Name: isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface
Uploaded: 2015-05-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface at JoVE.com

Detta arbete stöddes av Eunice Kennedy Shriver det nationella institutet av barnhälsa och mänsklig utveckling, NIH / DHHS. Detta arbete stöddes också delvis av Wayne State University Perinatal initiativet i Maternal, perinatal och barns hälsa. Vi tackar Maureen McGerty (Wayne State University) för hennes kritiska läsningar av manuskriptet.

Detta protokoll är lämpligt för leukocyt isolering från decidua basalis och decidua parietalis som förberedelse för immunfenotypning genom flödescytometri. Vidare kan de isolerade cellerna kan användas för cellsortering, cellodling, RNA-isolering, och cytologi. Innan du arbetar med de prover som nämns i detta protokoll, måste mänsklig etiskt godkännande inhämtas från den lokala forskningsetiska kommittén och institutionella prövningsnämnder. Insamling och utnyttjande av mänskliga prover för forskning...

Karakterisering av de funktionella och fenotypiska egenskaper hos infiltrerande leukocyter vid humana moder och foster gränssnitt är väsentlig för förståelsen av de immunmekanismer som leder till graviditetsstörningar. Flera tekniker har beskrivits för att isolera leukocyter från humant moder och foster gränssnitt under hela graviditeten 10,14,25,28,37,42,43. Men var och en av dessa tekniker är distinkt, använder olika enzymer eller enzymkombinationer, kräver olika dissociation gånger, inte ange...

Graviditet kännetecknas av tre distinkta immunologiska faser: 1) implantation och tidig placentation samband med en pro-inflammatorisk respons (dvs liknar implantation ett &quot;öppet sår&quot;); 2) den andra trimestern och det mesta av den tredje trimestern av graviditeten när immun homeostas uppnås genom en övervägande anti-inflammatoriskt tillstånd på moder och foster gränssnitt; och 3) förlossning, en pro-inflammatoriskt tillstånd 1-7. Immunceller spelar en viktig roll i regleringen av det inflammatoriska svaret på moder och foster gränssnitt där deras förekomst och lokalisering förändring under hela graviditeten 6-9. Hos människa representerar moder till foster gränssnitt ett område för direktkontakt mellan moderns (decidua) och foster (chorion eller trofoblasten) vävnader. Detta gränssnitt innefattar: 1) decidua parietalis som linjer livmodern som inte omfattas av moderkakan och är i sammanställningtill chorion laeve; och 2) decidua basalis, som ligger i basalplattan av moderkakan där det invaderas av mellanrums trofoblaster 10 (Figur 1). Intimiteten av dessa kontaktytor skapar förutsättningar för foster antigen exponering för moderns immunförsvar 11-13. Inte överraskande, leukocyter utgöra upp till 30-40% av de decidual cellerna 8,9,14,15 utöver typiska stromal-typ celler och körtelceller 8,14,16. Rollen av leukocyter på moder och foster gränssnitt omfattar flera processer som inkluderar begränsning av trofoblaster invasion 17, ombyggnad av spiral artärer 18,19, underhåll av moderns tolerans 12,20, och initiering av arbetskraften 21-26. Leukocyter för både adaptiva och medfödda lemmar i immunsystemet, det vill säga, T-celler, makrofager, neutrofiler, B-celler, dendritiska celler och NK-celler, har identifierats i decidual vävnader, och derasproportioner och aktiveringsstatus har visat sig variera spatialt och tidsmässigt hela dräktigheten 6-10,12,14,24,27-30. Störningar i leukocytpopulationen och / eller funktion är associerade med spontan abort 31, preeklampsi 32, intrauterin tillväxthämning 32,33, och för tidigt värkarbete 7,24. Därför kommer studiet av de fenotypiska egenskaper och funktioner av leukocyter på mänskliga moder och foster gränssnitt underlätta klarlägga de immunologiska vägar dysreglerad i graviditetsstörningar. En av de mest kraftfulla verktyg som används för att bestämma fenotypen och funktionella egenskaper hos leukocyter är flödescytometri, teknik som gör den kvantitativa analysen av flera parametrar samtidigt 34-36. För att analysera leukocyter från flödescytometri, krävs isolering av leukocyter i en enkelcellsuspension. Därför ett sätt skilja infiltrerande leukocytes från moder till foster gränssnitt behövs för att studera deras fenotypiska och funktionella egenskaper. Flera metoder har beskrivits för att isolera leukocyter från den humana moder och foster gränssnitt 10,14,25,27,37-39. Medan vissa tillämpa mekanisk uppdelning 10,25,27,38, andra använder enzymatisk digestion 37,40 för vävnadsdissociering. Eftersom mekanisk uppdelning ger ett lägre utbyte och minskad livsduglighet 41, och enzymatisk dissociation kan påverka viabiliteten och cellytmarkör retentionen 42, den metod som beskrivs häri kombinerar försiktig mekanisk dissociation med enzymatisk förbehandling för att öka utbytet av isolerade leukocyter utan att äventyra cellviabilitet. En liknande kombination av metoder har visat sig vara effektiv vid isolering av leukocyter från de decidual vävnad vid moder och foster gränssnitt 39. Därför protokollet beskrivet häri innebär mechaniska uppdelning med en automatisk vävnads dissociator som ökar konsekvens samtidigt som du sparar tid och arbete i jämförelse med traditionella mals med motsatta skalpeller, rakblad eller kirurgiska saxar 10,28. Enzymet väljs för vävnadsdissociering var Accutase. Till skillnad från vanligt förekommande kollagenas 43, dispas 44, och trypsin 45, Accutase (en cell lossnar lösning) kombinerar både allmän proteolytisk och kollagenolytiska aktiviteter som bidrar till en effektiv och skonsam dissociation 46,47. Efter dissociation, är leukocyter anrikade från den totala befolkningen i de decidual cellerna genom densitetsgradientcentrifugering. Olika densitetsgradient medier har tidigare utnyttjats, den vanligaste av dessa är Percoll (en suspension av kolloidala kiseldioxidpartiklar) 48 och Ficoll (en polymer av sackaros med en hög syntetisk molekylvikt) 49. Den överlägsna effektivitet av isolering av den sackaros polymeren har varit previously visas 50, och det protokoll som beskrivs häri ytterligare bevisar att detta densitetsgradient media ger en tillräckligt hög renhet av mononukleära leukocyter. Följaktligen, det protokoll som beskrivs häri kombinerar den mekaniska vävnaden disaggregation med en automatisk vävnads dissociator, enzymatisk digerering med en cell avskildhet lösning och leukocyt separation med en densitetsgradient media (1,077 + 0,001 g / ml) för att isolera leukocyter från humana decidual vävnader. Detta protokoll har visat sig bevara cellyteantigener tillsammans med cellviabilitet. De isolerade leukocyter kan användas för flera tillämpningar som inkluderar immunfenotypning med flödescytometri och funktionella studier in vitro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile dissection tools: surgical scissors, forceps, and fine-tip tweezers&#160;</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td>20012-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X phosphate buffered saline (PBS)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td></td>
			<td>(1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large and small Petri dishes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accutase</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11105-01</td>
			<td>(cell detachment solution)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile 2 mL safe-lock conical tubes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 mL conical centrifuge tubes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 &#181;m cell strainers</td>
			<td>FALCON/Corning</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round bottom polystyrene test tubes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipettes</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C tubes</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-237</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cell Culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI culture medium 1640&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>22400-089</td>
			<td>(1X) (10% FBS and 1% P/S)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic chamber slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>177437</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific Corporation</td>
			<td>HEPA Class 100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Water bath</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>ISOTEMP 110</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell counter</td>
			<td>Nexelcom</td>
			<td>Cellometer Auto2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>Olympus CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Cell Separation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS columns</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell separator</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-109</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>30&#956;m pre-separation filters</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-041-40</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Multistand</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15mL safe-lock conical tubes</td>
			<td>Any Vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(0.5% bovine serum albumin, 2mM EDTA and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FcR Blocking</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-059-901</td>
			<td>(Fc Block)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-human cell surface antigen antibodies&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td></td>
			<td>(Table 1)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LIVE/DEAD viability dye</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>564406</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lyse/Fix buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>346202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>(1% BSA, 0.5% Sodium Azide, and 1X PBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Staining buffer&#160;</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554656</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue solution 0.4%</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15250-011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>20% density gradient media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Additional Instruments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator with shaker</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MAXQ 4450</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>LSR-Fortessa</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>SpinChron DLX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vacuum system</td>
			<td>Any vendor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automatic tissue dissociator&#160;</td>
			<td>Miltenyi Biotec</td>
			<td>gentleMACS Dissociator</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of leukocytes from the human maternal-fetal interface

Graviditet kännetecknas av infiltration av leukocyter i reproduktiva vävnader och på moder och foster gränssnitt (decidua basalis och decidua parietalis). Detta gränssnitt är den anatomiska platsen för kontakt mellan moderns och fostervävnader; därför är det en immunologisk ningsställe under graviditet. Infiltrerande leukocyter på moder och foster gränssnitt spelar en central roll vid transplantationer, graviditet underhåll och tidpunkten för leverans. Därför kommer fenotypiska och funktionella karakterisering av dessa leukocyter ge insikt i de mekanismer som leder till graviditet störningar. Flera protokoll har beskrivits för att isolera infiltrera leukocyter från decidua basalis och decidua parietalis; Men bristen på konsekvens i reagens, enzymer och inkubationstider gör det svårt att jämföra dessa resultat. Häri beskrivs är en ny metod som kombinerar användning av milda mekaniska och enzymatiska dissociation tekniker för att bevara livskraften och integritet extracellulära och intracellulära markörer i leukocyter isolerade från mänskliga vävnader på moder och foster gränssnitt. Bortsett från immunfenotypning, cellodling och cellsortering, de framtida tillämpningar av detta protokoll är många och varierande. Efter detta protokoll, kan de isolerade leukocyter användas för att bestämma DNA-metylering, uttryck av målgener, leukocyter vitro funktionalitet (dvs, fagocytos, cytotoxicitet, T-celltillväxt, och plasticitet, etc.) i, och produktionen av reaktiva syreradikaler på moder och foster gränssnitt. Dessutom, med hjälp av den beskrivna protokollet, har detta laboratorium kunnat beskriva nya och ovanliga leukocyter på moder och foster gränssnitt.

. Dissektion av mänskliga vävnader på moder och foster gränssnitt (decidua basalis och decidua parietalis) visas i fig 1 Detta förfarande inbegriper dissektion av basalplattan, vilket inkluderar decidua basalis (Figur 1A - D). Decidua basalis erhålles genom avlägsnande av placenta-villi (fetalt sidan) från basalplattan (Figur 1C). Decidua parietalis uppsamlas genom att försiktigt skrapa den chorionic membran (figur 1E - <strong...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface at JoVE.com

Isolation of Leukocytes from the Human Maternal-fetal Interface

Described herein is a protocol to isolate and further study the infiltrating leukocytes of the decidua basalis and decidua parietalis - the human maternal-fetal interface. This protocol maintains the integrity of cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications as proven by flow cytometry analysis.

Isolering av leukocyter från Human Maternal-foster Interface

Pregnancy is characterized by the infiltration of leukocytes in the reproductive tissues and at the maternal-fetal interface (decidua basalis and decidua ...

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Isolation of Brain-infiltrating Leukocytes

Isolering av Brain-infiltrera leukocyter

We describe a method for preparing brain infiltrating leukocytes (BILs) from mice. We demonstrate how to infect mice with Theiler's murine ...

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolation and Analysis of Brain-sequestered Leukocytes from Plasmodium berghei ANKA-infected Mice

Isolering och analys av Brain-binds Leukocyter från<em&gt; Plasmodium berghei</em&gt; ANKA-infekterade möss

We describe a method for isolation and  characterization of adherent inflammatory cells from brain blood vessels of P. berghei ANKA-infected mice. ...

Isolation of Myeloid Dendritic Cells and Epithelial Cells from Human Thymus

Isolering av myeloida dendritiska celler och epitelceller från Human Thymus

In this protocol we provide a method to isolate dendritic cells (DC) and epithelial cells (TEC) from the human thymus. DC and TEC are the major antigen ...

Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

Bioenergetik och Oxidativ Burst: Protokoll för isolering och utvärdering av humana leukocyter och trombocyter

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

Isolation of Human Monocytes by Double Gradient Centrifugation and Their Differentiation to Macrophages in Teflon-coated Cell Culture Bags

Isolering av humana monocyter från Double gradientcentrifugering och deras differentiering till makrofager i teflonbelagda Cell Culture Väskor

Human macrophages are involved in a plethora of pathologic processes ranging from infectious diseases to cancer. Thus they pose a valuable tool to ...

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Analysera effekterna av stromaceller celler på rekrytering av leukocyter från Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Isolering av leukocyter från Murina vävnader på Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Isolation of Infiltrating Leukocytes from Mouse Skin Using Enzymatic Digest and Gradient Separation

Isolering av infiltrerande leukocyter från mus Skin Använda Enzymatisk Digest och Gradient Separation

Dissociating murine skin into a single cell suspension is essential for downstream cellular analysis such as the characterization of infiltrating immune ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

Human placenta och decidual Organ kulturer att studera Infektioner hos moder och foster gränssnitt

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Isolation of Dendritic Cells from the Human Female Reproductive Tract for Phenotypical and Functional Studies

Isolering av dendritiska celler från mänskliga kvinnliga fortplantningsorganen för fenotypiska och funktionella studier

The characterization of the human dendritic cells (DCs) resident in mucosal tissues is challenging due to the difficulty in obtaining samples, and the low ...