Name: in vitro and in vivo model to study bacterial adhesion to the vessel wall under flow conditions
Uploaded: 2015-06-11T15:00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions at JoVE.com

Dette arbeidet ble støttet av Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) Vlaanderen G0466.10, 11I0113N; &quot;Eddy Merckx stipend&quot; og &quot;Sporta forskning Grant&quot; for Pediatric Cardiology, UZ Leuven, Belgia (JC); Center for Molecular and Vascular Biology støttes av Programmafinanciering KU Leuven (PF / 10/014), av &quot;Geconcentreerde Onderzoeksacties&quot; (GOA 2009/13) fra Universitetet i Leuven og et forskningsstipend fra Boehringer-Ingelheim.

Dyreforsøk ble godkjent av etisk komité for KU Leuven. 1. Klar Bakterier for in vitro perfusjoner og in vivo eksperimenter <ol><li> Vi brukte S. aureus stamme Newman for alle forsøkene som er beskrevet i dette manuskriptet. S. aureus Newman ble lagret i Brain Heart Infusion (BHI) med 10% glycerol ved -80 ° C. </li><li> Bruk en steril løkke for å skrape de frosne bakterie av og inokulere i 5 ml Tryptic Soy Broth (TSB) O / N ved 37 ° C (OD 600&gt; 3). </li><li> Vask bakteriene ved sentrifugering (2600 g, RT, 5 min) og resuspender den bakterielle pelleten i 5 ml PBS (fosfatbufret saltvann). </li><li> Tilbered en 1 mg / ml oppløsning av 5 (6) -karboksy-fluorescein-N-hydroksysuccinimidylester (karboksy-fluorescein) i etanol. Fortynn 1 mg / ml karboksy-fluorescein-løsning til 150 ug / ml i laboratoriet klasse vann (f.eks MilliQ vann). Beskytt rørene fra lysmed aluminiumsfolie og oppbevar ved -20 ° C. </li><li> Sentrifuger bakterier (2600 xg, RT, 5 min). Resuspender den bakterielle pellet i 800 ul PBS og tilsett 200 ul (sluttkonsentrasjon på 30 ug / ml for perfusjon eksperimenter) eller 400 pl (sluttkonsentrasjon 50 ug / ml for in vivo-forsøk) av 150 ug / ml karboksy-fluorescein-løsning. Beskytte rørene mot lys med aluminiumfolie og inkuberes i 30 minutter ved romtemperatur på en ristemaskin. </li><li> Etter merking, blokk med 6% bovint serumalbumin (BSA) i PBS-løsning. </li><li> Fortynne bakterier ved hjelp av optisk densitometry (OD), en OD 600 av 0,65 for in vitro eksperimenter (tilsvarende ca. 3 x 10 8 kolonidannende enheter (CFU) / ml for S. aureus) og en OD 600 på 1,8 for in vivo eksperimenter ( svarende til ca. 1 x 10 9 CFU / ml for S. aureus) i PBS. Beskytt rørene mot lys med aluminiumsfolie og la på is. </li></ol> 2. In Vitro perfusjon Experiments <ol><li> Belegg av dekkglass <ol><li> Fortynn von Willebrand faktor (VWF) (Haemate P, lager-konsentrasjon 2400 ug / ml) i laboratoriet klasse vann (avionisert destillert) til en sluttkonsentrasjon på 50 ug / ml. </li><li> Fortynn kollagen i isoton glukoseløsning (SKF-løsning, pH 2,7 til 2,9, som leveres av produsenten) til en sluttkonsentrasjon på 160 ug / ml. </li><li> Belegge dekkglass (24 x 50 mm) med VWF eller kollagen ved å slippe 200 ul av belegget på parafilm og sett dekkglass på toppen av dråpene. Dråpen vil spre seg langs overflaten av dekkglasset. </li><li> Inkuber dekkglass i en fuktig beholder i 4 timer ved RT. Løft forsiktig glassene fra Parafilm med en butt nål. Montere dekkglass i den nederste delen av strømningskammeret. </li></ol></li><li> Belegg av plast Slips med endotelceller <ol><li> Coat plast slips(1-brønn cellekulturkammer PCA, Sarstedt, Tyskland) med 1 ml av en 1% gelatinoppløsning i PBS og inkuberes i 30 min ved 37 ° C. Seed humane umbilikalvene endotelceller (HUVECs) på gelatinbelagt plast slips og dyrke dem til 70-80% konfluens. Monter plast slip i den nederste delen av strømningskammeret. </li></ol></li><li> Perfusjon Experiment MERK: En skjematisk oversikt over in vitro perfusjon modellen er vist på figur 1. <ol><li> Utføre in vitro bakteriell adhesjon studier i en mikro-parallell plate strømningskammeret i en laminær skjærspenning mellom 2,5 dyn / cm2 og 20 dyn / cm 2 for å simulere forskjellige fysiologiske strømningsforhold. </li><li> Strømningskammeret (in-house design) består av en metallramme og en perfusjon kammer laget av pleksiglass (poly (metyl) metakrylat (PMMA)). Ved å koble den til en høy nøyaktighet infusjonspumpe (PHD 2000 Infusion, Harvard Apparatus, USA), kan vi generere flow rates mellom 0,0001 mL / min og 220,82 ml / min. </li><li> Koble slangen til den øvre delen av strømningskammeret og injisere medium i produksjonsrøret. Forsiktig plassere den øvre del av strømningskammeret på toppen av bunndelen og montere strømningskammeret. Vær forsiktig for å unngå luftbobler. Injiser 1 ml medium gjennom kammeret for å sikre at kammeret ikke lekker, og for å fjerne overskudd av beleggoppløsning. Unngå luftbobler. </li><li> Plasser musen på en termostyrt varmeputen ved 37 ° C på et mikroskop skuffen. Siden dette er en terminal prosedyre, er det ikke behov for aseptisk strenge prosedyrer. Gjøre et snitt i nærheten av halsvenen, fjern forsiktig høyre side av nakkemuskel og isolere halsvenen fra det omgivende vev. </li><li> Sett opp infusjonspumpe og fluorescens mikroskop. Infusjonspumpe innstillingene er avhengig av sprøyten diameter og ønsket strømningshastighet (se pkt 2.4). Fra nå av, jobbe i et mørkt rom. </li><li> VWF Coating: <ol><li> Fyll en sprøyte med fluorescensmerkede bakterier og koble den til innløpsrøret. Unngå luftbobler. Start infusjonspumpen i 10 min. Infusjonstiden er avhengig av skjærhastigheten, og belegget, bakterier og mediet som brukes og bør representere den stabile tilstanden av vedheft. </li><li> Etter 10 minutter, vaske bort ubundet bakterier ved å forbinde en sprøyte med PBS til innløpsrøret, og start av infusjonspumpen. </li><li> Ta minst 15 bilder eller filmer på forskjellige steder etter vaskeprosessen. Bakterier er små og potensielt vanskelig å fokusere på. Før in vitro strømnings eksperiment kan det egnede fokalplanet bli funnet ved å plassere en dråpe av fluorescensmerkede bakterier på et dekkglass og plassering av dekkglass i strømningskammeret. Deretter søke etter den aktuelle fokusplan og lagre innstillingene. NB: I løpet av in vitro-strømnings eksperiment ta bildene under vasketrinnet (± 5 min etter start) sikrer at kunsignal for heft bakterier er tatt. </li></ol></li><li> Kollagen Coating: <ol><li> Legg 60 ug / ml VWF til de fluorescensmerkede bakterier like før perfusjon. Fyll en sprøyte med fluorescensmerkede bakterier eller fluorescensmerkede bakterier supplert med 60 mikrogram / ml VWF og koble den til innløpsrøret. Unngå luftbobler. Gjenta trinn 2.3.5.2 til 2.3.5.3 </li></ol></li><li> Endotelceller: <ol><li> Aktiver endotelcellene ved perfusjon med en 0,1 mM løsning av Ca 2+ -ionophore A23187 (10 mM stamoppløsning oppløst i dimetylsulfoksid (DMSO)) i DMEM ved den samme skjærhastighet som bakteriell perfusjon i 10 min ved perfusjon med en 0,1 mm. Gjenta trinn 2.3.5.2 til 2.3.5.3. </li></ol></li></ol></li><li> Beregn skjærhastigheten og skjærspenningen som følger. Skjærhastighet = 6Q / hv 2 Hvor: Q: flow rate i ml / min, w: bredde i cm, h: høyde i cm Skjærspenning (τ) = skjær rotteex viskositet (μ) Hvor μ: medium: 0,01 dynes x sek / cm 2, fullblod: 0,04 dynes x sek / cm 2 </li><li> Bildeanalyse <ol><li> Få levende bilder ved hjelp av en omvendt fluorescens mikroskop med en svart og hvit kamera og utvikle ved hjelp av bildebehandlingsprogrammer. Bruk eksponeringstid på 1,5 sek. Ta flere stillbilder (minst 15) tilfeldig fordelt over den belagte overflaten av flyten kammeret og lagre dem i riktig filformat. </li><li> Utfør bildeanalyse med ImageJ. Trekk bakgrunnen for å fjerne glatte kontinuerlige bakgrunn fra bildet (Process - subtrahere Bakgrunn) og definere terskelen for å sette nedre og øvre grenseverdier, segmentere gråtonebilder til funksjoner av interesse. Mål området begrenset til terskelen. </li><li> Sammenligne bakteriell adhesjon, uttrykt som fluorescerende område, for eksempel ved hjelp av statistisk analyse programvare. Sammenligne grupper med enveis ANOVA eller two-tailed Students t- test. Rapportere alle verdier som gjennomsnitt ± standardfeil av middelverdien (SEM). Betrakt en p- verdi på &lt;0,05 signifikant (* p &lt;0,05, ** p &lt;0,01, *** p &lt;0,001). </li></ol></li></ol> 3. I Vivo mesenteriske Perfusjons Model <ol><li> Forberedelse / kirurgi muse <ol><li> Spole musen kvelden før eksperimentet for å begrense avføring. </li><li> Gi en 6-8 uker gamle mus (C57BL / 6) pre-operativ analgesi ved en subkutan injeksjon av buprenorfin (0,1 mg / kg kroppsvekt (BW)) 20-30 min før operasjonen. </li><li> Anesthetize musen ved intra-peritoneal injeksjon av ketamin (125 mg / kg kroppsvekt) og xylazin (12,5 mg / kg kroppsvekt). Sjekk med pedal refleks. Påfør veterinæren salve for å hindre tørrhet. </li><li> Plasser musen på en termostyrt varmeputen ved 37 ° C på et mikroskop skuffen. Siden dette er en terminal prosedyre, er det ikke behov for strenge asceptic prosedyrer. Gjøre et snitt i nærheten av halsvenen, fjern forsiktig høyre side av nakkemuskel og isolere halsvenen fra det omgivende vev. </li><li> Sett inn en to franske venekateter inn i høyre jugularvenen for infusjon av fluorescensmerkede bakterier eller andre løsninger. Åpne bukhulen via et midtlinje abdominal snitt og bruke bomullspinner til å spre mesenterium og å visualisere mesenteriske arteriolar og venular sirkulasjon. </li><li> Plasser musen på høyre side på en gjennomsiktig plate og fest kanylen med tape. Bruk en varm pakke for å hindre nedkjøling. For å hindre dehydrering av vev, slipp 500 ul 0,9% NaCl i tarmen. </li></ol></li><li> Fluorescens mikroskopi av bakteriell adhesjon til den mesenteriske blodsirkulasjonen <ol><li> Arbeid i et mørkt rom. Bruk bomullspinner til å immobilisere fartøyene og visualisere dem under en invertert mikroskop. </li><li> Topisk anvendelse 5 ul av en 10 mM løsning of Ca 2+ -ionophore A23187 ble oppløst i DMSO. Etter 10 sek, injisere 100 ul merket bakterier (se trinn 1) gjennom vena kateteret. Ta time-lapse bilder. Etter at forsøket er ferdig, avlive mus i henhold til institusjonelle vedtatte retningslinjer. </li></ol></li><li> Bildeanalyse <ol><li> Skaffe live bilder med en omvendt fluorescens mikroskop, tatt med en svart og hvit kamera og utviklet ved hjelp av noen bildebehandlingsprogrammer. Anvende automatisert eksponeringstid og kontrast optimalisering spesifikk for det anvendte utstyr. </li><li> Tilegne tid-lapse bilder ved hjelp av &quot;acquisition&quot; verktøyet i verktøylinjen (Multidimensional oppkjøp - Time) bruker 40 sykluser av 1000 bilder / sek. Lagre bildene på en hensiktsmessig bildefil format. </li><li> Prosess bilder med ImageJ analyse programvare for å måle arealet av fluorescerende signal per bilde. Definere terskelen for å sette nedre og øvre grenseverdier, segmentere gråtonebilder til fsjoner av interesse. Identifiser regionen av interesse (blodkar) og måle området begrenset til terskelen og regionen av interesse. Sammenligne bakteriell adhesjon, uttrykt som fluorescerende området ved hjelp av statistisk eller graf programvare. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Vanassche, T., Peetermans, W. E., Herregods, M. C., Herijgers, P., Verhamme, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-thrombotic+therapy+in+infective+endocarditis.">Anti-thrombotic therapy in infective endocarditis.</a> Expert Rev Cardiovasc Ther. 9 (9), 1203-1219 (2011).</li><li>Heying, R., van de Gevel, J., Que, Y. A., Moreillon, P., Beekhuizen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibronectin-binding+proteins+and+clumping+factor+A+in+Staphylococcus+aureus+experimental+endocarditis:+FnBPA+is+sufficient+to+activate+human+endothelial+cells.">Fibronectin-binding proteins and clumping factor A in Staphylococcus aureus experimental endocarditis: FnBPA is sufficient to activate human endothelial cells.</a> Thromb Haemost. 97 (4), 617-626 (2007).</li><li>Pappelbaum, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultralarge+von+Willebrand+factor+fibers+mediate+luminal+Staphylococcus+aureus+adhesion+to+an+intact+endothelial+cell+layer+under+shear+stress.">Ultralarge von Willebrand factor fibers mediate luminal Staphylococcus aureus adhesion to an intact endothelial cell layer under shear stress.</a> Circulation. 128 (1), 50-59 (2013).</li><li>Claes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adhesion+of+Staphylococcus+aureus+to+the+vessel+wall+under+flow+is+mediated+by+von+Willebrand+factor&#8211;binding+protein.">Adhesion of Staphylococcus aureus to the vessel wall under flow is mediated by von Willebrand factor&#8211;binding protein.</a> Blood. 124 (10), 1669-1976 (2014).</li><li>Thiene, G., Basso, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pathology+and+pathogenesis+of+infective+endocarditis+in+native+heart+valves.">Pathology and pathogenesis of infective endocarditis in native heart valves.</a> Cardiovasc Pathol. 15 (5), 256-263 (2006).</li><li>Sixma, J. J., Schiphorst, M. E., Verweij, C. L., Pannekoek, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+deletion+of+the+A1+domain+of+von+Willebrand+factor+on+its+binding+to+heparin,+collagen+and+platelets+in+the+presence+of+ristocetin.">Effect of deletion of the A1 domain of von Willebrand factor on its binding to heparin, collagen and platelets in the presence of ristocetin.</a> Eur J Biochem/FEBS. 196 (2), 369-375 (1991).</li><li>Theilmeier, G., Lenaerts, T., Remacle, C., Collen, D., Vermylen, J., Hoylaerts, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Circulating+activated+platelets+assist+THP-1+monocytoid/endothelial+cell+interaction+under+shear+stress.">Circulating activated platelets assist THP-1 monocytoid/endothelial cell interaction under shear stress.</a> Blood. 94 (8), 2725-2734 (1999).</li><li>Bjerketorp, J., Jacobsson, K., Frykberg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+von+Willebrand+factor-binding+protein+(vWbp)+of+Staphylococcus+aureus+is+a+coagulase.">The von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of Staphylococcus aureus is a coagulase.</a> FEMS Microbiol Lett. 234 (2), 309-314 (2004).</li><li>Friedrich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylocoagulase+is+a+prototype+for+the+mechanism+of+cofactor-induced+zymogen+activation.">Staphylocoagulase is a prototype for the mechanism of cofactor-induced zymogen activation.</a> Nature. 425 (6957), 535-539 (2003).</li><li>Vanassche, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fibrin+formation+by+staphylothrombin+facilitates+Staphylococcus+aureus-induced+platelet+aggregation.">Fibrin formation by staphylothrombin facilitates Staphylococcus aureus-induced platelet aggregation.</a> Thromb Haemost. 107 (6), 1107-1121 (2012).</li><li>Vanassche, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+staphylothrombin-mediated+fibrin+deposition+in+catheter-related+Staphylococcus+aureus+infections.">The role of staphylothrombin-mediated fibrin deposition in catheter-related Staphylococcus aureus infections.</a> J Infect Dis. 208 (1), 92-100 (2013).</li><li>Buerkle, M. A., Lehrer, S., Sohn, H. Y., Conzen, P., Pohl, U., Kr&#246;tz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+inhibition+of+cyclooxygenase-2+enhances+platelet+adhesion+in+hamster+arterioles+in+vivo.">Selective inhibition of cyclooxygenase-2 enhances platelet adhesion in hamster arterioles in vivo.</a> Circulation. 110 (14), 2053-2059 (2004).</li><li>Kim, K. H., Barazia, A., Cho, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+imaging+of+heterotypic+platelet-neutrophil+interactions+on+the+activated+endothelium+during+vascular+inflammation+and+thrombus+formation+in+live+mice.">Real-time imaging of heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice.</a> J Vis Exp. 2 (74), (2013).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Skjærspenning er en avgjørende faktor for den tidlige bakteriell adhesjon til beholderveggen, og for den etterfølgende dannelse av endovaskulær eller endokardiale vegetasjoner og metastatiske infeksjoner 4,5. Vi beskrevet komplementær in vitro og in vivo modeller for å undersøke patogenesen av endovaskulære infeksjoner under fysiologiske skjærspenning. Disse modellene har tillatt oss å identifisere von Willebrand-faktor-bindende protein (vWbp) som den store S. aureus protein til å samhandle henhold flyt med en skadet vaskulær vegg utsette VWF 4. Endovaskulære infeksjoner, og infeksiøs endokarditt spesielt, er av interesse ikke bare på grunn av sepsis-indusert organsvikt og død, men også på grunn av lokale og fjernt (&#39;metastatiske&#39;) komplikasjoner. Å forårsake infeksiøs endokarditt og metastatisk infeksjoner, bakterier måtte forholde seg til åreveggen og dermed motstå skjærspenning av rennende blod. Meststudier på bakterier virulensfaktorer er utført i statiske forhold. Men kanskje disse etablerte interaksjoner ikke tåler skjærkrefter og studier i henhold strømningsforhold kan avsløre nye, tidligere ikke faktorer i bakterier-host samspill. Ved hjelp av mikro-parallelle strømningskammeret, har vi og andre vist betydningen av VWF for vaskulær adhesjon. Under skjærspenning, VWF gradvis utfolder seg fra sin hvile kuleformet struktur, og eksponerer A1 domene som samhandler med blodplater via sin GPIb reseptor 6. Flyt kamre har vært mye brukt til å studere blodplatefunksjon 7. Bemerkelsesverdig, også S. aureus adhesjon i henhold til strømnings krever VWF, og spesielt A1 domenet som er eksponert på skjærkraft. Vi identifiserte vWbp å megle VWF bindende. vWbp er en koagulase som bidrar til S. aureus patofysiologien ved å aktivere vertens protrombin. Staphylothrombin, resulting kompleks av en bakteriell koagulase og protrombin, omdanner fibrinogen til uløselig fibrin 8,9. Våre undersøkelser har vist at vWbp ikke bare aktiverer protrombin, men utløser dannelsen av bakterie fibrin-blodplate-aggregater, som forbedrer adhesjonen til blodkarene i henhold til strømnings 4,10,11. In vitro strømningskamret modellen gjør det mulig å studere de ulike aktørene i bakteriell adhesjon til mobilnettet eller matrikskomponenter. Bakterielle virulens faktorer kan studeres ved hjelp av mutanter eller uskadelige bakterier som uttrykker spesifikke overflateproteiner. Alternativt kan farmakologiske inhibitorer eller blokkerende antistoffer tilsettes til mediet i strømningskammeret. Rollen av vertsfaktorer for eksempel ulike bestanddeler av ekstracellulær matriks kan studeres ved hjelp av dekkglass med forskjellige belegg. Objektglassene kan også være dekket med endotelceller, hvor aktiveringsstatusen kan moduleres ved tilsetning av bestemte stimulatorer. Apart fra karveggen, kan bidraget fra vertsblodceller og plasmaproteiner bli studert ved å tilsette disse faktorene til det strømmende mediet. Dermed kan ulike forhold av økende kompleksitet bli studert under standardiserte betingelser for laminær å avdekke interaksjoner som tillater bakterier å følge åreveggen in vivo. Interaksjoner identifisert i in vitro modellen blir deretter undersøkt i en dyremodell for å teste deres relevans i et kompleks organisme. Andre in vivo modeller for å studere interaksjoner dynamiske henhold strømmen er blitt beskrevet, slik som hamster dorsal skinfold kammeret 12 og cremaster modell 13. Til sammenligning mesenteriske perfusjon modellen beskrevet her gir flere fordeler på grunn av sin brukervennlighet, muligheten til å variere vert genetisk bakgrunn av musene og å vurdere medikamentelle tiltak. I konklusjonen, den beskrevne modellertilbyr muligheten for å studere overflateproteiner ikke bare av S. aureus, men fra mange andre mikroorganismer i ulike verts bakgrunn, for bedre å forstå patogenesen av vaskulære infeksjoner.

To establish endovascular infections, pathogens require a mechanism to adhere to the endothelium, which lines the vessel wall and the inner surface of the heart, and to persist and establish an infection despite being exposed to the shear stress of rapidly flowing blood. The most frequent pathogen causing life-threatening endovascular infections and infective endocarditis is Staphylococcus aureus (S. aureus)1. 
Various bacterial surface-bound adhesive molecules mediate adhesion to host tissue by interacting with extracellular matrix components. These MSCRAMMs (microbial surface components recognizing adhesive matrix molecules) recognize molecules such as fibronectin, fibrinogen, collagen and von Willebrand factor (VWF). MSCRAMMs are important virulence factors of S. aureus and are implicated in the colonization and invasion of the host2. Most studies on these virulence factors have been performed in static conditions, and thus may not be representative for human infections where initial adhesion of the bacteria occurs in flowing blood. 
In the case of bloodstream infections, bacteria need to overcome the shearing forces of flowing blood in order to attach to the vessel wall. Models that investigate the interaction between bacteria and endothelium or subendothelium under flow conditions are therefore of particular interest. 
A recent study showed that the adhesion of S. aureus to blood vessels under shear stress is mediated by VWF3. VWF, a shear stress-operational protein, is released from endothelial cells upon activation. Circulating VWF binds to collagen fibers of the exposed subendothelial matrix. Our group reported that the von Willebrand factor-binding protein (vWbp) of S. aureus is crucial for shear-mediated adhesion to VWF4. 
In this article, we present an in vitro flow chamber model where bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells can be evaluated. To validate the findings from in vitro data, we have developed an in vivo model that visualizes and quantifies the direct interaction of bacteria with the vessel wall and the formation of bacteria-platelet thrombi in the mesenteric circulation of mice, using real-time intravital vascular microscopy.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="border-collapse:
 collapse;width:192pt">
	<colgroup>
		<col span="4" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Brain Heart Infusion (BHI)</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">237500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptic Soy Broth (TSB)</td>
			<td>Oxoid</td>
			<td>CM0129</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14190-169</td>
			<td>D-PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5(6)-carboxy-fluorescein N-hydroxysuccinimidyl ester&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>21878-25MG-F</td>
			<td>fluorescent labeling&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin Fraction V (BSA)</td>
			<td>Roch</td>
			<td colspan="2">10 735 086 001</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Haemate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>PL 15036/0010</td>
			<td>VWF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Horm collagen</td>
			<td>Takeda</td>
			<td align="right">10500</td>
			<td>collagen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1-well PCA cell culture chambers</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td align="center" class="xl63">########</td>
			<td>plastic slips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Temgesic</td>
			<td>Reckitt Benckiser</td>
			<td align="right">283716</td>
			<td>bruprenorphine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anesketin (Ketamin hydrochloride 115 mg/ml (100 mg/ml ketaminum))</td>
			<td>Eurovet</td>
			<td>BE-V136516</td>
			<td>ketamin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>XYL-M 2% (xylazine hydrochloride 23.32 mg/ml (20 mg/ml xylazine))</td>
			<td>VMD Arendonk</td>
			<td>BE-V170581</td>
			<td>xylazine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 french intravenous catheter green</td>
			<td>Portex</td>
			<td colspan="2">200/300/010</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0,9% Sodium chloride (NaCl)</td>
			<td>Baxter Healthcare</td>
			<td>W7124</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cotton swabs</td>
			<td>International Medical Product</td>
			<td align="right">300230</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ca2+-ionophore solution A23187</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td colspan="2">C7522-10 MG</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge 1 ml syringe&#160;&#160;</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">300013</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>26 gauge 1 ml syringe&#160; with needle</td>
			<td>BD Plastipak&#160;</td>
			<td align="right">300015</td>
			<td>intra-peritoneal injection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge 5810-R</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td colspan="2">5811 000.320</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass cover slips (24x50)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>BB02405A11</td>
			<td>Thickness No, 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PHD 2000 Infusion</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td align="right">702100</td>
			<td>High-accuracy Harvard infusion pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axio-observer DI</td>
			<td colspan="2">Carl-Zeiss</td>
			<td>Inverted fluorescence microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td colspan="2">National Institute of Health</td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Graphpad Prism 5,0</td>
			<td colspan="2">Graphpad Software</td>
			<td>Analysis software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AxioCam MRm</td>
			<td colspan="2">Carl-Zeiss&#160;</td>
			<td>Black and white camera</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro and in vivo model to study bacterial adhesion to the vessel wall under flow conditions

For å føre endovaskulære infeksjoner og infeksiøs endokarditt, bakterier må være i stand til å følge fartøyet veggen mens å bli utsatt for skjærspenning av rennende blod. Å identifisere bakterie- og vertsfaktorer som bidrar til vaskulær vedheft av mikroorganismer, er hensiktsmessige modeller som studerer disse interaksjonene under fysiologiske skjærbetingelser nødvendig. Her beskriver vi en in vitro modell strømningskammer som gjør det mulig å undersøke bakteriell adhesjon til forskjellige komponenter i den ekstracellulære matriks eller til endotelceller, og en intravital mikroskopi-modell som er utviklet for direkte å visualisere den første adhesjon av bakterier i innvoller sirkulasjon in vivo . Disse metodene kan brukes til å identifisere de bakterielle og vertsfaktorer som kreves for adhesjon av bakterier i henhold til flyt. Vi illustrerer relevansen av skjærspenning og rollen til von Willebrand-faktor for adhesjon av Staphylococcus aureus med både in vitro og in vivo modell.

S. aureus adhesjon til VWF, er subendotel matriks og endotelceller en skjærspenning avhengig fenomen For å understreke hvilken rolle skjærspenning i samspillet mellom S. aureus og VWF, utførte vi perfusjoner enn VWF-belagte dekkglass ved forskjellige skjærhastigheter (en skjematisk oversikt over in vitro perfusjon modellen er vist i figur 1. Adhesjon av S. aureus til vWF økte med økende skjærhastigheter fra 250 til 2000 sek -1 sek -1 (figur 2), noe som indikerer at høye skjærkrefter, men ikke hemmer forsterke adhesjonen av bakterier til VWF. For å undersøke bidraget av VWF til bakteriell adhesjon til kollagen, hovedkomponenten av subendotel-matriksen, vi perfusert fluorescensmerket S. aureus i løpet av kollagen i nærvær eller fravær av VWF. I fravær av VWF, adhesjon av S. enureus til kollagen avtok med økende skjærhastigheter. Men når VWF var tilstede i mediet, adhesjon av S. aureus økte med økende skjærhastigheter (figur 3). Den in vitro-strømningsmodell gjør det mulig for oss også å undersøke adhesjon av bakterier til endotele celler under strømning. Vi perfusert HUVECs med fluoresceinmerket S. aureus på skjærhastigheter fra 500 til 2000 sek -1. Hvor angitt, ble HUVECs aktiveres med en Ca 2+ -ionophore, å forårsake frigjøring av VWF. Endotelial celleaktivering, og den etterfølgende frigjøring VWF, økt adhesjon av S. aureus (figur 4A), som dannet typiske &quot;trådformede&quot; mønstre av fluorescensmerkede bakterieklynger som er innrettet i retning av skjærkraften (figur 4B), som antyder at bindingen av bakterier langs en ​​lineær-strukket VWF molekyl. Initial in vivobakteriell adhesjon i innvoller vener er mediert av VWF Siden S. aureus er i stand til å følge VWF, brukte vi villtype-mus (vWF + / +) og VWF-manglende mus (vWF - / -) for å undersøke bakteriell adhesjon til den aktiverte beholderveggen in vivo. Sanntids videomicroscopy av innvoller vener tillot in vivo visualisering av sirkulerende fluoresceinmerket S. aureus (skjematisk oversikt av in vivo-perfusjon modellen er vist i figur 5). Etter farmakologisk aktivering av endotel av Ca 2+ -ionophore, observerte vi hurtig lokal akkumulering av enkelte bakterier og aggregater av bakterier til beholderveggen av WT mus (supplerende filmer 1 og 2). Nesten ingen adhesjon av bakterier ble observert på den aktiverte beholderveggen av VWF -deficient mus (supplerende Video 3) sammenlignet med adhesjon i WT mus (figur 6). Fraværet av VWF reduserer evnen til S. aureus å følge den aktiverte åreveggen. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig1.jpg" /> Figur 1. En skjematisk fremstilling av in vitro-strømningsmodell. The in vitro strømningsmodell en multifunksjonell modell, som tillater undersøkelse av forskjellige skjær avhengige mekanismer som bakteriell adhesjon til subendotel-matriksen, men også trombedannelse. Den mikro-parallelle strømningskammeret er plassert på et dekkglass (plast eller glass) med forskjellige belegg av proteiner og endotelceller. Adhesjonen av forskjellige bakterier (appelsin og grå punkter) kan analyseres, og virkningen av tilstedeværelsen av plasmaproteiner, blodplater og fullblod kan evalueres. Fluorescent markører for blodplater (blå ovaler) eller fibrinogNO (blå strenger) kan benyttes i kombinasjon med andre inhibitorer (svarte ovaler) for å skille og bakterielle vertsfaktorer. Representative bilder av bakteriell adhesjon av S. aureus til kollagen belegg i nærvær (nederst) eller fravær (øverst) av VWF vises (skala bar er 100 mikrometer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig2.jpg" /> Figur 2. Klebe S. aureus til vWF øker med økende skjærhastigheter. Micro-parallelle strømningskammeret perfusjon i løpet av VWF belagte (50 ug / ml) med fluorescensmerkede S. aureus Newman på skjærhastigheter på 250 til 2000 sek -1 (sek -1) i medium (n&gt; 5). Alle resultater er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. * P &lt;0,05, ** p &lt;0,01. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig3.jpg" /> Figur 3. Klebe S. aureus til subendotel er skjær- og VWF-avhengig. Micro-parallelle strømningskammeret perfusjon i løpet av belagte kollagen (160 ug / ml) med fluorescensmerkede S. aureus Newman på skjærhastigheter på 250 til 2000 sek -1 i medium (n&gt; 5). VWF (60 ug / ml) var til stede i mediet er angitt. Alle resultater er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. ** P &lt;0,01. <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig4.jpg" /> Figur 4. Klebe S. aureus til aktiverte endotelceller er skjæravhengig. Micro-parallelle strømningskammeret perfusjon i løpet av endotelceller. (A) humant navlevene endotel-celler ble aktivert med Ca 2+ -ionophore A23 187 (0,1 mM), etterfulgt av en 10 min perfusjon av fluorescensmerkede S. aureus Newman på skjærhastigheter på 500 til 2000 sek -1 i medium (n&gt; 5). Alle resultater er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. * P &lt;0,05. (B) Bilde av mikro-parallell strømningskamret perfusjon over aktiverte HUVECs med S. aureus ved en skjærhastighet på 1000 sek -2. S. aureus danner strenger av ± 200 mikrometer lengde, noe som tyder vedheft til vWF multimerene (skala bar er 100 mikrometer). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig5.jpg" /> Figur 5. En skjematisk oversikt av in vivo-modell mesenteriske perfusjon. En høyre halsvenekateter (gul linje) er innsatt for administrering av fluorescently merket bakterier (oransje prikker), ekstra anestetika eller andre komponenter som for eksempel farmasøytiske hemmere og antistoffer. Bukhulen åpnes, og mesenterium spres for å visualisere blodårer (venøse og arterielle) under et fluorescensmikroskop. Etter farmakologisk aktivering av endotel ved et Ca 2+ -ionophore, som induserer frigjøring av VWF, bakterier kan bli injisert gjennom vena jugularis kateteret. Sanntidsintravideomikroskopi tillater in vivo visualisering av sirkulerende fluorescensmerkede bakterier og den resulterende dannelsen av bakterieplate tromber. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/52862fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52862/52862fig6.jpg" /> Figur 6. Den opprinnelige adhesjon av S. aureustil aktivert endotel in vivo er mediert av VWF In vivo venøs perfusjon mesenteriske modell med C57BL / 6- vWF + / + og C57BL / 6- vWF -. / - mus. Vedheft av fluorescensmerkede S. aureus til den lokalt aktiverte beholderveggen er betydelig lavere i vWF - / - mus. Alle resultater er uttrykt som gjennomsnitt ± SEM. *** P &lt;0,001, n&gt; 7. <img alt="Video Figur 1" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV1.jpg" /> Video 1: Real-time heft S. aureus til aktivert åreveggen i vWF + / + mus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video1JorienClaes.mov" target="_blank">Klikk her for å se denne videoen.</a> Video 2: Sanntidsaggregatdannelse og embolisering av S. aureus i vWF + / + mus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video2JorienClaes.mov" target="_blank">Klikk her for å se denne videoen.</a> <img alt="Video Figur 3" src="/files/ftp_upload/52862/52862figV3.jpg" /> Video 3: Real-time heft S. aureus til aktivert karvegg i vWF - / -. mus In vivo mesenteriske perfusjon modell med vWF + / + og vWF - / - mus. Fem ul av en Ca 2+ -ionophore (10 mm) var applied til det område av visualisert karseng. En suspensjon av karboksy-fluorescein-merket S. aureus ble injisert gjennom vena kateteret. Den mesenterisk sirkulasjon ble visualisert under en invertert mikroskop. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52862/Video3JorienClaes.mov" target="_blank">Klikk her for å se denne videoen.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions at JoVE.com

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

In vitro og in vivo modell for å studere bakteriell adhesjon til fartøyet veggen under strømningsforhold

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

In Vitro Assay of Bacterial Adhesion onto Mammalian Epithelial Cells

To cause infections, bacteria must colonize their host. Bacterial pathogens express various molecules or structures able to promote attachment to host ...

Introducing Shear Stress in the Study of Bacterial Adhesion

During bacterial infections a sequence of interactions occur between the pathogen and its host. Bacterial adhesion to the host cell surface is often the ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Bruk av kunstig Oppspytt Medium til Test antibiotika effekt mot<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; I Forhold mer relevant for Cystisk fibrose Lung

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Isolation of Human Umbilical Vein Endothelial Cells and Their Use in the Study of Neutrophil Transmigration Under Flow Conditions

Isolering av menneskelige umbilical vein endotelceller og deres bruk i studiet av Neutrofil Sjelevandring Under strømningsforhold

Neutrophils are the most abundant type of white blood cell. They form an essential part of the innate immune system1. During acute inflammation, ...

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

An In vitro Model to Study Heterogeneity of Human Macrophage Differentiation and Polarization

En<em&gt; In vitro</em&gt; Modell for å studere heterogenitet of Human Macrophage Differensiering og Polarisering

Monocyte-derived macrophages represent an important cell type of the innate immune system. Mouse models studying macrophage biology suffer from the ...

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Quantitative In vitro Assay to Measure Neutrophil Adhesion to Activated Primary Human Microvascular Endothelial Cells under Static Conditions

Kvantitativ<em&gt; In vitro</em&gt; Analysen for å måle Neutrophil vedheft til Aktiverte primære humane mikrovaskulær endotelceller under statiske betingelser

The vascular  endothelium plays an integral part in the inflammatory response. During the  acute phase of inflammation, endothelial cells (ECs) are ...

Humanized Mouse Model to Study Bacterial Infections Targeting the Microvasculature

Humanisert mus modell for å studere bakterieinfeksjoner Targeting microvasculature

Neisseria meningitidis causes a severe, frequently fatal sepsis when it enters the human blood stream. Infection leads to extensive damage of the blood ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

En Flow Adhesion analysen til Study leucocyte Rekruttering til humane Sinus endotelet under forhold med Skjær Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

Assay of Adhesion Under Shear Stress for the Study of T Lymphocyte-Adhesion Molecule Interactions

Analyse av Adhesjon Under skjærspenning for studier av T-lymfocytter-adhesjonsmolekyl Interactions

Overall, T cell adhesion is a critical component of function, contributing to the distinct processes of cellular recruitment to sites of inflammation and ...

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli

Overekspresjon og rensing av menneske<em&gt; Cis</em&gt; -prenyltransferase i<em&gt; Escherichia coli</em

Prenyltransferases (PT) are a group of enzymes that catalyze chain elongation of allylic diphosphate using isopentenyl diphosphate (IPP) via multiple ...