligt förekommande gramnegativa och grampositiva organismer ut för utvärdering i denna studie och ingår följande arter: Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mitis, Streptococcus pyogenes, Serratia marcescens, Yersinia enterocolitica ,Brucella neotomae, Bacillus cereus (vegetativa formen), Esherichia coli, Pseudomonas aeruginosa och Klebsiella pneumoniae. Alla organismer utom B. cereus, erhölls från ATCC och en prioritet lades på att få bakteriestammar som hade identifierats som är isolerad från blodkomponenter. B. cereus testas i denna studie är en klinisk stam som isolerats internt från ett förorenat blodplättsprodukt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mirasol Illuminator</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mirasol Treatment/Storage Bag</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hematology Analyzer</td>
			<td>Beckman-Coulter</td>
			<td>Ac&#8226;T diff&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blood Gas Analyzer</td>
			<td>Siemens</td>
			<td>RapidLab 1265&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile Docking Device</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>TSCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Platelet Incubator</td>
			<td>Helmer</td>
			<td>PC2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Orbital Incubator Shaker</td>
			<td>Lab-Line</td>
			<td align="right">4628</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry Incubator</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>Iso-temp</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Class II A/B3 Biosafety Cabinet</td>
			<td>Thermo-forma</td>
			<td align="right">1286</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tubing Sealer</td>
			<td>Sebra</td>
			<td>Smart Sealer II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Table Top Centrifuge</td>
			<td>IEC</td>
			<td>Centra GP8R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">309604</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30 mL Syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">309650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Dilution Tube</td>
			<td>VWR</td>
			<td>211-0058</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL Conical Tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td align="right">430290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>P-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette</td>
			<td>Rainin</td>
			<td>R-200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Repeat Pipette</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td align="right">4780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-200 &#181;L Filter Tip</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4810</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 mL Disposable Serrological Pipette</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4489</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL Disposable Serrological Pipette</td>
			<td>Costar</td>
			<td align="right">4487</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 mL 500 &#181;M Riboflavin</td>
			<td>Terumo BCT</td>
			<td>35 mL 500 &#181;M&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brucella Agar with 5% Horse Blood</td>
			<td>BBL</td>
			<td align="right">221547</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion</td>
			<td>Teknova</td>
			<td>B9993</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peptone Water</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">257087</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Broth</td>
			<td>BD</td>
			<td align="right">299113</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypticase Soy Agar</td>
			<td>Remel</td>
			<td>R01917</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat Inactivated Horse Serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td align="right">26050</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

treatment of platelet products with riboflavin and uv light: effectiveness against high titer bacterial contamination

Förorening av enheter trombocyter av bakterier har länge ansetts som en betydande transfusion risk på grund av sina post-donation lagringsförhållanden. Produkter rutinmässigt lagras vid 22 ° C på en omrörande skakapparat, ett tillstånd som kan främja bakterietillväxt. Även det totala antalet bakterier tros föras in i en blodplättsprodukt är extremt låg, kan dessa bakterier föröka sig till en mycket hög titer före transfusion, vilket kan resultera i allvarliga biverkningar. Syftet med denna studie var att utvärdera en riboflavin baserad patogen reduktionsprocess mot en panel av bakterier som har identifierats som vanliga föroreningar av blodplättsprodukter. Denna panel ingår följande organismer: S. epidermidis, S. aureus, S. mitis, S. pyogenes, S. marcescens, Y. enterocolitica, B. neotomae, B. cereus, E. coli, P. aeruginosa och K. pneumoniae. Varje blodplättsenhet ympades med en hög bakteriehalten och prover avlägsnades both före och efter behandling. En kolonibildande analys, med användning av en slutpunktsspädningsschemat, användes för att bestämma de för-behandlings- och efter-behandlings bakteriella titrar. Log minskning beräknades genom att subtrahera efterbehandlings titer från förbehandlings titer. Följande loggobserverades reducerade värden: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4.0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3.3 log (99,95%), B. neotomae 5,4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E. coli ≥5.4 log (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) och K . pneumoniae 2,8 log (99,8%). Resultaten från denna studie tyder på processen kan bidra till att minska risken för allvarliga biverkningar transfusions händelser i samband med bakteriell kontamination.

Minskningen av elva olika bakteriearter utvärderades med hjälp av riboflavin och UV-ljus baserad PRT process. Dessa medel representerar några av de vanligaste föroreningarna av blodplättsprodukter och omfattar fem grampositiva och sex gramnegativa organismer. Minst sex trombocytprodukter utvärderades per organism och varje produkt ympades med tillräckligt bakterier för att ge&gt; 1,0 x 10 5 CFU / ml slut titer av bakterier i blodplättsprodukt. Före behandling avlägsnades ett prov för att bestämma den förbehandlings titer, varefter produkten plätt var snabbt behandlas med riboflavin och UV processen. Efter behandling av trombocytprodukter följande logg minskningar observerades: S. epidermidis 4,7 log (99,998%), S. aureus 4,8 log (99,998%), S. mitis 3,7 log (99,98%), S. pyogenes 2,6 log (99,7%), S. marcescens 4.0 log (99,99%), Y. enterocolitica 3.3 log (99,95%), B.neotomae 5,4 log (99,9996%), B. cereus 2,6 log (99,7%), E.coli ≥ 5,4 log (99,9996%), P. aeruginosa 4,7 log (99,998%) och K. pneumoniae 2,8 log (99,8%) (Figur 2). Alla enheter träffade systemspecifikationer som angivits ovan för riboflavin och UV-processen. Ytterligare tester reduktion utfördes med S. pyogenes använder buffy coat härledda blodplättar. Ingen signifikant skillnad observerades i minskningen av S. pyogenes i buffy coat härledda blodplättar jämfört aferes blodplättar (data visas ej). <img alt="Tabell 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820table1.jpg" /> Tabell 1: Tillväxt villkor för bakteriearter utvärderas med hjälp av riboflavin och UV-ljus. En panel av både gramnegativa och grampositiva bakterier som har visat att förorena trombocytprodukter valdes ut för denna studie. De tillväxtbetingelser (temperatur och media typ) används för att propagera och titer organismerna visas. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig1.jpg" /> Figur 1: Riboflavin och UV-ljus patogener reduktionsprocess. Riboflavin löstes i 0,9% saltlösning vid en nominell koncentration av 500 pM. Lösningen sterilfiltrerades ansluten och dräneras in i varje blodplättsprodukt. Bakterier tillsattes aseptiskt till varje enhet trombocyter och behandlades sedan med 6,2 J / ml av UV-energi (ca 6-10 min). I detta in vitro studera blodplättenhet efterbehandling samplades för att bestämma den slutliga bakterie titern. <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52820/52820fig2.jpg" /> Figur 2: Minskning av olika bakteriearter när de behandlas med riboflavin och UV-ljus riboflavin och UV-ljus användes för att minska bakterie massor av vanliga bakteriella föroreningar av trombocytprodukter.. Log 10 minskning är skillnadenmellan den genomsnittliga förbehandling titer och den genomsnittliga efterbehandlings titer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52820/52820fig2highres.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination at JoVE.com

Treatment of Platelet Products with Riboflavin and UV Light: Effectiveness Against High Titer Bacterial Contamination

The storage conditions of platelet products create an ideal environment for bacterial contaminants to multiply to dangerous levels. The goal of this study was to use a colony forming assay to evaluate a riboflavin based pathogen reduction process against high titer bacterial contamination in human platelet products.

Behandling av trombocyter Produkter med Riboflavin och UV-ljus: Effektivitet mot hög titer Bakteriell förorening

Contamination of platelet units by bacteria has long been acknowledged as a significant transfusion risk due to their post-donation storage conditions. ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Infection of Zebrafish Embryos with Intracellular Bacterial Pathogens

Infektion av zebrafiskembryon med intracellulära mängden sjukdomsalstrande bakterier

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as a model for studying the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

A Parasite Rescue and Transformation Assay for Antileishmanial Screening Against Intracellular Leishmania donovani Amastigotes in THP1 Human Acute Monocytic Leukemia Cell Line

En parasit Rescue och Transformation analys för Antileishmanial screening mot intracellulära<em&gt; Leishmania donovani</em&gt; Amastigotes i THP1 Human akut monocytisk leukemicellinjen

Leishmaniasis is  one of the world's most neglected diseases, largely affecting the  poorest of the poor, mainly in developing countries. Over 350 million ...

A Tetracycline-regulated Cell Line Produces High-titer Lentiviral Vectors that Specifically Target Dendritic Cells

En Tetracyklin-reglerade cellinje ger hög-titer lentivirusvektorer som specifikt riktar dendritiska celler

Lentiviral  vectors (LVs) are a powerful means of delivering genetic material to many types  of cells. Because of safety concerns associated with these ...

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation and Multi-phenotypic High-content Screening of Coxiella burnetii Transposon Mutants

Generation och multi fenotypisk Hög halt Screening av<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; Transposon Mutanter

Invasion and colonization of host cells by bacterial pathogens depend on the activity of a large number of prokaryotic proteins, defined as virulence ...

Generation of Monoclonal Antibodies Against Natural Products

Generation av monoklonala antikroppar mot naturliga produkter

The analysis of the bioactive components present in foods and natural products has become a popular area of study in many fields, including traditional ...

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

En hög genomströmning Shigella-specifika bakteriedödande analysmetod

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

Opsonophagocytic Killing Assay to Assess Immunological Responses Against Bacterial Pathogens

Lägre dödande Assay att bedöma immunologiska reaktion mot bakteriella patogener

A key aspect of the immune response to bacterial colonization of the host is phagocytosis. An opsonophagocytic killing assay (OPKA) is an experimental ...

Measurement of Specific Mycobacterial Mistranslation Rates with Gain-of-function Reporter Systems

Mätning av specifika Mykobakteriella Mistranöversättningen priser med Gain-of-funktion reporter Systems

The translation of genes into proteins is prone to errors. Although the average rate of translational error in model systems is estimated to be 1/10,000 ...

Application of Consistent Massage-Like Perturbations on Mouse Calves and Monitoring the Resulting Intramuscular Pressure Changes

Tillämpning av konsekvent massage-liknande Perturbations på mus kalvar och övervaka de resulterande intramuskulärt tryckförändringar

Massage is generally recognized to be beneficial for relieving pain and inflammation. Although previous studies have reported anti-inflammatory effects of ...

Production of High-Titer Infectious Influenza Pseudotyped Particles with Envelope Glycoproteins from Highly Pathogenic H5N1 and Avian H7N9 Viruses

Framställning av Högtiter infektiösa influensa Pseudotypade partiklar med kuvert glykoproteiner från högpatogen H5N1 och aviär H7N9 virus

The occasional direct transmission of the highly pathogenic avian influenza A virus H5N1 (HPAI H5N1) and H7N9 to humans and their lethality are serious ...