Name: quantitation of endothelial cell adhesiveness in vitro
Uploaded: 2015-06-18T15:00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro at JoVE.com

We are very grateful to Simon Bouffler for his full support and to Public Health England for infrastructure support. This work was supported by Public Health England throughthe National Institute for Health Research (NIHR) grant. This report is work commissioned by the NIHR. The views expressed in this publication are those of the authors and not necessarily those of the NHS, NIHR or the Department of Health. The funders had no role in study design, data collection and analysis, decision to publish, or preparation of the manuscript.

1. Fremstilling af dækglas <ol><li> Sterilisere 12 mm diameter runde dækglas ved opblødning dem i 70% ethanol i mindst 10 min under lejlighedsvis omrøring for at sikre total eksponering af alle dækglas til ethanol. Hæld dækglas og ethanol i en steril celledyrkningsskål (enten 6 cm eller 10 cm i diameter). </li><li> Med et par af sterile fine 5B pincet, afhente og placere hver enkelt dækglas i en brønd af en 24 brønd klynge plade. Sørge for at sikre, at dækglassene ikke rører siderne af godt og er omtrent i midten af ​​brønden. </li><li> Forlade un-dækkede 24 brønds klynge plade med dækglas til tørre i strømning. Det tager omkring 10 minutter </li><li> I denne periode forberede belægningsblandingen ved at fortynde 10 mg / ml humant fibronectin i Hanks balancerede saltopløsning (HBSS) til 0,1 mg / ml. </li><li> Når dækglas er tørre, pipette 100 pi coatingopløsning onto hvert glas coverslip så løsningen dækker kun glas uden at samle omkring ydersiden af ​​brønden. Placer dækket 24 brønds klynge plade i en cellekultur inkubator i mindst en time. </li><li> Lige før brug fjernes overtræksopløsningen. Den samme belægningsopløsning kan overføres til et sterilt rør og anvendt op til tre gange uden synligt tab af effekt. </li></ol> 2. Fremstilling af endothelial cellemonolag <ol><li> Kultur humane koronare arterie endotelceller (EC) i medium ved 37 ° C og 5% carbondioxid. </li><li> Aspireres off dyrkningsmedier og skyl EF monolag med 10 ml HBSS </li><li> Aspirer off HBSS og der tilsættes 2 ml 0,5% trypsin, 0,2% EDTA-opløsning. Inkuber ved stuetemperatur i ca. 5 min. </li><li> Når EF kan fjernes ved et tryk på siden af ​​kolben, tilsættes 5 ml sojabønne trypsin inhibitor og med pipette sprøjte overfladen af ​​kolben til yderligere at løsne cellerne. </li><li> Overfør celler i et 15 ml rør og centrifugeres røretved 200 x g i 5 min. </li><li> Aspirer supernatanten og resuspender EF pellet i 5 ml medium. Tæl cellerne med et hæmocytometer og justere cellekoncentrationen til 50.000 EF pr ml EF medier. </li><li> Dispensér 1 ml af cellesuspensionen i hver brønd i 24 brønds plade indeholdende overtrukne dækglas. Cellerne inkuberes O / N i cellekultur inkubator ved 37 ° C + 5% carbondioxid. </li><li> Cellerne er klar til brug i forsøg, når et konfluent monolag er dannet, inden for 3 dage. </li></ol> 3. Fremstilling af Monocytter <ol><li> Overførsel HL-60-celler, der er dyrket i RPMI suppleret med 10% føtalt kalveserum, som suspensionskultur, i et 15 ml rør. Centrifuger cellerne ved 200 x g i 5 min. </li><li> Fjern supernatanten og resuspender cellerne i 5 ml medier og justere cellekoncentrationen med medier til 2 millioner celler / ml. Hvis der ønskes fluorescens mærkning af HL-60, resuspender cellerne i RPMI uden serum og proceed som beskrevet i afsnit 4. </li><li> Tilsæt 0,5 ml HL-60 cellesuspension i hver brønd i 24 brønd cluster plade indeholdende EF monolag og inkuber pladen i en cellekultur inkubator ved 37 ° C og 5% carbondioxid i en valgt fast tidsperiode mellem 1 og 3 time. Iagttages lille forskel mellem 1 time og 3 timer tid-punkt, hvor bindende mætning opnås. </li><li> Forbered celle vask / høst: Fyld en 120 ml rør med 100 ml HBSS. Dispensér 1 ml formalin i hver brønd i en frisk 24-brønds plade. </li><li> Efter inkubationsperioden, bruge et par skarpe pincet og afhente dækglas fra brønden og hold dækglasset lodrette og dup kanten af ​​dækglasset på et stykke væv på bænken i 3 sek, pas på ikke at røre ved celle-dækket overflade af dækglasset med vævet. </li><li> Holde dækglasset fast med en tang, dunk dækglasset i og ud af HBSS fem gange. </li><li> Efter den femte dunki HBSS, ising kanten af ​​dækglasset på vævet i 3 sek. </li><li> Gentag dunking og duppe beskrevet i 3.6 og 3.7, dvs. i alt tre sæt af 5 dunk efterfulgt af en dab. </li><li> Overfør dækglasset i en brønd indeholdende 10% formalin for at fikseres cellerne ved stuetemperatur. Dækglasset er klar til optælling, for langtidsopbevaring eller underkastes andre procedurer, der er beskrevet nedenfor. </li></ol> 4. Mærkning af HL-60 celler med Cell Tracker (valgfrit) <ol><li> Tælle og overføre passende mængde HL-60-celler (fx 10 millioner) i et 15 ml centrifugerør. Centrifuge HL-60-celler ved 200 xg i 5 minutter. Fjern supernatanten. </li><li> Resuspender cellepelleten i Cell Tracker i RPMI medier uden serum i en koncentration på 1 million celler / ml. Cellerne inkuberes i cellekultur inkubator i 1 time. </li><li> Centrifugér celler ved 200 xg i 5 minutter og kassere supernatanten. Resuspender cellepelleten i medier til en koncentration på 2 millioner calen / ml. </li><li> Tilsæt 0,5 ml Cell Tracker-mærket HL-60 i hver brønd indeholdende endothelceller dyrket på dækglas. Fortsæt på 3.3. </li></ol> 5. Tælling af Adhesive endotelceller <ol><li> Mount dækglas på objektglas med DAPI mod pletten for at identificere de enkelte celler. </li><li> Ved hjælp af et omvendt mikroskop med en 4X eller 10X mål, erhverve billeder af flere områder (f.eks 5 felter) og tælle det højeste antal monocytter, der aggregerer på un-bestrålede endotelceller (Dette bør typisk være 3-5). </li><li> Set to gange dette tal som tærskel af monocytter på en endotelcelle skal der defineres som en klynge. Hvis det kræves, kan et andet kriterium skal anvendes til at definere en klynge afhængigt af arten af ​​forsøget. </li><li> Tæl antallet af klynger og antallet af endotelceller på området. Dividere den førstnævnte af sidstnævnte for at opnå procentdelen af ​​klæbende endotelceller. Scoreen lang række områder for at opnå en gennemsnitlig og standardafvigelse af tællingerne. </li></ol> 6. kontrastfarvning med antistoffer <ol><li> Efter adhæsionsassayet og celler på dækglasset er blevet fikseret i 10% formalin i 15 minutter ved stuetemperatur, underkaste dækglassene til immunfluorescens ved anvendelse af standard procedure 10, og antistoffer af valg. </li><li> Tilføje og fjerne de forskellige løsninger meget forsigtigt for at undgå løsner monocytter, der er knyttet til endotelceller. </li></ol> 7. kontrastfarvning for Ældning-associeret Beta-galactosidaseaktivitet <ol><li> Efter adhæsionsassayet og celler på dækglasset er blevet fikseret i formalin i 15 minutter, farves for alderdom-associeret beta-galactosidase-aktivitet som beskrevet i instruktionerne, der ledsager den farvningskittet. Tilføje og fjerne de forskellige løsninger meget forsigtigt for at undgå løsner monocytter, der er knyttet til endotelceller. </li></ol>

<ol>
	<li>Ortega-Gomez, A., Perretti, M., Soehnlein, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolution+of+inflammation:+an+integrated+view.">Resolution of inflammation: an integrated view.</a> EMBO Mol Med. 5 (5), 661-674 (2013).</li><li>Libby, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+and+cardiovascular+disease+mechanisms.">Inflammation and cardiovascular disease mechanisms.</a> Am J Clin Nutr. 83 (2), 456S-460S (2006).</li><li>Ikuta, S., Kirby, J. A., Shenton, B. K., Givan, A. L., Lennard, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+endothelial+cells:+effect+of+TNF-alpha+on+peripheral+blood+mononuclear+cell+adhesion.">Human endothelial cells: effect of TNF-alpha on peripheral blood mononuclear cell adhesion.</a> Immunology. 73 (1), 71-76 (1991).</li><li>Watson, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-6+acts+on+endothelial+cells+to+preferentially+increase+their+adherence+for+lymphocytes.">IL-6 acts on endothelial cells to preferentially increase their adherence for lymphocytes.</a> Clin Exp Immunol. 105 (1), 112-119 (1996).</li><li>Sans, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VCAM-1+and+ICAM-1+mediate+leukocyte-endothelial+cell+adhesion+in+rat+experimental+colitis.">VCAM-1 and ICAM-1 mediate leukocyte-endothelial cell adhesion in rat experimental colitis.</a> Gastroenterology. 116 (4), 874-883 (1999).</li><li>Su, Y., Lei, X., Wu, L., Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+endothelial+cell+adhesion+molecules+P-selectin,+E-selectin+and+intercellular+adhesion+molecule-1+in+leucocyte+recruitment+induced+by+exogenous+methylglyoxal.">The role of endothelial cell adhesion molecules P-selectin, E-selectin and intercellular adhesion molecule-1 in leucocyte recruitment induced by exogenous methylglyoxal.</a> Immunology. 137 (1), 65-79 (2012).</li><li>Hallahan, D., Kuchibhotla, J., Wyble, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+adhesion+molecules+mediate+radiation-induced+leukocyte+adhesion+to+the+vascular+endothelium.">Cell adhesion molecules mediate radiation-induced leukocyte adhesion to the vascular endothelium.</a> Cancer Res. 56 (22), 5150-5155 (1996).</li><li>Vaporciyan, A. A., Jones, M. L., Ward, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+analysis+of+leukocyte-endothelial+adhesion.">Rapid analysis of leukocyte-endothelial adhesion.</a> J Immunol Methods. 159 (1-2), 93-100 (1993).</li><li>Prabhakarpandian, B., Shen, M. C., Pant, K., Kiani, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+devices+for+modeling+cell-cell+and+particle-cell+interactions+in+the+microvasculature.">Microfluidic devices for modeling cell-cell and particle-cell interactions in the microvasculature.</a> Microvasc Res. 82, 210-220 (2011).</li><li>Lowe, D., Raj, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Premature+aging+induced+by+radiation+exhibits+pro-atherosclerotic+effects+mediated+by+epigenetic+activation+of+CD44+expression.">Premature aging induced by radiation exhibits pro-atherosclerotic effects mediated by epigenetic activation of CD44 expression.</a> Aging Cell. 13 (5), 900-910 (2014).</li></ol>

Forfatterne har ikke noget at afsløre.

Den monocytadhæsion assayet beskrevet ovenfor blev anvendt med succes i eksperimenter designet til at studere de biologiske virkninger af ioniserende stråling på endotele monolag 10. Selvom dette ikke er den eneste metode til at vurdere klæbeevnen af ​​en endotel monolag, det er den eneste metode, der tillader kvantificering af andelen eller procentdelen af ​​endotelceller i et monolag, der er klæbende. Dette er en vigtig forskel som en global kvantitativ ændring i adhæsion af monocytter, kan som målt ved andre metoder enten henføres til en generel stigning i klæbeevne af alle celler i det endotele monolag eller for øget klæbeevne af en sub-population af endotelceller inden monolaget, som vist i ovenstående eksempel. Værdien af ​​at have denne information er eksemplificeret ved det forhold, at evnen til at kvantificere procentdelen af ​​endotelceller, der udviste forbedret klæbeevne efter bestråling førte til de inesstand konklusion, at denne virkning ikke skyldes genetisk mutation af et bestemt gen som den procentdel af celler, der var klæbemiddel var langt over (over 1000 gange mere), som ville forventes fra tilfældig mutation af et gen af ​​X-stråling ved denne dosis . Den faktor, der tillader god reproducerbarhed af resultaterne er vask regime. Som vaskeproceduren involverer neddypning af dækglas i vaskepuffer efterfulgt af duppe på et væv, er variabiliteten i bufferen turbulens, som uundgåeligt opstår fra den gamle metode til pipettering i vaskepufferen i en brønd undgås. Ja det var observation af overdreven variation mellem replikater opnået ved hjælp af den pipettering metode, der tvang os til at udtænke en vask procedure, der fjernede variabilitet element fra vask trin. Ganske vist af begrænsninger i denne analyse ligger i behovet foretage manuel optælling af monocyt klynger, der gør not lade det være indrettet til high throughput analyser. For det andet, at beslutningen om, hvor mange monocytter udgør en klynge skal bestemmes semi-vilkårligt, og niveauet kan være indstillet for højt, og resultere i udelukkelse af nogle ægte klynger. Manglen på forskydningskraft i denne fremgangsmåde kan også ses som en begrænsning i forsøg, hvor groft forbedret klæbeevne af endotelceller induceres (f.eks + TNFa). I andre situationer imidlertid manglen på forskydningskraft er en fordel, da den tillader påvisning af mindre overdrevet forøgelse af klæbeevnen. Beskeden stigning i monocyt klæbeevne kan være særlig vigtig og relevant. In vivo monocytter ville ikke (i en typisk eksperimentel tid) forventes at vedhæfte i stort tal til endotelceller med beskeden stigning i klæbeevne, hovedsagelig på grund af forskydning kraft. Med tiden dog nogle monocytter sandsynligvis ville, og det er mere sandsynligt, at repræsentere miljøet af kronisk inflammation. Som sådan,fraværet af forskydningskraft kan være en fordel, da det giver mulighed for små stigninger i endotelcelle klæbeevne til at åbenbares i eksperimentelle tidsrammer som typisk korte og muligvis for flygtig til at tillade beskedne stigning i klæbeevne skal overholdes under forskydningsspænding. Evnen til at underkaste cellerne efter dette assay til andre analyser, såsom ældning assay og immunofluorescensfarvning øger anvendeligheden af ​​denne metode som den muliggør associering af klæbeevne af specifikke endotelceller til bestemte cellulære proteiner eller cellulære tilstande som påvist ovenfor, en funktion, er ikke tilgængelig med de ældre adhæsionsassays. Denne fremgangsmåde er blevet anvendt med est2-immortaliserede humane koronare endotelceller og lignende resultater blev også opnået med primære humane koronare endotelceller 10, hvilket viser, at det ikke er specifik for kun en bestemt cellelinie. Også den adoptio n af denne fremgangsmåde til analyse klæbeevne af endotelceller udelukker ikke underkaste de samme celler til den standard adhæsion assay, der måler fluorescens af mærkede immunocytter. Sammen denne rapport viser, at denne metode er alsidig, inkluderende og giver meget mere information end den standard vedhæftning analysen.

Infiltration af immunceller såsom monocytter tværs endothelcellelaget at linje blodkar er et vigtigt skridt i processen med inflammation 1. Dette gør det muligt homing af immunceller (immunocytter) til en skadestedet. I andre tilfælde og steder som kranspulsåren og halspulsåren, kan infiltration af monocytter gennem endothellaget føre til uønskede fastboende af disse celler i væggen af arterien, hvilket potentielt kan føre til dannelsen af plaques 2. I alle tilfælde af immunocyt infiltration, det første trin involverer aktivering af endotelceller i et lokaliseret område af blodkarret. Endotelceller aktiveres af proinflammatoriske cytokiner såsom TNF-α og IL-6 for at forøge ekspression af celleoverflade- proteiner, såsom VCAM, ICAM og E-selectin, som letter rekrutteringen og fastgørelse af immunocytter på endotelcelleoverfladen 3- 6. 7. Begrænsningerne ved denne fremgangsmåde i form af præcision ført til anvendelse af radioaktivt mærket lymfocyt eller monocyt, efterfulgt af kvantificering af radioaktive stoffer, der svarer til lymfocytter eller monocytter vedhæftning 4. Denne metode blev til sidst erstattet af en fluorescens-baseret metode, hvorved immunocytter af interesse blev mærket med fluorescens farvestof og underkastes den samme fremgangsmåde som ovenfor med den forskel, at fluorescens i stedet for radioaktivitet måles 8. For tiden denne metode har vist sig som den mest bekvemme og sælges som sæt af en række kommercielle leverandører. Mens dette assay kan måle relative niveauer af klæbeevne mellem kontroller og eksperimentelle prøver, betyder det ikke afsløre, om en ændring i fluorescens skyldes en ensartet ændring i klæbeevnen på tværs af hele endothelial cellepopulation eller hvis ændringen skyldes en forskel på klæbeevne inden en sub-population af celler. Det er også klart, at strengheden af ​​vask udøver en dybtgående indvirkning på resultatet, og endnu vigtigere, vil ensartetheden af ​​skylning ubundne monocytter mellem forskellige endotel cellemonolag stor indflydelse på graden af ​​resultater fra gentagelser og reproducerbarhed af resultaterne mellem prøverne . For nylig blev adskillige systemer, som pumper monocytter i medier på tværs af en endotelcelle monolag anvendes til at løse dette problem 9. Desuden er disse flowsystemer også rekapitulere effekten af ​​forskydningskraften på endothelcellerne. Mens fordelene ved sådanne systemer er klare og meget attraktivt, er det også vigtigt at indse, at mens endotelcelle klæbeevne kan blive kraftigt forøget, som det er tilfældet i akut inflammation, af faktorer, såsom TNFa, nogle andre aktivatorer, såsom ioniserende stråling 10 fremkalder ændrer that er ikke let påvises inden in vitro eksperimentelle tidsrammer, som disse meget strenge systemer. Mens sådanne minut ændringer af endotelceller klæbeevne let er savnet eller afskediges in vitro, er det ikke nødvendigvis godartet in vivo, hvor sådanne små ændringer inden for en levetid, som er karakteristisk for kronisk inflammation, kan udøve meget betydelige resultater. Derfor er en robust, men alligevel følsomt, og metode til at påvise og måle er brug endothelcelle klæbeevne. Her rapporterer vi en metode til at måle klæbeevne af endotelceller direkte. Denne metode er ikke afhængig af fluorescens måling som en indirekte surrogat indikator for endotelceller klæbeevne. Det afslører, om ændringer i klæbeevne skyldes ensartet ændring i alle celler eller begrænset til en sub-population. Herudover giver det co-farvning af endotelceller med markører, såsom senescens-associerede beta-galactosidase, cellelevedygtighed marker, Calcien AM og antistoffer mod celleoverflade og intracellulære proteiner, der muliggør associering af individuelle adhæsive endotelceller til visse celletilstande eller ekspression af specifikke proteiner.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Hepes Buffered Saline Solution (HBSS)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H6648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips Round 12mm Diameter</td>
			<td>Menzel-Glaser</td>
			<td>CB00120RA1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well cluster plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3526</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meso-Endo Cell media</td>
			<td>Cell Applications</td>
			<td>212-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T4174</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Soybean trypsin inhibitor</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>17075-029</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Tracker Green</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>C7025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>R8758</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Foetal Calf Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10500064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Beta glasctosidase Assay kit&#160;&#160;</td>
			<td>CellSignaling</td>
			<td>9860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F0895</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantitation of endothelial cell adhesiveness in vitro

Et af de vigtigste processer inflammation er infiltrering af immunceller fra lumen i blodkarret til det omgivende væv. Dette sker, når endotelceller, der beklæder blodkar, bliver klæbemiddel på cirkulerende immunceller såsom monocytter. In vitro måling af denne klæbeevne har indtil nu været udført ved at kvantificere det samlede antal monocytter, der overholder et endothellag enten som en direkte tælling eller ved indirekte måling af fluorescensen af ​​adhærerende monocytter. Mens sådanne målinger gør angive den gennemsnitlige klæbeevne af endotelcelle befolkning, er de forstyrret af en række faktorer, såsom celletal, og afslører ikke andelen af ​​endotelceller, der faktisk klæbemiddel. Her beskriver vi og udviser en fremgangsmåde, der tillader opregningen af ​​klæbende celler i en population af testede endotel monolag. Endotelceller dyrkes på dækglas og følgende ønskesbehandling udfordres med monocytter (der kan være fluorescerende mærket). Efter inkubation en skylning procedure, der involverer multiple runder af nedsænkning og dræning, fikseres cellerne. Selvklæbende endotelceller, som er omgivet af monocytter let identificeret og talt, hvilket giver en vedhæftning indeks, der afslører den faktiske andel af endotelceller i populationen, der er klæbende.

Denne fremgangsmåde tillader detektion af individuelle adhæsive endotelceller i en population. For eksempel, mens et monolag af ikke-bestrålede endotelceller bibeholdt nogle sporadiske HL-60 monocytter efter inkubation og vask, endotel monolag på 7 dage efter 10Gy bestråling før inkubering med monocytter blev bundet af monocytter i klynger omkring individuelle endotelceller ( figur 1). Selv om dette fænomen er let observerbar under fasekontrastmikroskopi, fluorescens mikroskopi afslører en endnu klarere billede af monocyt klynger. Efter udførelse af den beskrevne adhæsion assay, er det muligt at gå videre til farvning af cellerne for membranen, cytoplasmatisk eller nukleær (figur 2) proteiner ved anvendelse af passende antistoffer med standard immunofluorescens metoder. Endvidere kan enzym-baseret assay, såsom senescens-associerede beta-galactosidase (figur 3) også være performed. Da hver monocyt klynge svarer til en individuel endotelcelle, vil tælling af klyngerne afsløre det faktiske antal klæbende endotelceller i monolag (figur 4), og dermed den procentdel af klæbende endotelceller i populationen (tabel 1, figur 6) . Dette er den eneste metode til dato, der tillader en sådan kvantificering af endotelcelle klæbeevne. Det er bemærkelsesværdigt, at endotelcellerne anvendt i forsøgene her er kontakt-inhiberet og ikke øges i antal efter opnåelse konfluens. Dette eliminerer potentielle kompleksitet udgøres af forøget endotel celletal på senere tidspunkter. Om ønsket kan monocytter knyttet til endoteliale monolag løsnes med 0,5% trypsin-0,2% EDTA-opløsning (i stedet for fiksering i 3.9) og deres fluorescens måles med en pladelæser, som det er tilfældet i moderne metoder (figur 5). </p&gt; <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig1.jpg" /> Figur 1. Adhæsion af monocytter på monolag af endotelceller. På un-bestrålede endotelceller, monocytter klæbet som individuelle celler i en sporadisk og tilfældig måde (venstre paneler) og i klynger på individuelle endotelceller af de 7 dage efter 10 Gy bestrålede monolag (højre paneler). Lavere paneler er fluorescens billeder af de øverste paneler, bekræfter, at de små og lyse sfæriske celler synlige under fase kontrast er faktisk monocytter, der var præ-mærket med Cell-Tracker Green. Nogle af monocyt klynger er angivet med hvide pile. Billeder blev taget ved hjælp af en 10X målsætning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <html><img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig2.jpg" /> Figur 2. Farvning af endotelceller for proteiner post-adhæsionsassay. Efter udførelse den beskrevne adhæsion assay celler på dækglas blev underkastet immunofluorescens til påvisning af (A) membranprotein (CD44), b) cytoplasmatisk protein (tubulin) eller c) kerneprotein (γ-H2AX). Venstre paneler af (A) og (B) (set med 20X mål) viser monocytter pre-mærket med Cell Tracker Green og lignende billede på de rigtige paneler afslører CD44 og mikrotubuli (rød) og DAPI-farvede kerner (blå). Hvide pile i (C) punkt til bestrålede endotele cellekerner, der blev farvet med antistoffer mod γ-H2AX. Monocyt kerner, som er farvet en lysere blå ved DAPI let skelnes fra de ovale kerner af endothelcellerne. Billeder blev taget med 20 x objektiv.<html> jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Klik her for at se en større version af dette tal. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig3.jpg" /> Figur 3. Ældning-associeret beta-galactosidase-farvning af endotelceller. Efter adhæsion assay celler på dækglas blev underkastet farvning for senescens-associerede beta-galactosidase, som forårsager lysosomerne i aldrende celler at blive blå, som er tydeligt i endotelcellen at selektivt bundet af talrige monocytter, som let identificeres på grund af deres lille størrelse og kugleform. Billede set gennem 20X målsætning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> 2924 / 52924fig4.jpg &quot;/&gt; Figur 4. Tælling af monocyt klynger på individuelle endotelceller. Efter adhæsion assay blev billeder af celler taget fra flere forskellige positioner og monocyt klynger identificeret og cirkel (med grønt). En klynge blev defineret som en agglomeration af 10 eller flere monocytter på en endotelcelle. Antallet af monocyt klynger og antal på 12 dage efter bestrålede endotelceller (Dotted med rødt) i billedet blev talt og procentdelen af adhærerende endotelceller beregnet som vist i tabel 1. Billede taget gennem 10X objektiv. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52924/52924fig4large.jpg" target="_blank">Venligst klik her for et større udgave af dette tal.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig5.jpg" /> Figur 5. Kvantificering af fluorescens af adhærente monocytter. Efter adhe<html> sionen assay celler på dækglas blev trypsiniseret og fluorescensen af ​​monocytter pre-mærket med CellTracker Green blev målt ved anvendelse af en fluorescenspladelæser, som en indirekte indikator for klæbeevne af endotel monolag. Resultater fra sådanne målinger på angivne dage efter bestråling blev opnået og flettede på grafen ovenfor. <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/52924/52924fig6.jpg" /> Figur 6. Repræsentation af adhæsion assay scores fra tabel 1. Adhesive endotelceller i fem forskellige steder på tre dækglas blev mærket som beskrevet i figur 4, og resultaterne tabuleret ovenfor demonstrerer, at 12 dage efter 10 Gy bestråling, 8 til 10 procent af bestrålet endotelceller blev klæbemiddel. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td>3 &quot;&gt; Procentdel af klæbemiddel endotelceller </td></tr><tr><td></td><td> Disc 1 </td><td> Disc 2 </td><td> Disc 3 </td></tr><tr><td> Felt 1 </td><td> 8,65 </td><td> 8.29 </td><td> 8,21 </td></tr><tr><td> Felt 2 </td><td> 10,44 </td><td> 7,27 </td><td> 7,21 </td></tr><tr><td> Felt 3 </td><td> 9.63 </td><td> 9,05 </td><td> 8.33 </td></tr><tr><td> Felt 4 </td><td> 11.11 </td><td> 7.09 </td><td> 8.41 </td></tr><tr><td> Felt 5 </td><td> 10.55 </td><td> 9.4 </td><td> 11.61 </td></tr><tr><td> Gennemsnitlig </td><td> 10.07 </td><td> 8,22 </td><td> 8,75 </td></tr></tbody></table> Tabel 1. adhæsionsassay scoringer. Klæbende endotelceller i fem forskellige steder på tre dækglas blev bedømt som beskrevet i Figur 4 og resultaterne tabuleret ovenfor demonstrerer, at 12 dage efter 10 Gy bestråling, 8 til 10 procent af bestrålede endotelceller blev klæbemiddel.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro at JoVE.com

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

Kvantificering af endotelcelle Klæbeevne<em&gt; In vitro</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

Research

JoVE Journal

Biology

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

In Vitro Nuclear Assembly Using Fractionated Xenopus Egg Extracts

Nuclear membrane assembly is an essential step in the cell division cycle; this process can be replicated in the test tube by combining Xenopus sperm ...

Embryonic Stem Cell-Derived Endothelial Cells for Treatment of Hindlimb Ischemia

Peripheral arterial disease (PAD) results from narrowing of the peripheral arteries that supply oxygenated blood and nutrients to the legs and feet, This ...

Isolation and Large Scale Expansion of Adult Human Endothelial Colony Forming Progenitor Cells

This paper introduces a novel recovery strategy for endothelial colony forming progenitor cells (ECFCs) from heparinized but otherwise unmanipulated adult ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

A Sensitive and Specific Quantitation Method for Determination of Serum Cardiac Myosin Binding Protein-C by Electrochemiluminescence Immunoassay

Biomarkers are becoming increasingly more  important in clinical decision-making, as well as basic science. Diagnosing  myocardial infarction (MI) is ...

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

In vitro Cell Migration og invasion Analyser

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endothelial Cell Tube Formation Assay for the In Vitro Study of Angiogenesis

Endotelcelle Tube Opstilling assay for<em&gt; In Vitro</em&gt; Undersøgelse af angiogenese

Angiogenesis is a vital process for normal tissue development and wound healing, but is also associated with a variety of pathological conditions. Using ...

Analysis of Oxidative Stress in Zebrafish Embryos

Analyse af oxidativt stress i zebrafisk embryoner

High levels of reactive oxygen species (ROS) may cause a change of cellular redox state towards oxidative stress condition. This situation causes ...

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection of Nitric Oxide and Superoxide in Endothelial Layer of Intact Arteries

En Face Detection af nitrogenoxid og Superoxide i Endotel Layer af intakte arterier

Endothelium-derived nitric oxide (NO) produced from endothelial NO-synthase (eNOS) is one of the most important vasoprotective molecules in cardiovascular ...