Name: an aquatic microbial metaproteomics workflow: from cells to tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based analysis
Uploaded: 2015-09-15T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis at JoVE.com

The authors would like to acknowledge Marcos Di Falco for his expertise and advice with the preparation of the samples for nano-LC MS/MS as well as Dr. Zoran Minic from the University of Regina for the LC MS/MS analysis. This work was supported by NSERC (DG402214-2011) and CRC (950-221184) funding. D.C. was supported by Concordia Institute for Water, Energy, and Sustainable Systems and FQRNT.

1. Prepare Reagentes <ol><li> Preparar a solução de extracção SDS-: M de Tris-HCl 0,1 M pH 7,5, glicerol a 5%, EDTA 10 mM e SDS a 1%. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de 0,22? M e armazenamento a 4 ° C. </li><li> Prepare os reagentes necessários para o banco de gel de poliacrilamida. <ol><li> Prepare a 1,5 M de Tris-HCl pH 8,8. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de 0,22? M e armazenamento à temperatura ambiente. </li><li> 0,5 M de Tris-HCl pH 6,8. Filtro-esterilizar utilizando um filtro de 0,22? M e...

<ol>
	<li>Madsen, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microorganisms+and+their+roles+in+fundamental+biogeochemical+cycles.">Microorganisms and their roles in fundamental biogeochemical cycles.</a> Current opinion in biotechnology. 22 (3), 456-464 (2011).</li><li>El-Swais, H., Dunn, K. A., Bielawski, J. P., Li, W. K. W., Walsh, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonal+assemblages+and+short-lived+blooms+in+coastal+northwest+Atlantic+Ocean+bacterioplankton.">Seasonal assemblages and short-lived blooms in coastal northwest Atlantic Ocean bacterioplankton.</a> Environmental microbiology. , (2014).</li><li>Galand, P. E., Potvin, M., Casamayor, E. 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T., Kr&#252;ger, S., Jost, G., Labrenz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measuring+unbiased+metatranscriptomics+in+suboxic+waters+of+the+central+Baltic+Sea+using+a+new+in+situ+fixation+system.">Measuring unbiased metatranscriptomics in suboxic waters of the central Baltic Sea using a new in situ fixation system.</a> The ISME journal. 6 (2), 461-470 (2012).</li></ol>

Preservação das amostras é essencial para estudos metaproteomic e trabalho anterior demonstrou que uma solução de estabilização de ARN é um tampão de armazenamento útil para armazenar as células antes da extracção da proteína 28. Idealmente, as amostras iria ser preservado in situ para negar mudanças na expressão de proteínas durante o manuseamento 33,34. Na verdade, in situ têm sido desenvolvidas tecnologias de amostragem e de fixação, que permitem a recolha a...

Os microrganismos são onipresentes e desempenham um papel essencial nos ciclos biogeoquímicos da Terra 1. Atualmente, existem inúmeras abordagens moleculares disponíveis para a caracterização de estrutura da comunidade microbiana e função. O mais comum é a análise do gene 16S rRNA sequï¿½cias amplificado por PCR a partir de ADN ambiental 2 - 4. Uma desvantagem da análise do gene 16S rRNA é que ela só fornece informações sobre a identidade filogenética e estrutura da comunidade, com pouca informação sobre a função metabólica. Em contraste, abordagens como Metagenômica, metatranscriptomics e metaproteômica fornecer informações sobre a estrutura da comunidade e do metabolismo. Metagenomics, ou a análise do teor de gene de um conjunto de organismos, fornece informação sobre a estrutura e o potencial funcional da comunidade 5 - 8. Embora poderoso, este potencial funcional pode não corresponder ao metabólicaactividades dos organismos. Genótipo de um organismo é representado por seus genes, cada um dos quais pode ser transcrito em RNA e ainda traduzido para proteína, resultando num fenótipo. Assim, para auxiliar na compreensão da actividade funcional microbiano num ambiente, a análise pós-genómico deve ser executada 9. Metatranscriptomics, ou a análise de transcritos de ARN é útil porque revela que os genes são transcritos em qualquer dado ambiente. No entanto, os níveis de mRNA nem sempre coincidir com os seus níveis de proteína correspondentes devido à regulação de translação, meia-vida de ARN, e o facto de várias cópias de proteínas pode ser gerado para cada ARNm de 10. Por estas razões metaproteômica é agora reconhecida como uma importante ferramenta para microbiologia ambiental. Metaproteomic comum analisa usar uma abordagem proteômica shotgun onde o complemento total perto de proteínas em uma amostra complexa são purificados e analisados ​​simultaneamente, geralmente através de endigestão zymatic em peptídeos e análise em um espectrômetro de massa. Espectrometria de massa tandem subsequente (MS / MS) &quot;impressão digital peptídica&quot; é utilizado para determinar a sequência do péptido e proteína potencial de origem pelo banco de dados de proteínas procura (para uma revisão ver 11). Trabalho Proteômica já percorreu um longo caminho nos últimos 25 anos, graças ao aumento da disponibilidade de dados genômicos e do aumento da sensibilidade e precisão dos espectrômetros de massa permitindo high-throughput identificação e quantificação de proteínas 11,12. Uma vez que as proteínas são o produto final da expressão do gene, dados metaproteomic pode ajudar a determinar quais os organismos são activos em qualquer dado ambiente e proteínas que estão a expressar. Isto é vantajoso quando se tenta determinar como um determinado conjunto de variáveis ​​ambientais afetam o fenótipo de um organismo ou comunidade. Logo no início, metaproteomic estudos baseados em MS MS / no oceano foram utilizados para identificar proteínas específicas em alvolinhagens microbianas, com o primeiro estudo focando a luz conduzida da bomba de protões proteorhodopsin em bactérias marinhas SAR11 13. Mais recentemente, análises comparativas metaproteomic elucidaram padrões de expressão de proteínas diferenciais entre as comunidades complexas. Os exemplos incluem a identificação de mudanças temporais no metabolismo do litoral do Noroeste do Atlântico Oceano 14 ou a Península Antártica 5. Outros estudos descrevem variações nos padrões de expressão de proteínas através de escalas espaciais, por exemplo, ao longo de um transecto geográfica de um giro oceânico baixo em nutrientes para um sistema afloramento costeiro altamente produtiva 15. Para mais comentários de metaproteômica recomendamos Schneider et al. (2010) 9 e Williams et al. (2014) 16. Proteómica alvejados também tem sido empregada nos últimos anos para quantificar a expressão de vias metabólicas específicas no ambiente 17,18. There são três fases principais na análise metaproteomic. A primeira fase é a preparação da amostra, a qual inclui a recolha da amostra, a lise celular e a concentração de proteína. A recolha de amostras em microbiologia marinho frequentemente implica a filtração da água do mar através de um pré-filtro para remover as células eucarióticas maiores, partículas e bactérias associado a partículas, seguido de filtração para a captura de células microbianas de vida livre, normalmente com o uso de um cartucho de 0,22? M 19,20 unidade de filtro. Estes filtros são encaixada num cilindro de plástico e uma lise celular e protocolo de extracção de proteína que pode ser realizada dentro da unidade de filtro seria uma ferramenta valiosa. Uma vez que a biomassa é obtido, as células devem ser lisadas para permitir a extracção de proteína. Vários métodos podem ser empregues, incluindo a guanidina-HCl e sulfato de lise 21 de sódio dodecilo (SDS), métodos baseados em lise. Apesar de detergentes como SDS são muito eficientes em interromper as membranas e solubilizar muitos tipos de proteína, concentrations tão baixo quanto 0,1% pode interferir com a digestão de proteínas a jusante e análise MS 22. De grande preocupação é os efeitos negativos de SDS sobre a eficiência da digestão de tripsina, poder de resolução de cromatografia líquida de fase reversa e de supressão de iões ou acumulação no interior da fonte de iões 23. A segunda fase é de fraccionamento e de análise, onde as proteínas são sujeitas a digestão enzimática seguida por análise por LC MS / MS, o que resulta no padrão de fragmentação am / Z que pode ser usada para determinar a sequência de aminoácidos primária do péptido tríptico inicial. Vários métodos de digestão pode ser realizada de acordo com os tipos de detergentes utilizados, bem como o fluxo de trabalho de espectrometria de massa a jusante. No nosso protocolo, electroforese PAGE 1-D seguido pela remoção do SDS a partir do gel é utilizada de modo a remover qualquer contaminação detergente. A análise de proteínas que são difíceis de solubilizar, tais como proteínas de membrana, requer o uso de alta concentrações de SDS ou outros detergentes. Isto leva a problemas de compatibilidade com eletroforese SDS-gel. Se o objectivo de um estudo requer a solubilização destes difícil de solubilizar proteínas, o sistema de tubos-gel pode ser usada 22,24. O método do tubo-gel incorpora as proteínas no interior da matriz de gel, sem a utilização de electroforese. Posteriormente quaisquer detergentes utilizados para a solubilização são removidos antes da digestão de proteínas. A terceira fase é a análise bioinformática. Nesta fase, os dados de péptidos MS / MS são pesquisados ​​contra uma base de dados de sequências de nucleótidos traduzidas para determinar quais os péptidos e as proteínas estão presentes na amostra. A identificação de péptidos está dependente da base de dados é pesquisado contra. Dados metaproteomic marinhos são comumente procurou contra bancos de dados composta de genomas de referência, dados metagenomic tais como o conjunto de dados de amostragem Oceano Global 25, bem como de células amplificado genomas individuais de li incultaneages 26,27. Identificação de proteínas também pode ser aumentada pela inclusão de sequências metagenomic partir da mesma amostra de dados como o metaproteomic foi derivado 5. Aqui nós fornecemos um protocolo para a geração de péptidos adequados para a análise baseada em MS MS / a partir de biomassa microbiana recolhido por filtração e armazenados numa solução de estabilização de ARN. O protocolo aqui descrito permite a ADN e proteína a ser isolada a partir da mesma amostra, de modo que todos os passos que conduzem à proteína e as precipitações de DNA são idênticas. De uma perspectiva prática, a filtração é menos necessária uma vez que apenas um filtro é necessário tanto para a extracção do ADN e proteína. Gostaríamos também de reconhecer que este protocolo foi criado através da combinação, adaptação e alteração de dois protocolos previamente publicados. Os passos de lise celular são adaptadas de Saito et ai. (2011) 28 e a tripsina em gel digerir componente é adaptado de ShevcheNKO et ai. (2007) 29.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sterivex -GP 0.22 &#956;m filter unit</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>SVGP01050</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater Stabilization Solution</td>
			<td>Ambion</td>
			<td>AM7021</td>
			<td>Sampling</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris&#160;</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>77-86-1 or TB0196-500G</td>
			<td>Protein Extraction/ SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>15-21-3</td>
			<td>Protein Extraction/ SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EDTA</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>6381-92-6</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>56-81-5</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10K Amicon Filter</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>UFC801024</td>
			<td>Protein Extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>179337-4L</td>
			<td>Protein Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetone</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-64-1</td>
			<td>Protein Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MPC Protein Precipitation reagent</td>
			<td>Epicenter</td>
			<td>mmP03750</td>
			<td>DNA Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-Propanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>67-63-0</td>
			<td>DNA Precipitation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit dsDNA BR Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q32850</td>
			<td>DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Qubit Protein Assay kit</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>Q33211</td>
			<td>Protein Quantification</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>57-50-1</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEMED</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0800</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>APS</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0700</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30% Acrylamide</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0158</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SimplyBlue SafeStain</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>LC6060</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycine</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0718</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-mercaptoethanol</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>60-24-2</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laemmli Sample Buffer</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0737</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precision Plus Protein Kaleidoscope Ladder</td>
			<td>Bio Rad</td>
			<td>161-0375EDU</td>
			<td>SDS PAGE gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Acetonitrile</td>
			<td>VWR</td>
			<td>CABDH6044-4</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NH4HCO3</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>1066-33-7</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DTT</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D0632-1G</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Formic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F0507-500ML</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC grade H2O</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>270733-4L</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Iodoacetamide</td>
			<td>Bio Basic</td>
			<td>144-48-9</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Protein LoBind Tube 1.5ml</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>22431081</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2mL ROBO vial 9mm</td>
			<td>Candian Life Science</td>
			<td>VT009/C395SB</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PP BM insert, No spring</td>
			<td>Candian Life Science</td>
			<td>4025P-631</td>
			<td>In-gel Trypsin digest</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an aquatic microbial metaproteomics workflow: from cells to tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based analysis

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and metabolism. Although powerful, metagenomics alone can only elucidate functional potential. On the other hand, metaproteomics enables the description of the expressed in situ metabolism and function of a community. Here we describe a protocol for cell lysis, protein and DNA isolation, as well as peptide digestion and extraction from marine microbial cells collected on a cartridge filter unit (such as the Sterivex filter unit) and preserved in an RNA stabilization solution (like RNAlater). In mass spectrometry-based proteomics studies, the identification of peptides and proteins is performed by comparing peptide tandem mass spectra to a database of translated nucleotide sequences. Including the metagenome of a sample in the search database increases the number of peptides and proteins that can be identified from the mass spectra. Hence, in this protocol DNA is isolated from the same filter, which can be used subsequently for metagenomic analysis.

Como demonstração, foi realizado o protocolo em duas amostras de água do mar coletadas da superfície e camada de clorofila máxima do oceano costeiro no Norte do Canadá. Enquanto no mar, 6-7 L de água do mar foi passado através de um 3 um GF / D pré-filtro, em seguida, as células microbianas foram recolhidos para uma unidade de cartucho de filtro de 0,22 um, seguindo o protocolo de Walsh et ai. 20. As células foram imediatamente armazenadas numa solução de estabilização de ARN, até pro...

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An Aquatic Microbial Metaproteomics Workflow: From Cells to Tryptic Peptides Suitable for Tandem Mass Spectrometry-based Analysis

This protocol is for the extraction and concentration of protein and DNA from microbial biomass collected from seawater, followed by the generation of tryptic peptides suitable for tandem mass spectrometry-based proteomic analysis.

Um Aquatic Microbial metaproteômica fluxo de trabalho: a partir de células para Tryptic Peptides adequado para análise baseada em espectrometria de massa em tandem

Meta-omic technologies such as metagenomics, metatranscriptomics and metaproteomics can aid in the understanding of microbial community structure and ...

Research

JoVE Journal

Environment

Characterization and Application of Passive Samplers for Monitoring of Pesticides in Water

Caracterização e aplicação de amostradores passivos de monitorização de pesticidas em água

Five different water passive samplers were calibrated under laboratory conditions for measurement of 124 legacy and current used pesticides. This study ...

Ambiente

Alternative Method of Removing Otoliths from Sturgeon

Método alternativo de remoção de otólitos de Sturgeon

Extracting the otoliths (ear bones) from fish that have very thick skulls can be difficult and very time consuming. The common practice of making a ...

Extraction and Analysis of Microbial Phospholipid Fatty Acids in Soils

Extração e Análise de Microbial Phospholipid Fatty Acids em solos

Phospholipid fatty acids (PLFAs) are key components of microbial cell membranes. The analysis of PLFAs extracted from soils can provide information about ...

A Flow-through Exposure System for Evaluating Suspended Sediments Effects on Aquatic Life

Um Sistema de Exposição Fluxo através de sedimentação de Efeitos Avaliando suspensos sobre a vida aquática

This paper describes the Fish Larvae and Egg Exposure System (FLEES). The flow-through exposure system is used to investigate the effects of suspended ...

Basic Research in Plasma Medicine - A Throughput Approach from Liquids to Cells

Pesquisa básica em Plasma medicina - uma abordagem de taxa de transferência de líquidos para células

In plasma medicine, ionized gases with temperatures close to that of vertebrate systems are applied to cells and tissues. Cold plasmas generate reactive ...

Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry

Caracterização de biofilmes aquáticos com citometria de fluxo

Biofilms are dynamic consortia of microorganism that play a key role in freshwater ecosystems. By changing their community structure, biofilms respond ...

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Isolamento e análise de comunidades microbianas na rizosfera, solo e raízes em experiências de grama perene

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Experimental Protocol for Examining Behavioral Response Profiles in Larval Fish: Application to the Neuro-stimulant Caffeine

Protocolo experimental pela análise de perfis de resposta comportamental em peixes Larval: aplicação para a Neuro-estimulantes cafeína

Fish models and behaviors are increasingly used in the biomedical sciences; however, fish have long been the subject of ecological, physiological and ...

Composition and Distribution Analysis of Bioaerosols Under Different Environmental Conditions

Composição e análise da distribuição de Bioaerossóis sob diferentes condições ambientais

Variable microorganisms in particulate matter (PM) under different environmental conditions may have significant impacts on human health. In this study, ...

Identifying Per- and Polyfluorinated Chemical Species with a Combined Targeted and Non-Targeted-Screening High-Resolution Mass Spectrometry Workflow

Identificação por- e espécies químicas perfluorados com um fluxo de trabalho combinada alvo e não alvo-triagem de alta resolução de espectrometria de massa

Historical and emerging per- and polyfluoroalkyl substances (PFASs) have garnered significant interest from the public and government agencies from the ...