Name: visualization of minisog tagged dna repair proteins in combination with electron spectroscopic imaging (esi)
Uploaded: 2015-09-24T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI at JoVE.com

We thank Dr. Roger Tsien for providing us with the miniSOG constructs. Dr. Xuejun Sun for help with the TEM. Lisa Lem, and Peter Shipple from the Cross Cancer Institute for supplying oxygen. Hilmar Strickfaden holds a postdoctoral fellowship by the Alberta Cancer foundation and was supported by the Bayrische Forschungsallianz. This work was supported by grants from the Canadian Institutes of Health Research and Alberta Cancer Foundation.

1. Generering af miniSOG Cell-linjer <ol><li> Grow U2OS (human osteosarkom) celler i en 35 mm skål indeholdende 2 ml lav glucose Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM), der er suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) ved 37 ° C i en befugtet inkubator med 5% CO2 atmosfære. </li><li> Transficere cellerne, når de er 80% sammenflydende ved lipofektion med renset transfektion kvalitet (A269 / 280-forholdet 1,8-2,0) plasmidkonstruktioner indeholder sekvenser for miniSOG og mCherry mærkede reparatio...

<ol>
	<li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> The Journal of Cell Biology. 190, 165-175 (2010).</li><li>Bazett-Jones, D. P., Hendzel, M. J., Kruhlak, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stoichiometric+analysis+of+protein-+and+nucleic+acid-based+structures+in+the+cell+nucleus.">Stoichiometric analysis of protein- and nucleic acid-based structures in the cell nucleus.</a> Micron (Oxford, England: 1993). 30, 151-157 (1999).</li><li>Michael J Hendzel, F. M. B., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+Visualization+of+a+Protein+Nuclear+Architecture.">Direct Visualization of a Protein Nuclear Architecture.</a> Molecular biology of the cell. 10, 2051 (1999).</li><li>Ottensmeyer, F. P., Andrew, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+microanalysis+of+biological+specimens+by+electron+energy+loss+spectroscopy+and+by+electron+spectroscopic+imaging.">High-resolution microanalysis of biological specimens by electron energy loss spectroscopy and by electron spectroscopic imaging.</a> Journal of ultrastructure research. 72, 336-348 (1980).</li><li>Leapman, R. D., Ornberg, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+electron+energy+loss+spectroscopy+in+biology.">Quantitative electron energy loss spectroscopy in biology.</a> Ultramicroscopy. 24, 251-268 (1988).</li><li>Simon, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+spectroscopic+imaging.">Electron spectroscopic imaging.</a> Ultrastructural pathology. 11, 705-710 (1987).</li><li>Egerton, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Electron Energy-Loss Spectroscopy in the Electron Microscope. , (2011).</li><li>Aronova, M. A., Kim, Y. C., Zhang, G., Leapman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+and+thickness+correction+of+EFTEM+phosphorus+maps.">Quantification and thickness correction of EFTEM phosphorus maps.</a> Ultramicroscopy. 107, 232-244 (2007).</li><li>Hopkins, C., Gibson, A., Stinchcombe, J., Futter, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+molecules+employing+horseradish+peroxidase+as+reporter+enzyme+for+protein+localization+in+the+electron+microscope.">Chimeric molecules employing horseradish peroxidase as reporter enzyme for protein localization in the electron microscope.</a> Methods in enzymology. 327, 35-45 (2000).</li><li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Genetically+Encoded+Tag+for+Correlated+Light+and+Electron+Microscopy+of+Intact+Cells,+Tissues,+and+Organisms.">A Genetically Encoded Tag for Correlated Light and Electron Microscopy of Intact Cells, Tissues, and Organisms.</a> PLoS biology. 9, e1001041 (2011).</li><li>Gaietta, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+and+electron+microscopic+imaging+of+connexin+trafficking.">Multicolor and electron microscopic imaging of connexin trafficking.</a> Science (New York, NY). 296, 503-507 (2002).</li><li>Fernandez-Capetillo, O., Celeste, A., Nussenzweig, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Focusing+on+foci:+H2AX+and+the+recruitment+of+DNA-damage+response+factors.">Focusing on foci: H2AX and the recruitment of DNA-damage response factors.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 2, 426-427 (2003).</li><li>Haaf, T., Golub, E. I., Reddy, G., Radding, C. M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+foci+of+mammalian+Rad51+recombination+protein+in+somatic+cells+after+DNA+damage+and+its+localization+in+synaptonemal+complexes.">Nuclear foci of mammalian Rad51 recombination protein in somatic cells after DNA damage and its localization in synaptonemal complexes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92, 2298-2302 (1995).</li><li>Maser, R. S., Monsen, K. J., Nelms, B. E., Petrini, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=hMre11+and+hRad50+nuclear+foci+are+induced+during+the+normal+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">hMre11 and hRad50 nuclear foci are induced during the normal cellular response to DNA double-strand breaks.</a> Molecular and Cellular Biology. 17, 6087-6096 (1997).</li><li>Bekker-Jensen, S., Mailand, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+and+function+of+DNA+double-strand+break+repair+foci+in+mammalian+cells.">Assembly and function of DNA double-strand break repair foci in mammalian cells.</a> DNA repair. 9, 1219-1228 (2010).</li><li>Chapman, J. R., Sossick, A. J., Boulton, S. J., Jackson, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BRCA1-associated+exclusion+of+53BP1+from+DNA+damage+sites+underlies+temporal+control+of+DNA+repair.">BRCA1-associated exclusion of 53BP1 from DNA damage sites underlies temporal control of DNA repair.</a> Journal of cell science. 125, 3529-3534 (2012).</li><li>Dellaire, G., Kepkay, R., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+resolution+imaging+of+changes+in+the+structure+and+spatial+organization+of+chromatin,+gamma-H2A.X+and+the+MRN+complex+within+etoposide-induced+DNA+repair+foci.">High resolution imaging of changes in the structure and spatial organization of chromatin, gamma-H2A.X and the MRN complex within etoposide-induced DNA repair foci.</a> Cell cycle (Georgetown, Tex). 8, 3750-3769 (2009).</li><li>Kruhlak, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+chromatin+structure+and+mobility+in+living+cells+at+sites+of+DNA+double-strand+breaks.">Changes in chromatin structure and mobility in living cells at sites of DNA double-strand breaks.</a> The Journal of Cell Biology. 172, 823-834 (2006).</li><li>Goodson, H. V., Dzurisin, J. S., Wadsworth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generation+of+stable+cell+lines+expressing+GFP-tubulin+and+photoactivatable-GFP-tubulin+and+characterization+of+clones.">Generation of stable cell lines expressing GFP-tubulin and photoactivatable-GFP-tubulin and characterization of clones.</a> Cold Spring Harbor protocols. 2010, (2010).</li><li>Zeyda, M., Borth, N., Kunert, R., Katinger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+sorting+conditions+for+the+selection+of+stable,+high-producing+mammalian+cell+lines.">Optimization of sorting conditions for the selection of stable, high-producing mammalian cell lines.</a> Biotechnology progress. 15, 953-957 (1999).</li><li>Dellaire, G., Nisman, R., Bazett-Jones, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+light+and+electron+spectroscopic+imaging+of+chromatin+in+situ.">Correlative light and electron spectroscopic imaging of chromatin in situ.</a> Methods in enzymology. , 375-456 (2004).</li><li>Campbell, S., Ismail, I. H., Young, L. C., Poirier, G. G., Hendzel, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polycomb+repressive+complex+2+contributes+to+DNA+double-strand+break+repair.">Polycomb repressive complex 2 contributes to DNA double-strand break repair.</a> Cell cycle. 12, 2675-2683 (2013).</li><li>Mortusewicz, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recruitment+of+RNA+polymerase+II+cofactor+PC4+to+DNA+damage+sites.">Recruitment of RNA polymerase II cofactor PC4 to DNA damage sites.</a> J Cell Biol. 183, 769-776 (2008).</li><li>Bekker-Jensen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+organization+of+the+mammalian+genome+surveillance+machinery+in+response+to+DNA+strand+breaks.">Spatial organization of the mammalian genome surveillance machinery in response to DNA strand breaks.</a> The Journal of Cell Biology. 173, 195-206 (2006).</li><li>Ferrando-May, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Highlighting+the+DNA+damage+response+with+ultrashort+laser+pulses+in+the+near+infrared+and+kinetic+modeling.">Highlighting the DNA damage response with ultrashort laser pulses in the near infrared and kinetic modeling.</a> Frontiers in genetics. 4, 135 (2013).</li><li>Lukas, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+nuclear+bodies+form+around+DNA+lesions+generated+by+mitotic+transmission+of+chromosomes+under+replication+stress.">53BP1 nuclear bodies form around DNA lesions generated by mitotic transmission of chromosomes under replication stress.</a> Nature. 13, 243-253 (2011).</li><li>Harrigan, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Replication+stress+induces+53BP1-containing+OPT+domains+in+G1+cells.">Replication stress induces 53BP1-containing OPT domains in G1 cells.</a> The Journal of Cell Biology. 193, 97-108 (2011).</li><li>Aronova, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprint+of+'Three-dimensional+elemental+mapping+of+phosphorus+by+quantitative+electron+spectroscopic+tomography+(QuEST).">Reprint of 'Three-dimensional elemental mapping of phosphorus by quantitative electron spectroscopic tomography (QuEST).</a> J. Struct. Biol. 161, 322-335 (2007).</li><li>Fussner, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Constitutive+heterochromatin+reorganization+during+somatic+cell+reprogramming.">Constitutive heterochromatin reorganization during somatic cell reprogramming.</a> The EMBO journal. 30, 1778-1789 (2011).</li><li>Kepkay, R., Attwood, K. M., Ziv, Y., Shiloh, Y., Dellaire, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=KAP1+depletion+increases+PML+nuclear+body+number+in+concert+with+ultrastructural+changes+in+chromatin.">KAP1 depletion increases PML nuclear body number in concert with ultrastructural changes in chromatin.</a> Cell cycle. 10, 308-322 (2011).</li></ol>

ESI kan tjene som et glimrende værktøj til at undersøge forskellige tilstande af kromatin og ribonucleoproteiner i kernen, fordi det er i stand til specifikt at kortlægge områder, der er rige på fosfor. Det dybt øger mængden af ​​detaljer, der kan opnås ved et elektronmikroskop og er ikke afhængig af uspecifikke kontrasterende metoder. En ulempe ved ESI er, at det kræver tyndere sektioner end konventionel TEM på samme accelerationsspænding. Dette kan overvindes ved at arbejde med serielle sektioner elle...

På trods af de betydelige fremskridt i lysmikroskopi i de seneste år 1, celle-biologer stadig lider et hul i opløsning. Dette begrænser forståelsen af struktur og funktion i de grundlæggende cellulære processer, der involverer den koordinerede samspil mellem makromolekylære komplekser (fx i kromatin remodeling, DNA-reparation, transskription RNA og DNA-replikation). Selv om transmission elektronmikroskoper (TEM) s tilvejebringe den krævede opløsning, har det været en udfordring at definere disse processer strukturelt grund af manglende evne til at mærke specifikke proteiner samtidig være i stand til at bestemme den biokemiske sammensætning af det visualiserede strukturer. I mangel af interne membraner til at hjælpe differentiere nukleare strukturer, har kernen været særligt udfordrende. Electron spektroskopisk imaging (ESI) løser nogle af disse begrænsninger ved at tillade samtidig påvisning og differentiering af DNA, RNA og protEin-baserede nukleare strukturer 2-5. Electron spektroskopisk imaging: For at kortlægge elementært distributioner ved høj følsomhed og opløsning i elektron mikroskop, kan man bruge en billeddannende spektrometer, der udvælger elektroner, der er blevet uelastisk spredt gennem interaktioner med indre skalelektroner af et element i prøven 6. Fordi element-specifikke mængder af energi går tabt som følge af ionisering af atomer i prøven, kan disse elektroner adskilles og visualiseres under anvendelse af et spektrometer, der er knyttet til elektronmikroskop. Således analyse af spektret af de elektroner, der har interageret med modellen afslører kvalitative og kvantitative oplysninger om grundstofsammensætningen af prøven 7. Elektroner, der ikke mister energi, når de passerer gennem prøven findes i &quot;nul-tab peak&quot; af elektronenergi tabspektrum. Forekomsten af ​​disse elektroner er relateret til massen, densitet og tykkelse af prøven og består af elektroner, der passerer gennem prøven uden at støde ind i prøven eller miste energi under passagen gennem prøven. Disse oplysninger kan være nyttige for absolut kvantificering af antallet af atomer af et specifikt element til stede i prøven 8. Da biologiske prøver består hovedsageligt af lette elementer, der dårligt afbøjer elektronerne i den indfaldende stråle af TEM, farvningsmetoder hjælp tungmetaller salte har skal anvendes for at skabe kontrast i prøven. Manglende specificitet af de fleste af disse kontrastmidler og den manglende evne til at visualisere mere end én plet, hvor specificitet er muligt har begrænset værdien af ​​konventionelle elektronmikroskopi i studiet af kernen. ESI har betydelige fordele i forhold til konventionelle TEM, især til undersøgelse af strukturer i cellekernen.Det er muligt at udnytte fosfor-rige natur DNA- og RNA-holdige makromolekylære komplekser at skelne nukleoprotein komplekser fra proteinkomplekser og løse forskellige nukleoprotein komplekser baseret på deres tæthed af nukleinsyrer. De resterende biologiske materiale kan afbildes baseret på dens overflod af nitrogen. Kortlægning netop disse to elementer og analyser af deres fordeling og relative forekomst inden for forskellige anatomiske strukturer giver os en masse oplysninger om kernen. For eksempel er det let at identificere kromatin og ribosomerne i kortet repræsenterer fosfor overflod. Den interchromatin plads, nukleare pore komplekser, og nukleare organer, på den anden side, kan let påvises i nitrogen kortbilledet. Mini singlet oxygen generator-system (miniSOG) Mens ESI er en kraftfuld teknik til at studere på stedet kromatin struktur, fordi det tagers fordel af de karakteristiske forhold i grundstofsammensætning mellem phosphor og nitrogen, grundstofsammensætningen kan normalt ikke anvendes til at skelne mellem forskellige populationer af protein-komplekser. Antistoffer mærket med små guldpartikler i nanometerområdet er ofte blevet anvendt til at kortlægge placeringen af ​​enkelte molekyler. Da guldpartikler normalt er knyttet til et sekundært antistof, vises den inden for en omkreds på ca. 20 nm omkring epitop detekteres af det primære antistof. I post-embedding prøver kan antistoffer kun afsløre epitoperne, der udsættes på overfladen af ​​sektionerne. Selv om det er muligt at bevise tilstedeværelsen af ​​et antigen og relatere den til en vis anatomisk struktur af cellen, de oplysninger, der opnås, er ufuldstændig, idet de fleste af epitoperne er tilsløret af harpiks. Pre-embedding teknikker, der bruger lignende protokoller til dem, der anvendes til fluorescens mikroskopi, give adgang til antigener i helehele dybden af ​​prøven, men de permeabilisering trin, der er nødvendige for at gøre det muligt for antistoffet at trænge ind i cellen kræver typisk fjernelse af lipidmembraner og fjerne komponenter, der ikke kan fastsættes af aldehyder. Desuden er den foretrukne aldehyd fiksativ for ultrastruktur præservering, glutaraldehyd, almindeligvis ødelægger epitoper og følgelig er paraformaldehyd typisk kræves. Dette er mindre effektive til protein-protein tværbinding. En anden ulempe ved antistoffer, der er mærket med en guld nanopartikel er, at guld er en meget elektron-tætte materiale, der skaber en stærk kontrast, der kan tilsløre interessante strukturelle detaljer af prøven, som har svagere kontrast. Fremkomsten af ​​grønt fluorescerende protein (GFP) som et udtrykt protein tag har forvandlet anvendelse af fluorescensmikroskopi for at besvare spørgsmål i cellebiologi. Mærkning af et protein med en lille fluorescerende domæne tillader kortlægning af dens fordeling in vivo </em&gt; uden behov for permeabilisering procedurer, der kan ændre strukturen. For at omsætte den elegante princippet om anvendelse af protein tags til at kortlægge proteindomæner distributioner i en celle til elektronmikroskopi blev nødvendigt med et system, der er i stand til at frembringe et signal tæt på strukturen af ​​interesse og generere kontrast i TEM. Polymeriseret diaminobenzidin er en plet, der ofte bruges i histologi at detektere antistofbinding. Denne plet er normalt deponeret under anvendelse af peberrodsperoxidase (HRP) konjugeret til et sekundært antistof. Selvom reaktionen frembringer et pålideligt resultat, HRP ikke er katalytisk aktivt i cytosolen af celler 9. Reaktionsprodukter af HRP kan også diffundere væk fra det sted, generation, så at deres opløsning er værre end nanogold metode 10. For at omgå disse problemer blev Flash / ReAsH system udviklet 11. Den består af rekombinante fusionsproteiner, som har en tetracysteine ​​motiv. Dette motiv tillader binding afen biarsenic fluorophor. Når den exciteres, den bundne flash eller ReAsH er i stand til at generere meget reaktive singlet oxygen og dermed photoconvert diaminobenzidin (DAB) i en polymer, der præcipiterer straks ved stedet for de mærkede proteiner. DAB polymer kan farves med osmiumtetroxid, som er elektron tæt og kan således anvendes til at kortlægge fordelingen af ​​det rekombinante fusionsprotein i TEM. I 2011, Shu et al. 10 præsenterede miniSOG, som består af en lille 106 aminosyrer fusion tag afledt af en flavoprotein af Arabidopsis, der er fluorescerende og i stand til at skabe mange singlet oxygenradikaler når den exciteres med 448 nm blå lys. Disse singlet oxygenradikaler kan bruges til foto-oxidere diaminobenzidin til dannelse af polymerer på og nær overfladen af den kodede protein, hvilket er betydeligt tættere end immunoguld mærkede antistoffer 11. Mens flashen / ReAsH system kræver at bringe fluorkrom og diaminobenzidin i cellerne inden man fotoomdannelse, det miniSOG systemet kræver kun diaminobenzidin og lys og derudover er omkring dobbelt så effektiv til polymerisering diaminobenzidin. Her er miniSOG anvendes i kombination med ESI med henblik på at kortlægge ultrastruktur DNA-reparation foci. DNA-reparation foci (DRF) Udbedrede DNA dobbelt strengebrud udgør en alvorlig trussel mod cellen, da de kan føre til translokationer og tab af genetisk information. Til gengæld kan det føre til ældning, cancer og celledød. Mange proteiner, som er involveret i DNA dobbeltstrengsbrud reparation ophobes i foci at samle omkring en DNA dobbeltstrengsbrud 12-14. Selv om deres funktion ikke er kendt, de repræsenterer sitet i kernen, der indeholder DNA dobbeltstrengsbrud og er stedet for DNA dobbeltstrengsbrud reparation. DNA-reparation focI (DRF) er blevet karakteriseret ved fluorescensmikroskopi og de ​​tjener som biomarkører for DNA-skader 12,15. De er massiv i forhold til størrelsen af den dobbelt-strenget pause og blev anset for relativt homogene indtil de seneste mikroskopi studier super-opløsning afslørede visse tegn på sub-opdelingen af molekyler inden for hver fokus 16. For at forstå, hvordan disse steder er organiseret, er det nødvendigt at visualisere alle de underliggende biologiske strukturer i forhold til hinanden. Dette kan ikke opnås ved fluorescens mikroskopi, men er muligt gennem elektronmikroskopi 17,18. Her beskrives en fremgangsmåde, der kombinerer elektron spektroskopiske billeddannelse med miniSOG metode til at illustrere potentialet i denne kombinerede fremgangsmåde til at undersøge ultrastrukturen af ​​DNA dobbelt-strenget pause reparation.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-1.5-14-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gridded 35 mm glass bottom dishes</td>
			<td>MatTek</td>
			<td>P35G-2-14-CGRD&#160;</td>
			<td>not made for immersion objectives</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White: acryl resin</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>14381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LR White accelerator</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>14385</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#8242;-Diaminobenzidine tetrahydrochloride 10 mg tablets</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D5905</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slim Bar Grids 300 Mesh</td>
			<td>SPI</td>
			<td>1161123</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tungsten-Point Lab Pen</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>41148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium Tetroxide</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>19100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Coater 208carbon</td>
			<td>Cressington</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra microtome Leica EM UC6</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Photoshop CS5</td>
			<td>Adobe</td>
			<td></td>
			<td>might even work with older versions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digital Micrograph V.2.30</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td>might even work with older versions</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33342</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H-1399</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Effectene</td>
			<td>Quiagen</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MiniSOG-Constructs</td>
			<td>Tsien-Lab</td>
			<td></td>
			<td><a href="mailto:tsienlab@yahoo.com">tsienlab@yahoo.com</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MDC1 miniSOG mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>53BP1 miniSOG mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rad52 miniSOG mCherry</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cesium 137 radiation source &#34;MARK 1&#34;</td>
			<td>&#160;(J.L. Shepherd &#38; Associated)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ/FiJi</td>
			<td>open source</td>
			<td></td>
			<td>http://fiji.sc/Fiji</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 ml Eppendorf tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>05-408-146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Diamond Knife ultra 35&#176;</td>
			<td>Diatome</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trimming Knife ultratrim</td>
			<td>Diatome</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium cacodylate trihydrate</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>12300</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde EM Grade 8%</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>16020</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>21180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>21190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>19202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmium tetroxide 4% solution</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>19150</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Fluorescence Micoscope Axiovert 200M</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrochloric Acid</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>A142-212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium Hydroxide Solution 10M</td>
			<td>Fluka</td>
			<td>72068</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen</td>
			<td>Medigas</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Amino-1,2,4-triazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium cyanide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>207810</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>15058</td>
			<td>Caution Toxic!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blade Single Edge Carbon Steel</td>
			<td>emsdiasum</td>
			<td>71960</td>
			<td>Caution Sharp!</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D 5546</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>lifetechnologies</td>
			<td>16000-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>G418</td>
			<td>lifetechnologies</td>
			<td>11811-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMSO</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transmission Electron Microscope 200 kV</td>
			<td>JEOL</td>
			<td>2100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GIF Tridiem 863 Energy filter</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of minisog tagged dna repair proteins in combination with electron spectroscopic imaging (esi)

Grænserne for optisk opløsning og udfordringen med at identificere specifikke protein befolkninger i transmission elektronmikroskopi har været forhindringer i cellebiologi. Mange fænomener kan ikke forklares ved in vitro analyse forenklede systemer og har brug for yderligere strukturel information på stedet, især i området mellem 1 nm og 0,1 um, for at blive fuldt forstået. Her elektron spektroskopisk imaging, en transmissionselektronmikroskopi teknik, der tillader samtidig kortlægning af fordelingen af ​​proteiner og nukleinsyrer, og et udtryk tag, miniSOG, kombineres for at studere strukturen og organiseringen af ​​DNA dobbelt-strenget pause reparation foci.

ESI Sammenligning ESI billeder af kernen (figur 1) med de konventionelle TEM billeder (f.eks, figur 7-1) viser en dramatisk stigning i anatomiske strukturer, der let kan skelnes. Kromatin kamme vises i gult, og det er ganske nemt at identificere de chromocenters i muse celler. Nukleoler nemt kan skelnes fra kromatin af deres runde struktur og anden farve, idet den formonterede ribosomer indeholder allerede høje mæ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI at JoVE.com

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging ESI

Electron spectroscopic imaging can image and distinguish nucleic acid from protein at nanometer resolution. It can be combined with the miniSOG system, which is able to specifically label tagged proteins in transmission electron microscopy samples. We illustrate the use of these technologies using double-strand break repair foci as an example.

Visualisering af miniSOG Tagged DNA-reparation Proteiner i Kombination med Electron Spektroskopiske Imaging (ESI)

The limits to optical resolution and the challenge of identifying specific protein populations in transmission electron microscopy have been obstacles in ...

Research

JoVE Journal

Biology

Visualization of miniSOG Tagged DNA Repair Proteins in Combination with Electron Spectroscopic Imaging (ESI)

Genetic Studies of Human DNA Repair Proteins Using Yeast as a Model System 

Understanding the roles of human DNA repair proteins in genetic pathways is a formidable challenge to many researchers.  Genetic studies in mammalian ...

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Imaging Mismatch Repair and Cellular Responses to DNA Damage in Bacillus subtilis

Both prokaryotes and eukaryotes respond to DNA damage through a complex set of physiological changes. Alterations in gene expression, the redistribution ...

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Visualization of MG53-mediated Cell Membrane Repair Using in vivo and in vitro Systems

Repair of acute injury to the cell membrane is an elemental process of normal cellular physiology, and defective membrane repair has been linked to many ...

High-throughput Purification of Affinity-tagged Recombinant Proteins

High-throughput Oprensning af Affinity-mærkede rekombinante proteiner

X-ray crystallography is the method of choice for obtaining a detailed view of the structure of proteins. Such studies need to be complemented by further ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

To-og tre-dimensionelle Live-Cell Imaging af DNA skade responset Proteiner

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Visualization of ATP Synthase Dimers in Mitochondria by Electron Cryo-tomography

Visualisering af ATP synthase Dimerer i mitokondrier af Electron Cryo-tomografi

Electron cryo-tomography is a powerful tool in structural biology, capable of visualizing the three-dimensional structure of biological samples, such as ...

Real-time Imaging of Single Engineered RNA Transcripts in Living Cells Using Ratiometric Bimolecular Beacons

Real-time Imaging af Single Engineered RNA-transkripter i levende celler Brug Ratiometrisk bimolekylær Beacons

The growing realization that both the temporal and spatial regulation of gene expression can have important consequences on cell function has led to the ...

Visualization of Surface-tethered Large DNA Molecules with a Fluorescent Protein DNA Binding Peptide

Visualisering af Surface-tøjret store DNA-molekyler med et fluorescerende protein DNA-bindende peptid

Large DNA molecules tethered on the functionalized glass surface have been utilized in polymer physics and biochemistry particularly for investigating ...

Visualization of DNA Compaction in Cyanobacteria by High-voltage Cryo-electron Tomography

Visualisering af DNA jordpakning i cyanobakterier af høj spænding Cryo-elektron tomografi

This protocol describes how to visualize the transient DNA compaction in cyanobacteria. DNA compaction is a dramatic cytoplasmic event recently found to ...