Name: an aquatic microbial metaproteomics workflow: from cells to tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based analysis
Uploaded: 2015-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis at JoVE.com

The authors would like to acknowledge Marcos Di Falco for his expertise and advice with the preparation of the samples for nano-LC MS/MS as well as Dr. Zoran Minic from the University of Regina for the LC MS/MS analysis. This work was supported by NSERC (DG402214-2011) and CRC (950-221184) funding. D.C. was supported by Concordia Institute for Water, Energy, and Sustainable Systems and FQRNT.

1. Bereiten Reagenzien <ol><li> Vorbereitung SDS-Extraktionslösung: 0,1 M Tris-HCl pH 7,5, 5% Glycerin, 10 mM EDTA und 1% SDS. Filter-Sterilisation mit einem 0,22 um Filter und bei 4 ° C. </li><li> Bereiten stock Reagenzien für die Polyacrylamid-Gel nötig. <ol><li> Bereiten 1,5 M Tris-HCl pH 8,8. Filter-Sterilisation mit einem 0,22 um Filter und bei Raumtemperatur lagern. </li><li> 0,5 M Tris-HCL pH 6,8. Filter-Sterilisation mit einem 0,22 um Filter und bei Raumtemperatur lagern. </li><li> Bereiten Sie 10% SDS. Fi...

<ol>
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T., Kr&#252;ger, S., Jost, G., Labrenz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+unbiased+metatranscriptomics+in+suboxic+waters+of+the+central+Baltic+Sea+using+a+new+in+situ+fixation+system.">Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system.</a> The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).</li></ol>

Probenkonservierung ist der Schlüssel zur metaproteomic Studien und früheren Arbeiten gezeigt, dass ein RNA-Stabilisierungslösung ist eine nützliche Speicherpuffer zum Speichern von Zellen vor der Proteinextraktion 28. Idealerweise würden Proben in situ erhalten werden, um Verschiebungen in der Protein-Expression während der Handhabung 33,34 negieren. In der Tat, in situ Probenahme und Fixierungstechniken sind entwickelt worden, die für die autonome Sammlung und Aufbewahrun...

Mikroorganismen sind allgegenwärtig und spielen eine essentielle Rolle in der Erde biogeochemischen Kreisläufen 1. Derzeit gibt es zahlreiche Ansätze zur Charakterisierung von molekularen mikrobiellen Gemeinschaft Struktur und Funktion zur Verfügung. Am häufigsten ist die Analyse der 16S-rRNA-Gensequenzen aus Umwelt-DNA 2 PCR-amplifizierte - 4. Ein Nachteil des 16S-rRNA-Gen-Analyse ist, dass es nur gibt Auskunft über phylogenetische Identität und Gemeinschaftsstruktur, mit wenig Informationen über die Stoffwechselfunktion. Im Gegensatz dazu Ansätze wie Metagenomik, metatranscriptomics und Metaproteomik Informationen über Community-Struktur und den Stoffwechsel. Metagenomik, oder die Analyse der Gen-Gehalt von einer Ansammlung von Organismen, bietet Informationen über die Struktur und funktionelle Potential der Community 5-8. Obwohl stark, kann dies Funktionspotenzial nicht auf die Stoffwechsel entsprechenAktivitäten der Organismen. Eines Organismus Genotyp von den Genen, von denen jeder zu RNA transkribiert werden und weiter zu Protein translatiert wird, was zu einem Phänotyp repräsentiert. Somit, um das Verständnis der mikrobiellen funktionelle Aktivität in einer Umgebung zu unterstützen, sollte postgenomische Analyse durchgeführt 9 werden. Metatranscriptomics oder die Analyse von RNA-Transkripten ist nützlich, weil es zeigt, welche Gene in einer bestimmten Umgebung transkribiert werden. Jedoch mRNA-Niveaus nicht immer ihre entsprechenden Proteinniveaus entsprechen aufgrund Translationsregulation, RNA-Halbwertszeit und der Tatsache, dass Mehrfachkopien-Protein kann für jede mRNA 10 erzeugt werden. Aus diesen Gründen Metaproteomik wird jetzt als ein wichtiges Instrument zur Umweltmikrobiologie anerkannt. Gemeinsame metaproteomic Analysen verwenden eine Schrotflinte Proteomics Ansatz, wo die in der Nähe vollen Ergänzung der Proteine, die in einer komplexen Probe werden in der Regel durch en gereinigt und gleichzeitig analysiert,enzymatische Verdauung in Peptide und Analysen zu einem Massenspektrometer. Nachfolgende Tandem-Massenspektrometrie (MS / MS) &quot;Peptid-Fingerprinting&quot; wird verwendet, um die Peptidsequenz und potentiellen Proteinherkunfts durch Proteindatenbanksuche (für eine Übersicht siehe 11) zu bestimmen. Proteom-Arbeit hat einen langen Weg in den letzten 25 Jahren dank der Zunahme der genomischen Datenverfügbarkeit und der Erhöhung der Empfindlichkeit und Genauigkeit von Massenspektrometern so dass für Hochdurchsatz-Protein Identifizierung und Quantifizierung 11,12 kommen. Da Proteine ​​sind das Endprodukt der Genexpression kann metaproteomic Daten helfen, festzustellen, welche Organismen in einem bestimmten Umfeld und welche Proteine ​​sie ausdrücken aktiv sind. Dies ist vorteilhaft, wenn versucht wird, zu bestimmen, wie ein bestimmter Satz von Umgebungsvariablen den Phänotyp des Organismus oder Gemeinde betreffen. Schon früh, MS / MS-basierte metaproteomic Studien im Ozean wurden verwendet, um spezifische Proteine ​​gezielt zu identifizierenmikrobielle Abstammungslinien, wobei die erste Studie über die Licht angetrieben Protonenpumpen Proteorhodopsin in SAR11 Meeresbakterien 13. In jüngerer Zeit wurden vergleichende Analysen metaproteomic differentiellen Proteinexpressionsmuster zwischen komplexen Gemeinschaften erläutert. Beispiele hierfür sind die Identifizierung von zeitlichen Verschiebungen im Stoffwechsel in der Küsten Nordwest-Atlantik 14 oder der Antarktischen Halbinsel 5. Andere Studien haben Schwankungen der Proteinexpressionsmuster auf räumlichen Skalen von einem nährstoffarmen Ozean gyre zu einer hoch produktiven Küstenauftriebssystem 15 beschrieben, zum Beispiel entlang einer geographischen Transekt. Für weitere Bewertungen von Metaproteomik empfehlen wir Schneider et al. (2010) 9 und Williams et al. (2014) 16. Gezielte Proteomik ist in den letzten Jahren verwendet worden, um die Expression von spezifischen Stoffwechselwege in die Umgebung 17,18 quantifizieren. There sind drei Hauptphasen in metaproteomic Analyse. Die erste Phase ist die Probenvorbereitung, die Probenentnahme, die Zelllyse und die Konzentration des Proteins umfasst. Probensammlung in Marine Mikrobiologie häufig mit der Filtration von Meerwasser durch einen Vorfilter zu größeren eukaryotischen Zellen, Partikel und Partikel-assoziierten Bakterien zu entfernen, gefolgt von Filtration, für die Abscheidung von frei lebenden Mikrobenzellen, die üblicherweise mit der Verwendung eines 0,22 um Patrone Filtereinheit 19,20. Diese Filter werden in einem Plastikzylinder hüllt und eine Zelllyse und Proteinextraktionsprotokoll, das innerhalb der Filtereinheit durchgeführt werden kann, wäre ein wertvolles Werkzeug ist. Einmal Biomasse erhalten wird, müssen die Zellen lysiert werden, um die Proteinextraktion zu ermöglichen. Mehrere Verfahren können verwendet werden, einschließlich Guanidin-HCl-Lyse 21 und Natriumdodecylsulfat (SDS) basierte Lyseverfahren. Obwohl Detergenzien wie SDS sind sehr effizient bei stören Membranen und Solubilisieren vielen Proteinarten, concentrations von nur 0,1% kann mit nachgeschalteten Proteinverdauung und MS-Analyse 22 stören. Wichtiges Anliegen ist die negative Wirkung von SDS auf Trypsinverdau Effizienz, Auflösungsvermögen von Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie und Ionensuppression oder Ansammlung innerhalb der Ionenquelle 23. Die zweite Phase ist die Fraktionierung und Analyse, wo Proteine ​​einer enzymatischen Verdauung, gefolgt von LC MS / MS-Analyse unterzogen, was zu einer m / z-Fragmentierungsmuster, das verwendet werden kann, um die primäre Aminosäuresequenz des ursprünglichen tryptischen Peptids festzustellen. In Abhängigkeit von den Arten von Waschmitteln, sowie die nachgeschaltete Massenspektrometrie Workflow verschiedene Aufschlußmethoden durchgeführt werden. In unserem Protokoll wird 1-D-PAGE-Elektrophorese, gefolgt von Entfernung von SDS aus dem Gel, um jegliche Verunreinigungen zu entfernen Detergens verwendet wird. Die Analyse von Proteinen, die schwer zu solubilisieren, wie Membranproteine ​​sind, erfordert die Verwendung von hohen Konzentrationen von SDS oder andere Reinigungsmittel. Dies führt zu Kompatibilitätsprobleme mit SDS-Gelelektrophorese. Wenn das Ziel einer Studie erfordert die Solubilisierung dieser schwer Proteine ​​löslich, kann das Rohr-Gel-System verwendet werden 22,24. Das Rohr-Gel-Verfahren enthält Proteine ​​innerhalb der Gel-Matrix ohne die Verwendung von Elektrophorese. Anschließend jegliche Detergenzien zur Solubilisierung verwendet werden, bevor die Proteinverdauung entfernt. Die dritte Phase ist die Bioinformatik-Analyse. In dieser Phase werden die MS / MS Peptid Daten werden mit einer Datenbank von setzten Nukleotidsequenzen durchsucht, um festzustellen, welche Peptide und Proteine ​​in der Probe vorhanden sind. Die Identifizierung von Peptiden ist von der Datenbank gegen gesucht. Meeres metaproteomic Daten werden häufig gegen Datenbanken von Referenzgenome, Metagenom-Daten wie die Global Ocean Sampling-Datensatz 25, ebenso wie einzelne Zelle verstärkt Genome von unkultivierten li umfasst gesuchtneages 26,27. Proteinidentifikation kann auch durch den Einschluss von metagenomic Sequenzen aus der gleichen Probe erhöht, wenn der metaproteomic Daten wurden 5 abgeleitet werden. Hier stellen wir ein Protokoll für die Erzeugung von Peptiden geeignet für MS / MS-basierte Analyse von mikrobiellen Biomasse durch Filtration gesammelt und in einem RNA-Stabilisierungslösung gelagert. Das hier beschriebene Protokoll erlaubt DNA und Protein, von der gleichen Probe, so dass alle Schritte, die zu dem Protein und DNA Fällungen identisch sind, isoliert werden. Aus praktischer Sicht wird weniger Filtration erforderlich, da nur ein Filter ist sowohl für Protein und DNA-Extraktion erforderlich. Wir möchten auch, um zu bestätigen, dass dieses Protokoll wurde durch die Kombination, die Anpassung und Änderung von zwei bisher veröffentlichten Protokollen erstellt. Zelllysis Schritte von Saito et al (2011) 28 angepasst. Und die In-Gel-Trypsin-Verdauung Komponente aus Shevche angepaßtNKO et al. (2007) 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterivex -GP 0.22 &#956;m filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Stabilization Solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>77-86-1 or TB0196-500G</td>
			<td>Protein Extraction/ SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>15-21-3</td>
			<td>Protein Extraction/ SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10K Amicon Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337-4L</td>
			<td>Protein Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td>Protein Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPC Protein Precipitation reagent</td>
			<td>Epicenter</td>
			<td>mmP03750</td>
			<td>DNA Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td>DNA Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Protein Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33211</td>
			<td>Protein Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0375EDU</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CABDH6044-4</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4HCO3</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>1066-33-7</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0507-500ML</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733-4L</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tube 1.5ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL ROBO vial 9mm</td>
			<td>Candian Life Science</td>
			<td>VT009/C395SB</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP BM insert, No spring</td>
			<td>Candian Life Science</td>
			<td>4025P-631</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an aquatic microbial metaproteomics workflow: from cells to tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based analysis

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

Als Demonstration, das Protokoll führten wir auf zwei Meerwasserproben von der Oberfläche und der Chlorophyllmaximum des Küsten Ozean in Nord-Kanada gesammelt. Auf See wurde 6-7 L des Meerwassers durch eine 3 &amp; mgr; GF / D-Vorfilter geleitet, dann mikrobiellen Zellen wurden auf eine 0,22 um-Patronenfiltergerät nach dem Protokoll von Walsh et al. 20 gesammelt. Zellen wurden sofort in einem RNA-Stabilisierungslösung bis zur weiteren Verarbeitung gelagert. Nach der Rückkehr in das Labor, das P...

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An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Ein Aquatic Microbial Metaproteomik Workflow: Von der Zelle zum tryptischen Peptide Geeignet für Tandem-Massenspektrometrie-basierte Analyse

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

Research

JoVE Journal

Environment

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Charakterisierung und Anwendung von Passivsammler für die Überwachung von Pestiziden in Wasser

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Forschung

Umwelt

Alternative Method of Removing Otoliths from Sturgeon

Alternative Verfahren zum Entfernen von Otolithen von Stör

Extracting the otoliths (ear bones) from fish that have very thick skulls can be difficult and very time consuming. The common practice of making a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Extraktion und Analyse von Microbial Phospholipidfettsäuren in Böden

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

A Flow-through Exposure System for Evaluating Suspended Sediments Effects on Aquatic Life

Ein Durchflussbelichtungssystem für die Bewertung Schwebstoffe Auswirkungen auf Leben im Wasser

This paper describes the Fish Larvae and Egg Exposure System (FLEES). The flow-through exposure system is used to investigate the effects of suspended ...

Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells

Grundlagenforschung in der Plasmamedizin - ein Durchsatz von Flüssigkeiten zu Zellen Ansatz

In plasma medicine, ionized gases with temperatures close to that of vertebrate systems are applied to cells and tissues. Cold plasmas generate reactive ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Charakterisierung der aquatischen Biofilme mit Durchflusszytometrie

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Isolierung und Analyse der mikrobiellen Lebensgemeinschaften im Boden, Rhizosphäre und Wurzeln in mehrjährige Grass Experimente

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Experimentelles Protokoll für die Prüfung Verhaltensreaktion Profile in Larval Fish: Anwendung auf die Neuro-Stimulans Koffein

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Zusammensetzung und Verteilungsanalyse Bioaerosole unter verschiedenen Umweltbedingungen

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

Identifizierung von pro- und Polyfluorinated chemische Spezies mit einem kombinierten gezielte und nicht gezielte Screening hochauflösende Massenspektrometrie-Workflow

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...