Name: simple bulk readout of digital nucleic acid quantification assays
Uploaded: 2015-09-24T15:00:00
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The authors acknowledge Liyi Xu for providing MDA reagents and protocols. We also thank David Feldman and Navpreet Ranu for discussions relating to this work. This work was supported in part by a Burroughs Wellcome Career Award at the Scientific Interface to PCB.

주 :이 프로토콜은 기존 상업용 방울 방울 결정자 23,29 형성 할 수있는 미세 유체 소자를 제작하는 단계, 상기 분석에 대한 필요가 없다. 1. 물방울 형성​​ 미세 유체 소자를 확인 <ol><li> SU-8 마스터 제조 프로토콜에 채널 마스터 주형을 제조 이전 31 약술하지만 방울 생성기 마스크 패턴 (32). </li><li> 소프트 리소그래피 (32, 33)의 기술을 ?...

<ol>
	<li>Sykes, P. J., Neoh, S. H., Brisco, M. J., Hughes, E., Condon, J., Morley, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+targets+for+PCR+by+use+of+limiting+dilution.">Quantitation of targets for PCR by use of limiting dilution.</a> Biotechniques. 13 (3), 444-449 (1992).</li><li>Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoliter+scale+PCR+with+TaqMan+detection.">Nanoliter scale PCR with TaqMan detection.</a> Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).</li><li>Vogelstein, B., Kinzler, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR.">Digital PCR.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 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Chem. 80 (23), 8975-8981 (2008).</li><li>Baker, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digital+PCR+hits+its+stride.">Digital PCR hits its stride.</a> Nat. Methods. 9 (6), 3 (2012).</li><li>Marcus, J. S., Anderson, W. F., Quake, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Parallel+picoliter+rt-PCR+assays+using+microfluidics.">Parallel picoliter rt-PCR assays using microfluidics.</a> Anal. Chem. 78 (3), 956-958 (2006).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synchronized+reinjection+and+coalescence+of+droplets+in+microfluidics.">Synchronized reinjection and coalescence of droplets in microfluidics.</a> Lab Chip. 14 (3), 509-513 (2014).</li><li>Rhee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pressure+stabilizer+for+reproducible+picoinjection+in+droplet+microfluidic+systems.">Pressure stabilizer for reproducible picoinjection in droplet microfluidic systems.</a> Lab Chip. 14 (23), 4533-4539 (2014).</li><li>Hatch, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=1-Million+droplet+array+with+wide-field+fluorescence+imaging+for+digital+PCR.">1-Million droplet array with wide-field fluorescence imaging for digital PCR.</a> Lab Chip. 11 (22), 3838-3845 (2011).</li><li>Hindson, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+droplet+digital+PCR+system+for+absolute+quantitation+of+DNA+copy+number.">High-throughput droplet digital PCR system for absolute quantitation of DNA copy number.</a> Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li><li>Guo, M. T., Rotem, A., Heyman, J. A., Weitz, D. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monodisperse+double+emulsions+generated+from+a+microcapillary+device.">Monodisperse double emulsions generated from a microcapillary device.</a> Science. 308 (5721), 537-541 (2005).</li><li>Eastburn, D. J., Sciambi, A., Abate, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Picoinjection+enables+digital+detection+of+RNA+with+droplet+rt-PCR.">Picoinjection enables digital detection of RNA with droplet rt-PCR.</a> PLoS One. 8 (4), e62961 (2013).</li><li>Dube, S., Qin, J., Ramakrishnan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mathematical+analysis+of+copy+number+variation+in+a+DNA+sample+using+digital+PCR+on+a+nanofluidic+device.">Mathematical analysis of copy number variation in a DNA sample using digital PCR on a nanofluidic device.</a> PLoS One. 3 (8), e2876 (2008).</li><li>Shen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiplexed+quantification+of+nucleic+acids+with+large+dynamic+range+using+multivolume+digital+RT-PCR+on+a+rotational+SlipChip+tested+with+HIV+and+hepatitis+C+viral+load.">Multiplexed quantification of nucleic acids with large dynamic range using multivolume digital RT-PCR on a rotational SlipChip tested with HIV and hepatitis C viral load.</a> J Am. 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디지털 분석법 희귀 세포의 검출 및 핵산 분자의 개인의 계산을 가능하게 강력한 방법이다. 그러나, 디지털 분석은 여전히​​ 통상적으로 시판되는 방법과 관련된 특수 장비의 비용을 부분적으로 분석 실험실에서 기인인가되지 않는다. 여기서 우리는 표준 정량 실시간 PCR 기계를 사용하여 단순화 된 아날로그 판독하여 핵산을 정량 종점 디지털 분석법을 설명한다. 이 방법은 설정 신속하고, 판?...

핵산 정량 (디지털 PCR) 1-4 및 기본 순서 (서열)에 대한 디지털 분석은 강하게 생명 과학 및 의학에 영향을하고 있습니다. 디지털 분석은, 높은 감도를 제공하는 실험을 통해 용이 한 비교를 가능하게하고, 결정적으로, 비교 데이터 (5) (표 1)을 함유하는 큰 데이터베이스의 구성을 가능하게 절대치 스케일 (제어에 대해 생략)에 분자 계수의 정량화를 제공한다. 지난 15 년 동안, 전체 게놈 증폭 (WGA)은 핵산 증폭 용 PCR 일반 공구로 나란히 나타났다. PCR 원한다면, WGA는 용이하게 검출 또는 염기 서열 분석 등 후속 분석을 위해 사용할 수있는 레벨까지 분 샘플을 증폭 소자에 의해 분석하고 예비 애플리케이션에 유용하다. PCR 달리 WGA 오히려 미지 서열을 포함한 시료 중의 모든 서열의 증폭을 허용하는, 특정 DNA 유전자좌에 특이하지 않다.PCR 및 WGA 간의 기본적인 차이점은 서로 상보 만드는 방법 및 그 응용이 다른 과제가 발생한다. WGA 반응 (6)의 높은 수율은 단일 분자 (7), 단일 세포 (8) 및 정량 또는 추가 분석을 위해 다른 낮은 바이오 매스 샘플 9에서 게놈 DNA의 일상적인 증폭을 할 수 있습니다. WGA 화학와 관련된 주요 문제는 오염 물질에 극단적 인 감도와 개별 템플릿 분자 (6)에 걸쳐 고르지 증폭 있습니다. 단일 셀 시퀀싱 그러나 WGA는 얻고 인기가 WGA에 의해 WGA 기술 (10), 및 템플릿 정량의 &#39;킬러 애플리케이션&#39;로 떠오르고있다하는 응용 프로그램 (7)의 많은 분야에서 중요하다. 디지털 핵산 정량 계측 이전 판막과 미세 유체 valveless 견적 다양한 설명되었지만액적 기반 분석법을 포함한 TS 11-14, 15, 16 (표 2). 그러나 디지털 분석을위한 상업 미세 유체 시스템은 반응 설치 및 제품 감지 (17)에 대한 전문적인 장비를 필요로한다. 사용자 정의 판막 미세 유체는 유연하지만, 정밀 미세 가공 및 공압 제어 시스템 (18)을 필요로한다. 이 에멀젼 계 디지털 분석법 19,20 용 단 분산 미세 방울을 만드는 비교적 간단하지만, 디지털 판독 대규모 와이드 필드 영상 중 하나를 요구하는 (인기있는 차세대 시퀀싱 기술과 유사) 기술적 부담이다 (21, 22) 또는 고속 액적 검출 23-25 ​​흐름 기반. 이상적으로, 디지털 분석은 복잡한 장비에 대한 필요성을 감소시키고 빨리 판독 될 샘플을 허용하는 다수의, 판독을 위해 셋업에서 간단 할 것이다. 여기에서 우리는 PCR 나는 기존의 실시간 사용하는 디지털 방울 분석의 판독을위한 간단한 방법을 설명nstrument은 액적 기반 디지털 분석의 대량 형광을 측정합니다. 새로운 방식은 디지털 PCR 분석법에 적용 할 수 있지만, (PCR 대해 우수한 결과를 수득)에 문제가있는 실시간 증폭 분석법을하는 아날로그 디지털 WGA 분석에 특히 유리하다. WGA 공통 서열, 길이 및 염기 함량 이질적 주형 분자와 시료에 적용된다. 이들 다른 템플릿 분자는 참조 ( &quot;표준&quot;) 특성과 일치하는 샘플의 사용을 필요로, 다른 비율 6에서 증폭된다. 종종, 이러한 표준을 사용할 수 없으며, 또는 수신 된 샘플의 특성을 알 수있다. 입력 질량, 분자의 입력 번호, 둘, 또는 둘의 조합 - WGA 화학의 입력 재료 및 길이 의존 속성 이질성은 26도 정량화되는 것에 모호성을 생성하여 결과 해석을 복잡. F어떤 시퀀스의 오염 물질 분자가 방해 가능성이 있기 때문에 inally, 시퀀스 비 특이도는 정량적 PCR보다 오염 양적 다중 변위 증폭 (MDA) 더 민감 렌더링합니다. 디지털 마이크로 유체 분석은 주형 분자를 편석 적은 오염물 샘플링되도록 반응 부피를 감소시킴으로써 오염을 해결. 여기서 우리는 인기있는 등온 WGA 방법, MDA (27)를 사용합니다. 참고로, PicoPlex 및 MALBAC (28)를 포함하여 여러 가지 다른 WGA 화학은 초기 등온 가닥 변위 단계에 결정적으로 의존한다. 등온 단계 정량적 WGA 아날로그 실시간 분석을 적용하는 과제를 악화. WGA는 어느 쪽도 완전히 설치 중에 방지하지 원치 않는 변수를 미리 증폭으로 이어지는 없으며, 이종 분자의 복제가 완료 구동 및 정지 할 수있는 방식으로 ( &quot;순환&quot;) 이산화 할 수 PCR (11) 등의 다음주기에 앞서 </suP&gt; (그림 1). WGA위한 디지털 분석법 포맷으로 인해 분석 종말점에서 열거 각 분자의 분리에 전형적인 반응 설정 절차를 수용합니다 원래 판독 정확성은 증폭 효율의 변화는 거의 독립적 것이다 수단 (그래서 사전 증폭은 결과에 영향을 미치지 않는다). 분석 종말점에서 액적마다 신호 레벨이 액적 체적에 의존하므로 분석은, 균일 한 양으로 오일 제조 방울에 따라, 우리는 결과의 일관성 액적 크기의 분포에 걸쳐 평균에 의존하지 않는다. 단 분산 방울을 만드는 것은 이제 (약 3,500 단 분산 방울 논문 2013 년 이후 출판 된) 표준 절차이지만, 마이크로 유체 기기 (25)를 필요로한다. 사실, 여섯 개 이상의 기업들은 방울의 생산에 의존하는 독립적 인 상용 제품을 개발하고, 방울 만들기 마이크로 유체 칩은23,29은 상업적으로 사용할 수 있습니다. 이 연구를 위해, 우리는 사내 (프로토콜 참조) 생산 지정 미세 유체 장치를 사용했다. 주사기를 통해 유동 장치도 시판되고 구동 펌프, 그러나 대안으로, 비용을 줄이기 위해 30 진공 구동 흐름을위한 단일의 일회용 주사기로 치환 될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Evagreen Dye</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>New England Biotechnologies</td>
			<td>B9000S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phi29 DNA Polymerase Reaction Buffer</td>
			<td>New England Biotechnologies</td>
			<td>B0269S</td>
			<td>Vortex periodically until aggregate dissolves</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lambda DNA</td>
			<td>New England Biotechnologies</td>
			<td>N3011S</td>
			<td>Heated to 50C and quenched on ice prior to dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Randomized MDA oligos</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#39;-NNNNN*N-3&#39;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR primers</td>
			<td>Integrated DNA Technologies</td>
			<td></td>
			<td>5&#8217;-CGGCAAACGGGAATGAAACGCC-3&#8217; and 5&#8217;-TGCGGCAAAGACAGCAACGG-3&#8217;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UltraPure Nuclease-free water</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10977-015</td>
			<td>UV-treated for 30m in Stratalinker 2400 before use (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ROX reference dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>12223-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR optical strip caps</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>4323032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PCR tubes</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401428</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dNTP (25uM each)</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>200415</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermocycler - Mx3000P qPCR system</td>
			<td>Agilent Technologies</td>
			<td>401403</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Barrier pipette tips</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89003-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-rad oil for evagreen</td>
			<td>Bio-rad</td>
			<td>186-4005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>JumpStart Taq ReadyMix</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P2893-100RXN</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simple bulk readout of digital nucleic acid quantification assays

디지털 분석은 세포 및 희소 개별 핵산 분자의 계수의 검출을 가능하게 강력한 방법이다. 그러나 디지털 분석은 일상적으로 인한 비용과 시중에서 판매하는 방법과 관련된 특정 장비에 적용되지 여전히. 여기서 우리는 액적 기반 디지털 벌크 분석법 형광을 측정하는 종래의 실시간 PCR 기기를 사용하여 디지털 액적 분석의 판독을 위해 단순화 된 방법을 제시한다. 우리는 합성 액적 혼합물 및 액적 디지털 다중 변위 증폭 (MDA) 분석을 이용하여 벌크 분석의 판독 성능을 특성화. 디지털 반응 형식에서 양적 MDA는 특히 이점, 그러나 우리의 새로운 방법은 모든 디지털 분석에 적용됩니다. 디지털 PCR 등의 설립 디지털 분석 프로토콜의 경우,이 방법은 속도와 분석 판독을 단순화하는 역할을한다. 우리 벌크 판독 partitione 방법론의 장점을 가져온다전문 판독 장비가 필요없이 D 분석. 이 표준에 대한 요구가 종래의 실시간 실험보다 덜 까다로운 있지만 벌크 판독 방법의 주된 제한, 액적 계산 플랫폼 및 표준 시료에 대한 필요성에 비해 동적 범위가 감소된다. 정량적 전체 게놈 증폭 (WGA)는 WGA 반응에서 오염물을 테스트하는 데 제약 품질 제어 및 우주 생물학 등 다양한 응용 분야에있어서 큰 가능성을 제공 미지 서열과 함께 DNA 단편의 존재를 검출하기위한 가장 민감한 방법이다.

종래의 벌크 / 실시간 정량적 PCR이 판독 및 WGA 정량 분석 (도 1) 모두에 사용될 수 있지만, 디지털 정량 분석은 이점이있다 (표 1)을 제공한다. 기재된 방법에서는 단순한 벌크 종료점 측정 (도 2)과 미세 액적 형태로 디지털 분석법을 판독. 이 방법은 광범위하게 적용 할 수 있지만이 방법은 기존의 실시간 분석을위한 특별한 도전을 제시하기 때문에, 우리는 양?...

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Simple Bulk Readout of Digital Nucleic Acid Quantification Assays

We describe an endpoint digital assay for quantifying nucleic acids with a simplified (analog) readout. We measure bulk fluorescence of droplet-based digital assays using a standard qPCR machine rather than specialized instrumentation and confirm our results by microscopy.

디지털 핵산 정량 분석​​ 실험의 단순 대량 판독

Digital assays are powerful methods that enable detection of rare cells and counting of individual nucleic acid molecules. However, digital assays are ...

Research

JoVE Journal

Biology

NanoDrop Microvolume Quantitation of Nucleic Acids

핵산의 NanoDrop Microvolume의 Quantitation

Biomolecular assays are continually being developed that use progressively smaller amounts of material, often precluding the use of conventional ...

연구

생물학

Electricity-Free, Sequential Nucleic Acid and Protein Isolation

전기 - 무료, 선형 핵산 및 단백질 분리

Traditional and emerging pathogens such as Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC), Yersinia pestis, or prion-based diseases are of significant concern ...

Analyzing and Building Nucleic Acid Structures with 3DNA

3DNA과 핵산의 구조를 분석하고 구축

The 3DNA software package is a popular and versatile bioinformatics tool with capabilities to analyze, construct, and visualize three-dimensional nucleic ...

FtsZ Polymerization Assays: Simple Protocols and Considerations

FtsZ 중합 분석 실험 : 간단한 프로토콜 및 고려 사항

During bacterial cell division, the essential protein FtsZ assembles in the middle of the cell to form the so-called Z-ring. FtsZ polymerizes into long ...

Preparation, Imaging, and Quantification of Bacterial Surface Motility Assays

세균 표면 운동성 분석의 준비, 이미징 및 정량화

Bacterial surface motility, such as swarming, is commonly examined in the laboratory using plate assays that necessitate specific concentrations of agar ...

Efficient Nucleic Acid Extraction and 16S rRNA Gene Sequencing for Bacterial Community Characterization

세균 커뮤니티 특성화에 대한 효율적인 핵산 추출 및 16S rRNA의 유전자 시퀀싱

There is a growing appreciation for the role of microbial communities as critical modulators of human health and disease. High throughput sequencing ...

Filtration Isolation of Nucleic Acids:  A Simple and Rapid DNA Extraction Method

핵산의 여과 분리 : 간단하고 신속한 DNA 추출 방법

FINA, filtration isolation of nucleic acids, is a novel extraction method which utilizes vertical filtration via a separation membrane and absorbent pad ...

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

마그네틱 활성화 전략을 분리 하 고 정화 활 액 액체 파생 된 중간 엽 줄기 세포는 토끼 모델에서 정렬 셀

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

The Lactate Dehydrogenase Sequestration Assay &#8212; A Simple and Reliable Method to Determine Bulk Autophagic Sequestration Activity in Mammalian Cells

젖 산 효소 격리 분석 결과-간단 하 고 신뢰할 수 있는 결정 하는 방법을 포유류 세포에서 대량 Autophagic 격리 활동

Bulk autophagy is characterized by the sequestration of large portions of cytoplasm into double/multi-membrane structures termed autophagosomes. Here a ...

Planarian Scrunching as a Quantitative Behavioral Readout for Noxious Stimuli Sensing

유해 자극 감지를 위한 양적 행동 판독으로 기획자 스크런싱

Freshwater planarians normally glide smoothly through ciliary propulsion on their ventral side. Certain environmental conditions, however, can induce ...

디지털 핵산 정량 분석​​ 실험의 단순 대량 판독

디지털 핵산 정량 분석 실험의 단순 대량 판독