Name: correlative confocal and 3d electron microscopy of a specific sensory cell
Uploaded: 2015-07-19T14:00:00
Duration: 8 min
Description: Watch this Scientific Journal Video about Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell at JoVE.com

Our sincere appreciation is expressed to the following people: Drs. Sam Johnson and Benjamin Carlson of the Duke Light Microscopy Core Facility for their assistance with data visualization software, and Ms. Valerie Lapham and Dr. John M. Mackenzie, Jr. of the Center for Electron Microscopy at North Carolina State University for their advice on electron microscopy. We thank Dr. Elaine B. Boh&#243;rquez for her editorial assistance. Authors contributed in the following manner: DVB, SM, and RAL designed experiments and analyzed data. DVB performed experiments and FH performed manual rendering of data. SM is director of Renovo Neural, where SBEM data was acquired. DVB wrote the manuscript and all authors reviewed and edited the final manuscript. This work was supported by NIH grants R01DK091946 and Veterans Affairs grant I01BX002230 to RAL, and F32DK094704, to DVB.

<ol>
	<li>White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+nervous+system+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological. 314, 1-340 (1986).</li><li>Smith, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+cell+types,+neurosecretory+cells,+and+body+plan+of+the+early-diverging+metazoan+Trichoplax+adhaerens.">Novel cell types, neurosecretory cells, and body plan of the early-diverging metazoan Trichoplax adhaerens.</a> Current biology : CB. 24, 1565-1572 (2014).</li><li>Denk, W., Horstmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serial+block-face+scanning+electron+microscopy+to+reconstruct+three-dimensional+tissue+nanostructure.">Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure.</a> PLoS biology. 2, e329 (2004).</li><li>Engelstoft, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seven+transmembrane+G+protein-coupled+receptor+repertoire+of+gastric+ghrelin+cells.">Seven transmembrane G protein-coupled receptor repertoire of gastric ghrelin cells.</a> Molecular metabolism. 2, 376-392 (2013).</li><li>Chandra, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoglobulin-like+domain+containing+receptor+1+mediates+fat-stimulated+cholecystokinin+secretion.">Immunoglobulin-like domain containing receptor 1 mediates fat-stimulated cholecystokinin secretion.</a> The Journal of clinical investigation. 123, 3343-3352 (2013).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+stimulate+cholecystokinin+release+through+the+Ca2+-sensing+receptor.">Amino acids stimulate cholecystokinin release through the Ca2+-sensing receptor.</a> Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 300, G528-G537 (2011).</li><li>Rogers, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+activity-triggered+glucagon-like+peptide-1+secretion+from+primary+murine+L-cells.">Electrical activity-triggered glucagon-like peptide-1 secretion from primary murine L-cells.</a> The Journal of physiology. 589, 1081-1093 (2011).</li><li>Boh&#243;rquez, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+enteroendocrine+cell-enteric+glia+connection+revealed+by+3D+electron+microscopy.">An enteroendocrine cell-enteric glia connection revealed by 3D electron microscopy.</a> PloS one. 9, e89881 (2014).</li><li>Boh&#243;rquez, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroepithelial+circuit+formed+by+innervation+of+sensory+enteroendocrine+cells.">Neuroepithelial circuit formed by innervation of sensory enteroendocrine cells.</a> The Journal of clinical investigation. , (2015).</li><li>Knott, G. W., Holtmaat, A., Trachtenberg, J. T., Svoboda, K., Welker, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+preparing+GFP-labeled+neurons+previously+imaged+in+vivo+and+in+slice+preparations+for+light+and+electron+microscopic+analysis.">A protocol for preparing GFP-labeled neurons previously imaged in vivo and in slice preparations for light and electron microscopic analysis.</a> Nature protocols. 4, 1145-1156 (2009).</li><li>Deerinck, T., Bushong, E., Thor, A., Ellisman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> NCMIR methods for 3D EM: a new protocol for preparation of biological specimens for serial block face scanning electron microscopy. , (2010).</li><li>Boh&#243;rquez, D. V., Chandra, R., Samsa, L. A., Vigna, S. R., Liddle, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+basal+pseudopod-like+processes+in+ileal+and+colonic+PYY+cells.">Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells.</a> Journal of molecular histology. 42, 3-13 (2011).</li><li>Nilsson, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+and+immunocytochemical+colocalization+of+peptide+YY+and+enteroglucagon+in+endocrine+cells+of+the+rabbit+colon.">Distribution and immunocytochemical colocalization of peptide YY and enteroglucagon in endocrine cells of the rabbit colon.</a> Endocrinology. 129, 139-148 (1991).</li><li>Mizuhira, V., Futaesaku, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+fixation+method+for+biological+membranes+using+tannic+acids.">New fixation method for biological membranes using tannic acids.</a> Acta Histochem Cytochem. 5, 233-236 (1972).</li><li>Reymond, O. L., Pickett-Heaps, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+routine+flat+embedding+method+for+electron+microscopy+of+microorganisms+allowing+selection+and+precisely+orientated+sectioning+of+single+cells+by+light+microscopy.">A routine flat embedding method for electron microscopy of microorganisms allowing selection and precisely orientated sectioning of single cells by light microscopy.</a> Journal of microscopy. 130, 79-84 (1983).</li><li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fiji:+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis.">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature. 9, 676-682 (2012).</li><li>Boh&#243;rquez, D., Chandra, R., Samsa, L., Vigna, S., Liddle, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+basal+pseudopod-like+processes+in+ileal+and+colonic+PYY+cells.">Characterization of basal pseudopod-like processes in ileal and colonic PYY cells.</a> J Mol Histol. 42, 3-13 (2011).</li><li>Jang, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut-expressed+gustducin+and+taste+receptors+regulate+secretion+of+glucagon-like+peptide-1.">Gut-expressed gustducin and taste receptors regulate secretion of glucagon-like peptide-1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 15069-15074 (2007).</li><li>Liou, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+G-protein-coupled+receptor+GPR40+directly+mediates+long-chain+fatty+acid-induced+secretion+of+cholecystokinin.">The G-protein-coupled receptor GPR40 directly mediates long-chain fatty acid-induced secretion of cholecystokinin.</a> Gastroenterology. 140, 903-912 (2011).</li><li>Reimann, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+sensing+in+L+cells:+a+primary+cell+study.">Glucose sensing in L cells: a primary cell study.</a> Cell metabolism. 8, 532-539 (2008).</li><li>Bohorquez, D. V., Liddle, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axon-like+basal+processes+in+enteroendocrine+cells:+characteristics+and+potential+targets.">Axon-like basal processes in enteroendocrine cells: characteristics and potential targets.</a> Clinical and translational science. 4, 387-391 (2011).</li><li>Batterham, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gut+hormone+PYY(3-36)+physiologically+inhibits+food+intake.">Gut hormone PYY(3-36) physiologically inhibits food intake.</a> Nature. 418, 650-654 (2002).</li><li>Flint, A., Raben, A., Astrup, A., Holst, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucagon-like+peptide+1+promotes+satiety+and+suppresses+energy+intake+in+humans.">Glucagon-like peptide 1 promotes satiety and suppresses energy intake in humans.</a> The Journal of clinical investigation. 101, 515-520 (1998).</li><li>Hayworth, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+ATUM+ultrathin+section+libraries+with+WaferMapper:+a+multi-scale+approach+to+EM+reconstruction+of+neural+circuits.">Imaging ATUM ultrathin section libraries with WaferMapper: a multi-scale approach to EM reconstruction of neural circuits.</a> Frontiers in neural circuits. 8, 68 (2014).</li></ol>

Доктор Сатиш Medicetty является сотрудником и получает 100% зарплаты от Renovo Neural Inc; Однако, это не меняет автора приверженность политике Юпитера на обмена данными и материалами. Нет конфликта интересов не объявлен для остальных авторов.

<html> Желудочно-кишечные chemosensation становится как захватывающий новой области в биомедицинских исследованиях. Это в значительной степени связано с открытием функциональных вкусовых рецепторов в клетках энтероэндокринные 18. Последующие исследования показали, что клетки энтероэндокринные выразить специфические рецепторы для питательных веществ, в том числе углеводов, липидов, аминокислот и 5,6,19,20. Каталитический фактором для этих открытий была разработка репортер мышей, в которых энтероэндокринные клетки флуоресцентно меченных 20. Мы разработали одну из этих мышей, мышь PyyGFP, чтобы изучить энтероэндокринные клетки в дистальном отделе тонкой кишки и толстой кишки 17,21. Эти клетки представляют интерес, поскольку они выделяют PYY и глюкагона, как пептид 1, оба из которых являются индукторы сытости 22,23. В то время, полное ультра-структурной счет этих клеток не хватало, что мы верили было важно, чтобы понять их сигнальные механизмы. ontent &quot;&gt; Здесь мы описали визуально способ преодолеть конфокальной микроскопии с SBEM. Метод называют Cocem3D, что позволило задокументировать полный ультраструктуры клеток энтероэндокринные. Мы сообщили, что эти клетки имеют neuropod, содержащий трех- четверти всех секреторных везикул 8. В рамках neuropod, есть нейрофиламенты и так же, как аксонов, neuropods воспитываются кишечными глиальных клеток 8. Что более важно, это то, что эти neuropods что энтероэндокринные клетки физически подключить к нейронам, иннервирующих кишечник и толстой кишки 9. Один из самых сильных cocem3D является его простота. Уменьшение образца ткани в блок, который может быть отображена с помощью конфокальной и SBEM облегчает идентификацию конкретной ячейки в ткани. Секреторные везикулы и другие органеллы могут быть идентифицированы с легкостью при разрешении 7 нм / пиксел. Так как секции в SBEM отбрасываются, далее процеспеть тканей для выявления специфических белков не вариант на данный момент. Тем не менее, разработка методов, таких как ATUM 24, в котором участки из блока тканей сохраняются, скорее всего, обеспечивают возможность идентификации специфических белков в клетке. Определение конкретного местоположения хемосенсорных рецепторами на клетках энтероэндокринные важная информация для развития лекарственной терапии ожирения, поскольку энтероэндокринные клетки сенсорных интерфейс между пищи в кишечнике и сытости в мозге.

Жизнь внутри клетки происходит во времени и пространстве. Изменения во времени часто изучаются с помощью покадровой микроскопии в сочетании с методами флуоресценции, как супер-разрешением микроскопии. Пространство, в частности, расположение органелл внутри клетки или клетки к клетке взаимодействий, могут быть получены только путем полного счета тонкой структуры клетки. Всеобъемлющий обзор тонкой структуры клетки также могут внести ясность в геномной функции в тех случаях, когда геном доступен, как С. Элеганс нематоды 1 или квартиру placozoa tricoplax слипчивых 2. Серийный секционирования электронная микроскопия теперь воспроизводимым, время эффективным и менее дорогие благодаря задачи для развития автоматизированных технологий 3D электронной микроскопии, как серийный блок-лицевой сканирующей электронной микроскопии (3 SBEM). Необходимость структурной информации выяснения функции очень очевидна в определенной челТипы л где функция зависит от физических клеток в клетки-взаимодействий, такие как нейроны, глия, или сенсорных эпителиальных клеток. Мы особенно заинтересованы в выяснении, как сенсорные сигналы от питательных веществ в просвете кишки трансдуцируют в электрический сигнал, который, в конечном счете модулирует аппетитивных поведения. Схема сложна, но начинается на стенке кишечника, где питательные вещества вступают в контакт с сенсорных эпителиальных клеток, называемых энтероэндокринные клеток. В отличие от других сенсорных эпителиальных клеток, таких как вкусовые клетки, клетки энтероэндокринные рассредоточены по всей эпителии кишок в соотношении один к тысяча 4-7. Следовательно, они были трудно идентифицировать и изучить, и в течение длительного времени они рассматривались только как источник кишечной гормонов. Но с развитием флуоресценции репортерных мышей клеточно-специфической, комплекс сенсорная функция этих клеток становится. Используя один из этих репортеров мышей, пептидный YY-GFP (PyyGFP) мышь, мы обнаружили, что enteroendocrап пара та клетки имеют заметную цитоплазматический хвост, который мы назвали neuropod. Появление neuropods предложил консервативный функцию в клетки к клетке связи. Таким образом, мы полагали, что путем документирования ультраструктуры с энтероэндокринные клетки, функция neuropods может быть получена. Необходимо понять структуру придаток в дисперсной клетки, которое трудно определить было главным обоснованием для разработки метода, чтобы объединить конфокальной микроскопии и SBEM. Клетка интерес был идентифицирован с помощью клеточных конкретных репортер мышей PyyGFP энтероэндокринные. Метод позволил задокументировать весь ультраструктуры в энтероэндокринные клетки и ее neuropod. В neuropods, мы обнаружили, структурные особенности аксонов, так и за пределами neuropods, мы обнаружили, физические отношения к кишечной глии 8. Действительно, neuropods содержат около 70% всех секреторных везикул предлагая существенную роль в секреторной функции этих клеток. Опираясь наструктурные данные, недавно мы обнаружили, что с помощью этих neuropods, энтероэндокринные клетки и нейроны, иннервирующих кишечник образуют нейроэпителиальных схему, аналогичную вкусовых клеток на языке 8,9. Раскрытие такие особенности желудочно-кишечного тракта хемосенсорных механизмов вытекают из структурных данных, собранных с помощью этого метода микроскопии корреляционная. Мы считаем, этот метод может быть полезным и в других областях клеточной биологии, в частности, когда клетки распределены в ткани при очень низкой соотношении. Мы называют методом конфокальной как корреляционного и серийный блок лицевой сканирующей электронной микроскопии в 3D (Cocem3D). Метод состоит из следующих основных этапов: рассечение тканей, конфокальной микроскопии, изображений SBEM, SBEM и конфокальной корреляцию изображения и ручной сегментации. По сравнению с другими методами корреляционного, понятие достаточно просто, потому что корреляция физической, а не химическим.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin sodium salt</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H4784</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>158127</td>
			<td>4%, freshly made in PBS, final pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutaraldehyde</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5882</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dental wax</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>72660</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low-melting agarose</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>16520-100</td>
			<td>5%, freshly made in PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard Tissue-Tek Cryomold</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>62534-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI&#160; nuclear stain</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>D1306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Postively charged glass slides and coverslips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine art paintbrush #1</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cacodylate buffer</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>11650</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tannic acid</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>21700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EMbed 812 kit&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>14120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid releasing agent&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>70880</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liquid silver colloidal&#160;&#160;&#160;</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>12630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CircuitWorks conductive epoxy&#160;&#160;</td>
			<td>ITW Chemtronics</td>
			<td>CW2400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Variable flow peristaltic pump</td>
			<td>VWR</td>
			<td>70730-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VT1200S Vibrating blade microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 780i confocal microscope</td>
			<td>Carl Zeiss&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sigma VP Scanning Electron Microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3view system</td>
			<td>Gatan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Renovo Neural Inc (Cleveland, OH)</td>
			<td></td>
			<td>http://www.renovoneural.com</td>
			<td>Renovo provides 3d EM services</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fiji software</td>
			<td>Open access software</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Computer station with 16GB of RAM or more</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data visualization software Imaris 7.5&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

correlative confocal and 3d electron microscopy of a specific sensory cell

Разграничение ультраструктуры клетки важно для понимания его функции. Это может быть непростой проект редких типов клеток распространяется по всей ткани из различных типов клеток, таких как клетки энтероэндокринные кишечного эпителия. Эти желудочно-кишечные датчики пищи и бактерий, было трудно изучить, потому что они распределены среди других эпителиальных клеток в соотношении 1: 1000. Недавно трансгенные репортер мышей были получены для идентификации энтероэндокринные клетки с помощью флуоресценции. Одним из них является пептид YY-GFP мыши. Используя эту мышь, мы разработали метод соотносить конфокальной и серийный блок-лицевой сканирующей электронной микроскопии. Мы назвали метод cocem3D и применил его для идентификации конкретного энтероэндокринные ячейку в ткани и раскрыть ультраструктуры ячейки в 3D. Разрешение cocem3D достаточно, чтобы идентифицировать органеллы, как малые, как секреторных везикул и отличать клеточные мембраны для объемного Rendering. Cocem3D могут быть легко адаптированы для изучения 3D ультраструктуры других типов конкретных клеток в их нативной ткани.

Метод, представленный здесь, был использован для изучения ультраструктуры определенной ячейке в слое эпителия. Клетка интерес в данном случае является недостижимой энтероэндокринные клеток. Их идентификация в месте стало возможным только в последние несколько лет с развитием флуоресценции репортера мышей клеток конкретных. В 2011 году мы разработали мышь, в которой промоутер гормона PYY запускает экспрессию зеленого флуоресцентного белка 17. В этом PyyGFP мыши, энтероэндокринные клетки дистальной части тонкой кишки и толстой кишки легко отличить под УФ-светом. Эта модель мышь была основой для идентификации блока тканей, содержащий энтероэндокринные клетку и обрабатывать его для SBEM. Корреляционный метод называется здесь cocem3D и был построен на ранее опубликованных протоколов 10,11. Оптимизация размеры блока тканей имеет решающее значение для корреляции. В предварительных экспериментах,было установлено, что в блоке ткани 300 мкм длиной х 50 мкм количество SBEM изображений сводится к минимуму, охватывающий все тело клетки интерес. 1А показывает смотровой рассечения с помощью вибрирующего лезвия microtrome к получить тканей блок с правильными размерами. По крайней мере, 100 блоков получаются до сортировки через них, чтобы забрать тех, с неповрежденными клетками интерес. Отдельные блоки загружаются в конфокальной микроскопии и изображения Z-стеки оптически через каждые 1 мкм (рис 1B и C). Рисунок 1D показывает объем оказываемых вид на энтероэндокринные клетки в подвздошной кишке мыши. Его выдающийся neuropod распространяется под эпителиальных клеток в течение ~ 60 мкм. Клетка интерес найдены корреляции конфокальной Z-стеки с SBEM образ весь блок лице. Пример представлен здесь в квартале от дистального отдела толстой кишки о PyyGFPмышь. После получения конфокальных Z-стеки (фиг.2А), блок встроен в тонкий слой легкоплавкого агарозы (фиг.2В). Это необходимо для последующей манипуляции блока. Важно поддерживать ориентацию блока как можно более плоским, чтобы соответствовать оптические срезы с кусочками SBEM. На фиг.2с, представитель изображение показано всей поверхности блока тканей. Части этой фигуре были ранее опубликованы в Bohorquez др., 2014 8. Это было затем коррелирует с конфокальной изображения, принимая во внимание ориентиров тканей и размеров. Рис 2D показывает наложение конфокальной и SBEM изображение блока, открывая Точное местоположение нашей камеры интересов. После того, как клетки были идентифицированы, изображения SBEM делается при разрешении достаточно высокой, чтобы определить секреторных везикул и другие органеллы клеток. Набор данных представлены онRe была отображена на 7 нм на пиксель, как образы блока были приняты все 70 нм. Множество данных, содержащихся 643 изображений, которые охватывают 45 мкм глубины ткани. Через несколько микрон побрился во время начальной визуализации всей блока лицом при малом увеличении. Сырой набор SBEM данные были получены в формате .dm3 и превращается в .tiff для последующего обращения. Стек SBEM был обрезается с помощью программного обеспечения Фиджи плагин &quot;урожай (3D)&quot; блок содержит только область интереса. Это уменьшает количество оперативной памяти, необходимой для оказания объем. Клетки идентифицировали по ее положение и секреторные пузырьки, и сегментирован с использованием программного обеспечения Imaris. Рисунок 3 содержит визуализация в 3D в энтероэндокринные клетки. <img alt="Фигура 1" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig1.jpg" /> Рисунок 1:. Корреляционный конфокальной микроскопии () Процедура рассекать кусокткани кишечника в ткани блоке 300 х 50 мкм. (Б) представитель ткани Блок правых измерениях. Следует отметить, что блок ткани из этих измерений от мыши тонкой кишки охватывает около 3 ворсинки или, в случае толстой кишки около 8 склепов. (С) ворсинок в тонком кишечнике, содержащего клеток, представляющих интерес. (D), конфокальной г-стек отображаются в 3D с помощью программного обеспечения Imaris показывает энтероэндокринные ячейку с заметным neuropod работает под кишечного эпителия. Синий = DAPI ядерной пятно. Бары = 10 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 2" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig2.jpg" /> Рисунок 2: Последовательный блок-лицо сканирующей электронной микроскопии (А) конфокальной изображение Селе.ИДКТК ткани блок из толстой кишки, содержащей клетки PyyGFP энтероэндокринные (зеленый) интересов. (Б) После того, как блок изображается с помощью конфокальной микроскопии, это то встроенные квартиру в легкоплавких агарозы с помощью стеклянных слайдов. Встраивание блока тканей в агарозном облегчает последующее манипулирование и выемка на левом углу помогает установить блок внутри SBEM в правильной ориентации. (С) SBEM изображение лица блока. (D) Соотношение конфокальной данных с SBEM для выявления клеток, представляющих интерес (белая стрелка). Изображения на С и D этой фигуры изменяются от Бохоркез др., 2014 8. Синий = DAPI ядерной пятно. Бары = 10 мкм. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a> <img alt="Рисунок 3" src="/files/ftp_upload/52918/52918fig3.jpg" /> Рисунок 3:. Оказание данных в 3D () Объем оказание энтероэндокринные ячейки с использованием программного обеспечения Imaris. Ячейка содержит neuropod упакованный с секреторные пузырьки. Для полного описания ультраструктуры в энтероэндокринные клетки, пожалуйста, обратитесь к Бохоркез и др., 2014 8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52918/52918fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell at JoVE.com

Correlative Confocal and 3D Electron Microscopy of a Specific Sensory Cell

Here, we introduce a method, cocem3D, to unveil the ultrastructure of a specific cell in its native tissue by bridging confocal and serial block-face scanning electron microscopy.

Корреляционный конфокальной и 3D Электронная микроскопия конкретного чувственного Cell

Delineation of a cell&#8217;s ultrastructure is important for understanding its function. This can be a daunting project for rare cell types diffused ...

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Флуоресценции на основе измерения магазин управлением поступления кальция в живых клетках: от искусственного раковых клеток в скелетных мышечных волокон

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Correlative Light and Electron Microscopy (CLEM) as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Correlative Light and Electron Microscopy CLEM as a Tool to Visualize Microinjected Molecules and their Eukaryotic Sub-cellular Targets

Корреляционный световой и электронной микроскопии (CLEM) как инструмент для визуализации микроинъекции молекул и их Эукариотические Sub-клеточных мишеней


The eukaryotic cell relies on complex, highly regulated, and functionally distinct membrane bound compartments that preserve a biochemical polarity ...

Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy

Анализируя черепно-лицевой морфогенеза у рыбок данио Использование 4D конфокальной микроскопии

Time-lapse imaging is a technique that allows for the direct observation of the process of morphogenesis, or the generation of shape. Due to their optical ...

Combining Mitotic Cell Synchronization and High Resolution Confocal Microscopy to Study the Role of Multifunctional Cell Cycle Proteins During Mitosis

Сочетание митотическая клеток синхронизации и конфокальная микроскопия высокого разрешения для изучения роли многофункциональный клеточного цикла белков во время митоза

Study of the various regulatory events of the cell cycle in a phase-dependent manner provides a clear understanding about cell growth and division. The ...

Biological Sample Preparation by High-pressure Freezing, Microwave-assisted Contrast Enhancement, and Minimal Resin Embedding for Volume Imaging

Подготовка биологический образец высокого давления замораживания, при содействии Микроволновая печь контрастности и минимальным смолы, встраивание образов тома

The described sample preparation technique is designed to combine the best quality of ultrastructural preservation with the most suitable contrast for the ...

Reconstruction of Single-Cell Innate Fluorescence Signatures by Confocal Microscopy

Реконструкция одноклеточных врожденных флуоресцентных сигнатур с помощью конфокальной микроскопии

Described here is confocal reflection microscopy-assisted single-cell innate fluorescence analysis (CRIF), a minimally invasive method for reconstructing ...

Cryo-Electron Microscopic Grid Preparation for Time-Resolved Studies using a Novel Robotic System, Spotiton

Подготовка криоэлектроновой микроскопической сетки для исследований с временным разрешением с использованием новой роботизированной системы Spotiton

The capture of short-lived molecular states triggered by the early encounter of two or more interacting particles continues to be an experimental ...

Sample Preparation by 3D-Correlative Focused Ion Beam Milling for High-Resolution Cryo-Electron Tomography

Подготовка образцов методом 3D-коррелятивного фрезерования сфокусированного ионного пучка для криоэлектронной томографии высокого разрешения

Cryo-electron tomography (cryo-ET) has become the method of choice for investigating cellular ultrastructure and molecular complexes in their native, ...

Ultrastructural Localization of Endogenous LC3 by On-Section Correlative Light-Electron Microscopy

Ультраструктурная локализация эндогенного LC3 методом срезовой коррелятивной светоэлектронной микроскопии

The visualization of autophagic organelles at the ultrastructural level by electron microscopy (EM) is essential to establish their identity and reveal ...

Imaging of Mitochondrial Peroxide in Living Yeast Cells Using mtHyper7

Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells

Advancing Mitochondrial Research Â– mtHyper7 Biosensor for Subcellular Analysis (Video) | JoVE

Визуализация mtHyPer7, ратиометрического биосенсора для митохондриальной перекиси, в живых клетках дрожжей

Mitochondrial dysfunction, or functional alteration, is found in many diseases and conditions, including neurodegenerative and musculoskeletal disorders, ...