Name: simple bulk readout of digital nucleic acid quantification assays
Uploaded: 2015-09-24T15:00:00
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The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.

Anmerkung: Die Herstellung von Mikrofluid-Vorrichtung ist nicht notwendig, diesen Assay als Tröpfchen für dieses Protokoll mit vorhandenen kommerziellen Tropfenträgern 23,29 gebildet werden. 1. Stellen Sie die Tröpfchenbildungs ​​Mikrofluidikvorrichtung <ol><li> Vorbereitung Vorlagenform für die Kanäle mit der SU-8 Master Fabrication Protokoll dargelegt zuvor 31, aber mit einem Tröpfchengenerator Maskenmuster 32. </li><li> Fertigen Geräte...

<ol>
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Digital Assays sind leistungsfähige Methoden, die den Nachweis von seltenen Zellen und Zählen der einzelnen Nukleinsäuremoleküle zu ermöglichen. Jedoch digital Assays sind noch nicht routinemäßig in analytischen Labors zu den Kosten von Spezialausrüstung mit kommerziell verfügbaren Methoden verbunden angewendet, die teilweise. Hier beschreiben wir einen Endpunkt digitalen Assay zur Quantifizierung von Nukleinsäuren mit einer vereinfachten analogen Auslese Verwendung eines Standard quantitative Echtzeit-PCR-Mas...

Digitale Assays zur Nukleinsäurequantifizierung (digital PCR) 1-4 und Basis Ordnung (Sequenzierung) stark beeinflussen die Lebenswissenschaften und der Medizin. Digitale Assays stellen die Quantifizierung molekularer zählt auf einer absoluten Skala (nicht relativ zu einer Kontrolle) und bietet hohe Empfindlichkeit und ermöglicht einfache Vergleiche zwischen den Experimenten und entscheidend, so dass der Bau von großen Datenbanken mit vergleichbaren Daten 5 (Tabelle 1). Im Laufe der letzten 15 Jahre, Amplifikation des gesamten Genoms (WGA) entstanden neben PCR als allgemeines Instrument für die Nukleinsäure-Amplifikation. Wie PCR ist WGA nützlich für analytische und präparative Anwendungen durch Verstärken Minute Probenelemente bis zu einer Höhe, die leicht nachgewiesen oder für spätere Analysen wie Basensequenzierung verwendet werden kann. Im Gegensatz zur PCR ist WGA nicht speziell auf eine bestimmte DNA-Locus, sondern ermöglicht Amplifikation aller Sequenzen in der Probe, einschließlich der unbekannten Sequenzen.Dieser fundamentale Unterschied zwischen der PCR und WGA macht die Verfahren zueinander komplementär und gibt Anlass zu verschiedenen Herausforderungen in ihrer Anwendung. Die hohe Ausbeute an WGA Reaktionen 6 ermöglicht Routine-Amplifikation von genomischer DNA aus einzelnen Molekülen 7. Einzelzellen 8 und andere niederBiomasseProben 9 für die Quantifizierung oder eine weitere Analyse. Die großen Herausforderungen mit WGA Chemie verbunden sind seine extreme Empfindlichkeit gegenüber Verunreinigungen und die ungleichmäßige Verstärkung über einzelne Templatmoleküle 6. Allerdings WGA ist an Popularität gewinnt als Single-Cell-Sequenzierung wurde als &quot;Killer-Applikation&quot; des WGA-Technologie 10 und Template-Quantifizierung durch WGA taucht ist in vielen Anwendungsbereichen 7 wichtig. Instrumentation für digitale Nukleinsäure Quantifizierung wurde zuvor in einer Vielzahl von mit Ventilen und ventillose mikrofluidischen forma beschriebents 11-14 einschließlich tröpfchenbasierten Assays 15,16 (Tabelle 2). , Kommerzielle mikrofluidische Systeme für die digitale Analyse erfordern jedoch Spezialausrüstung für die Reaktionsaufbau und Produkterkennung 17. Benutzerdefinierte Ventil versehenen Mikrofluidik sind flexibel, erfordern aber präzise Mikrofabrikation und pneumatischen Steuerungen 18. Während es relativ einfach ist, monodisperse Mikrotröpfchen zur Emulsionsbasis digitale Assays 19,20 zu machen, ist Digitalanzeige technisch aufwendig und erfordert entweder große Weitfeld-Bildgebung (ähnlich beliebten Next-Generation-Sequencing-Technologien) 21,22 oder High-Speed-Flow-basierte Tröpfchenerkennung 23-25. Im Idealfall, eine digitale Assay wäre einfach vom Set-up, um auszulesen, reduzieren die Notwendigkeit für komplexe Instrumentierung und so eine große Anzahl von Proben schnell ausgelesen werden. Hier beschreiben wir ein vereinfachtes Verfahren zum Auslesen von digitalen Tröpfchen Assays, die einen herkömmlichen Echtzeit-PCR verwendet instrument zur Groß Fluoreszenz der tröpfchenbasierten digitalen Assays messen. Für digitale WGA Assays für welche analoge Echtzeit-Amplifikationsassays (die ausgezeichnete Ergebnisse liefern für PCR) sind problematisch, besonders vorteilhaft, während der neue Ansatz kann auf digitale PCR-Assays angewendet werden, ist es. WGA gemeinhin Proben mit Templat-Molekülen, die unterschiedlich in Sequenz, Länge und Basengehalt angewandt. Diese unterschiedlichen Templat-Molekülen mit unterschiedlicher Geschwindigkeit 6 verstärkt, was die Verwendung einer Referenz (&quot;standard&quot;) Probe mit passenden Eigenschaften. Oft ist eine solche Standard verfügbar sind oder die Eigenschaften der eingehenden Proben unbekannt sind. Die Heterogenität des Eingangsmaterials und längenabhängigen Eigenschaft des WGA-Chemie 26 die Interpretation der Ergebnisse erschweren auch durch die Schaffung von Mehrdeutigkeit, was wird quantifiziert - die Eingangsmasse, Eingangs Anzahl der Moleküle, die eine Kombination der beiden, oder auch nicht. Fsprünglich, die nicht-sequenz Spezifität macht quantitative mehrere Displacement Amplification (MDA) mehr empfindlich gegenüber Verunreinigungen als quantitative PCR, da Schadstoffmoleküle einer beliebigen Sequenz haben ein Potential, sich einzumischen. Mikrofluidischen digitale Assays Adresse Kontamination durch Trennung Templatmoleküle und die Verringerung der Reaktionsvolumina, so dass weniger Schadstoffe abgetastet werden. Hier verwenden wir ein beliebtes isothermen WGA-Methode, MDA 27. Zu beachten ist, mehrere andere WGA Chemie einschließlich PicoPlex und MALBAC 28 hängen entscheidend von Anfangs isotherme Strangverdrängungsschritte. Isothermen Stufen verstärken die Herausforderung der Anwendung von analogen Echtzeit-Assays für die quantitative WGA. WGA weder vollständig während der Einrichtung verhindert werden, was zu unerwünschten variable Vorverstärkung, noch diskretisiert (&quot;getaktet&quot;) in einer Weise, wo die Replikation des heterogenen Moleküle vollständig durchgeführt und gestoppt werden, bevor der nächste Zyklus wie PCR 11 </sup&gt; (1). Ein digitales Testformat für WGA empfängt typische Reaktions Setup-Verfahren aufgrund der Segregation von jedem Molekül zur Zählung im Assayendpunkt (so Vorverstärkung beeinflußt die Treffer) Originalausleseeinrichtung Genauigkeit würde weitgehend unabhängig von Variationen in der Amplifikationseffizienz ist. Der Test ist abhängig von Tröpfchen in Öl mit einheitlichen Mengen hergestellt, wie der Signalpegel pro Tröpfchen in der Assay-Endpunkt wird auf dem Tröpfchenvolumen abhängen, und wir wollen nicht, dass die Konsistenz der Ergebnisse auf Mittelung über eine Verteilung der Tröpfchengrößen abhängen. Erstellen monodisperse Tröpfchen ist heute ein Standardverfahren (etwa 3.500 monodisperse Tröpfchen Papiere sind seit 2013 erschienen), erfordert aber mikrofluidischen Instrumentierung 25. In der Tat haben mehr als sechs Unternehmen entwickelt unabhängige kommerzielle Produkte, die auf die Produktion von solchen Tröpfchen verlassen und Tröpfchenherstellung mikrofluidischen Chipsim Handel erhältlich 23,29. Für diese Studie verwendeten wir kundenspezifische Mikrofluidvorrichtungen in-house (siehe Protokoll) hergestellt. Spritzenpumpen zu fahren Flusses durch die Vorrichtungen sind auch im Handel erhältlich, aber alternativ mit einem einzigen Einmalspritze zur Vakuum angetriebenen Strömungs substituiert werden, um die Kosten von 30 reduzieren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Evagreen Dye</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>New England Biotechnologies</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biotechnologies</td>
			<td>B0269S</td>
			<td>Vortex periodically until aggregate dissolves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England Biotechnologies</td>
			<td>N3011S</td>
			<td>Heated to 50C and quenched on ice prior to dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Randomized MDA oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-NNNNN*N-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3&#8217; and 5&#8217;-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Nuclease-free water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>UV-treated for 30m in Stratalinker 2400 before use (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROX reference dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12223-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR optical strip caps</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4323032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP (25uM each)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler - Mx3000P qPCR system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89003-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-rad oil for evagreen</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>186-4005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JumpStart Taq ReadyMix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2893-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple bulk readout of digital nucleic acid quantification assays

Digitale Assays sind leistungsfähige Methoden, die Detektion von seltenen Zellen und Zählung von einzelnen Nukleinsäuremoleküle zu ermöglichen. Jedoch digitale Assays noch nicht routinemäßig angewendet wird, aufgrund der Kosten und spezielle Ausstattung mit kommerziell verfügbaren Methoden verbunden. Hier präsentieren wir ein vereinfachtes Verfahren zum Auslesen der digitalen Tröpfchentests unter Verwendung einer herkömmlichen Echtzeit-PCR-Instrument, um Groß Fluoreszenz der tröpfchenbasierten digitalen Assays messen. Wir charakterisieren die Leistung des Schüttauslese Assays unter Verwendung synthetischer Gemische Tröpfchen und Tröpfchen digitalen Multiple Displacement Amplifikation (MDA) Assay. Quantitative MDA besonders profitiert von einer digitalen Reaktions Format, aber unsere neue Verfahren gilt für alle digitalen Assay. Für etablierte digitale Assay-Protokolle wie digitale PCR dient dieses Verfahren zu beschleunigen und zu vereinfachen Assay Auslesen. Unsere Großauslesemethode bringt die Vorteile der partitioned Assays ohne die Notwendigkeit für spezielle Auslese Instrumentierung. Die wichtigsten Einschränkungen des Schüttauslesemethode verglichen mit Tropfenzählen Plattformen und die Notwendigkeit für eine Standardprobe reduzierten dynamischen Bereich, wobei die Anforderungen an diese Norm sind weniger anspruchsvoll als für einen herkömmlichen Echtzeit-Experiments. Quantitative Amplifikation des gesamten Genoms (WGA) wird verwendet, um für Kontaminanten in WGA Reaktionen testen und ist das empfindlichste Art und Weise, um die Anwesenheit von DNA-Fragmenten mit unbekannten Sequenzen zu erkennen, was das Verfahren sehr vielversprechend in unterschiedlichsten Anwendungsbereichen einschließlich der pharmazeutischen Qualitätskontrolle und Astrobiologie.

Während herkömmliche Bulk / Echtzeit-Auslesen kann sowohl für quantitative PCR und quantitative Assays WGA (Figur 1) verwendet werden, digital quantitative Assays bieten Vorteile (Tabelle 1). In dem beschriebenen Verfahren ausgelesen wir digitalen Assays in Mikrotröpfchen-Format mit einer einfachen Schüttendpunktmessung (Abbildung 2). Während dieses Verfahren breit anwendbar, konzentrieren wir uns auf quantitative WGA (MDA), da dieses Verfahren stellt besondere He...

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Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

Einfache Massen Auslesen des digitalen Nukleinsäure Quantifizierung Assays

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Research

JoVE Journal

Biology

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

NanoDrop Mikrovolumen Quantifizierung von Nukleinsäuren

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

Forschung

Biologie

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

Strom-Free, Sequential Nukleinsäure-und Protein Isolation

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

Analysieren und Bauen Nukleinsäurestrukturen mit 3DNA

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations

FtsZ Polymerisation Assays: Einfache Protokolle und Überlegungen

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

Vorbereitung, Imaging und Quantifizierung der Bakterienoberfläche Motilität Tests

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

Effiziente Nukleinsäure-Extraktion und 16S rRNA Gen-Sequenzierung für bakterielle Gemeinschaft Charakterisierung

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

Filtration Isolierung von Nukleinsäuren: Eine einfache und schnelle DNA-Extraktionsmethode

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Magnetische aktiviert Zelle Sortieren Strategien zu isolieren und reinigen Synovial Flüssigkeit abgeleitet mesenchymalen Stammzellen aus einem Kaninchen-Modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

Laktat-Dehydrogenase Sequestrierung Assay – Eine einfache und zuverlässige Methode zur Bestimmung Bulk Selbstverdauende Sequestration Aktivität in Säugerzellen

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

Planarian Scrunching als quantitatives Behavioral Readout für Noxious Stimuli Sensing

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...