Name: visualization of chondrocyte intercalation and directional proliferation via zebrabow clonal cell analysis in the embryonic meckel&#8217;s cartilage
Uploaded: 2015-10-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃ¢â‚¬â„¢s Cartilage at JoVE.

저자는 친절 물고기 설비 및 라인의 우수한 케어 Zebrabow-M 유전자 변형 라인, pDEST 벡터에 대한 제프리 번스와 르네 이티 - Daigle 공유를위한 알렉스 Schier 감사합니다. 자금 조달 : 우리는 어린이를위한 이너스 병원에서 어린이 (ECL) 및 박사후 연수 장학금에 대한 NIDCR RO3DE024490와 슈라 이너스 병원에서 관대 한 자금 지원 (LR 및 YK)에 대해 감사하고 있습니다.

매사 추세 츠 종합 병원 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)의 프로토콜 번호 # 2010N000106에서 모든 절차를 승인했다. 이 평가 및 실험 동물 관리 국제 (AAALAC) 가이드 라인의 인증 협회을 준수합니다. 1. 시약 및 재료 준비 <ol><li> E3 배아 50X 배지 1 L을 제조 (표 2 참조) (표 1 참조)과 1X E3 배아 배지 1 L를 준비한다. </li><li> 1X E3의 1 L에 PTU 30mg을 첨가하여 N-...

<ol>
	<li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+requirements+for+wnt9a+and+irf6+in+extension+and+integration+mechanisms+during+zebrafish+palate+morphogenesis.">Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis.</a> Development. 140, 76-81 (2013).</li><li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+fate+map+of+first+pharyngeal+arch+structures+in+the+sox10:+kaede+zebrafish+transgenic+model.">Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model.</a> The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).</li><li>Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development.">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133, 1069-1077 (2006).</li><li>Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleft+lip+and+palate:+understanding+genetic+and+environmental+influences.">Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences.</a> Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).</li><li>Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+craniofacial+development+in+the+sox10:+kaede+transgenic+zebrafish+line+using+time-lapse+confocal+microscopy.">Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).</li><li>McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+screening+in+zebrafish.+Birth+defects+research.">Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research.</a> Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).</li><li>Mossey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+education+and+CPD:+are+you+being+served.">Dental education and CPD: are you being served.</a> British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140, 2835-2846 (2013).</li><li>Vieira, A. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mandibular+development+precedes+the+time+of+palate+closure+in+mice+homozygous+for+disproportionate+micromelia:+an+oral+clefting+model+supporting+the+Pierre-Robin+sequence.">Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence.</a> Teratology. 65, 116-120 (2002).</li><li>Javidan, Y., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cartilage+and+bone.">Development of cartilage and bone.</a> Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).</li><li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD.">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140, 3254-3265 (2013).</li></ol>

위에서 서로를 보완 설명으로 알 시안 블루와 photoconvertible 형질 전환 라인은 연골과 뼈 개발의 복잡한 프로세스를 정의 할 수 있습니다. 그러나, 기관 형성기 동안 라이브 세포의 이동과 조직은 오랫동안 가정 간접적으로 증명하지만 시각 적이있다. 연골 특정 Cre 호텔과 함께 Zebrabow-M 형질 전환 라인은 뼈와 연골 형성에 관여하는 모든 별개의 이벤트를 동시에 실시간 관찰을 허용합니다. 이 기술?...

두개 안면 개발은 세포 증식, 이동 및 분화, 2, 3를 구동하는 복잡한 분자, 세포 및 조직의 상호 작용을 필요로한다. 이 엄격하게 규제하고 복잡한 과정은 두개 안면 기형이 가장 흔한 선천성 기형 1-9의 사이 있도록 유전과 환경 교란에 될 수 있습니다. 수술 개입이 개발 기초를 이해, 두개 안면 기형 치료의 의지가 남아 있지만 미래의 치료를 혁신하는 것이 필수적이다. 따라서, 통합 및 확장과 세포 통합의 형태 형성과 메커니즘을 연구하는 것은 두개 안면 골격 (1)의 형성에 새로운 통찰력을 제공합니다. 두개골 신경 크레스트 마이그레이션 및 첫 번째 인두 아치 하악을 prefigures 멕켈의 연골을 형성 확장, 다음 짝을 형성 하악 프로세스를 채 웁니다. 형태 형성 오멕켈의 연골 f를 방향 증식, 세포 편광과 차별화 1,10 통해 연골 세포 조직을 필요로한다. 그러나, 멕켈의 연골의 성장과 확장에 연골 세포 조직의 복잡함은 확실하지 않다. 동적 세포의 행동을 이해하는 것은 이러한 형성 부전 하악 표현형 (11) 하악의 크기에 영향을 미치는 선천성 기형을 이해하는 것이 중요합니다. Zebrafish의 배아는 멕켈의 연골 형태 형성의 자세한 연구를위한 많은 발달과 유전 적 장점을 제공한다. 유전 취급 용이성, 투명성, 생체 및 급속한 발전은 라이브 영상 6 세포의 이동과 조직의 관찰 잘 빌려주는 강력한 장점이다. 같은 sox10 같은 혈통-추적 도구 사용 : 카에데 형질 전환 라인을, 우리와 다른 배아 두개 안면 골격 1.5의 신경 크레스트 기원을 묘사했다. USIUBI와 ERT2-Cre 호텔 : sox10을 겨 Zebrabow-M 유전자 변형 라인은 두개 안면 개발 과정에서 세포 운동의 세부 사항을 탐험 할 수있게되었습니다. Zebrabow-M은, 서로 다른 형광 물질의 발현을 구동 유비퀴틴 프로모터의 LOX 사이트 (8)에 의해 각각 측면으로 설계된 트랜스 제닉 라인이다. Zebrabow-M의 기본 형광이 RFP를 표현, 빨간색입니다. Cre 호텔의 발현 유도 후, Zebrabow-M은 재결합을 구성하고 세포는 배아에서 멀티 스펙트럼 표현을 생성하는 다른 형광체 (RFP, CFP와 YFP)의 조합을 표현한다. 다른 병치 된 전구 세포에서 유래하는 세포 집단이 클론 적 표시되도록 재조합 이벤트 이후의 표지 세포 분열 모든 딸 세포를 클론 적, 표시되어 있습니다. 이 복제 셀 라벨에 의해, 클론 해상도와 세포 증식 및 마이그레이션 (그림 1, 2) 다음에 할 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Life Sciences</td>
			<td>10165921001</td>
			<td>Prepare 500 &#956;L stock aliquots at 50mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU (N-Phenylthiourea)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-HydoxyTamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 x 18 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 x 25 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR5&#39;-TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>K591-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K2400-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR3&#39;-pA</td>
			<td>Tol2Kit</td>
			<td>302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Geoffrey Burns labs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of chondrocyte intercalation and directional proliferation via zebrabow clonal cell analysis in the embryonic meckel&#8217;s cartilage

척추 동물의 두개 안면 구조의 개발은 세포 이동, 확산, 접착 및 분화의 정확한 조정이 필요합니다. 멕켈의 연골, 제 인두 아치 유도체의 패터닝은 두개골 신경 크레스트 (CNC) 세포의 이동과 진보적 인 분할, 증식 및 분화 된 연골 세포의 조직을 포함한다. 몇몇 연구는 아래턱 형태 발생 동안 CNC 마이그레이션을 설명했지만,이 연골 세포의 연골 멕켈의 성장 및 확대에 조직을 실현하는 방법의 상세는 불분명. sox10은 제한 및 화학적으로 유도 Cre 호텔 재조합 효소 - 중재 재조합하여 별개의 클론 인구를 반영 전구 세포 및 그들의 자손의 멀티 스펙트럼 라벨을 만드는, 독특한 형광 단백질 (RFP, YFP와 CFP)의 순열을 생성합니다. 공 촛점 시간 경과 사진을 사용하면, 연골 세포를 관찰 할 수있다 behavi또는 제브라 피쉬 멕켈의 연골의 개발 과정. 멀티 스펙트럼 셀 라벨은 멕켈의 연골 세포의 확장을 보여 과학자 수 있습니다. 하악을 prefigures 멕켈의 연골의 확장 단계에서 연골 세포들은 조직 단일 셀 계층 행에 스택으로 확장에 영향을하는 층간 삽입. 세포 확장을 중재하기 위해이 조직 인터 프로세스의 실패는 우리가 하악 기형에서 관찰 형성 부전 하악의 세포 기계적인 설명을 제공합니다.

전체 마운트 알 시안 블루 얼룩에 의해 전통적인 연골 시각화 개발 멕켈의 연골을 관찰하고 일반적으로 최종 세포 조직 (12) (그림 1A)를 시각화하는 데 사용에 귀중한하고있다. 더 혈통은 sox10를 사용하여 추적, 초과 근무 개발 연골 세포를 분석하기 : 카에데 유전자 변형 라인 라이브 배아 2,12 (그림 1B)에 세포 이동, 통합 및 확장을 연구 수있?...

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Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

두개 안면 뼈의 세포 조직은 긴 가설하지만 직접 시각화 적이있다. 멀티 스펙트럼 셀 라벨 및 생체 라이브에서 영상은 제브라 피쉬 아래턱에 동적 셀 동작을 시각화 할 수 있습니다. 여기, 우리 세부 프로토콜은 Zebrabow에게 유전자 변형 물고기를 조작하고 직접 세포 인터 및 멕켈의 연골에서 연골 세포의 형태 학적 변화를 관찰한다.

배아 멕켈의 연골에 Zebrabow 클론 세포 분석을 통해 연골 세포 인터와 방향 확산의 시각화

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

연구

발생학

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

해제 배아 마음에 관상 동맥 혈관의 분석

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

연골 세포 분열 분열의 DNA 메틸화 수준을 정량화하는 5-mC Dot Blot Assay<em&gt; 체외에서</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

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의 배아 혈관 신생에 대한 시각화 및 정량 분석<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

마우스의 인간 골수 미세 환경의 생체 공학 및 실시간 영상화에 의한 시각화

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단일 셀 인덱스 정렬 내 피 세포 틈새 공동 문화 결합을 사용 하 여 배아 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석

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개발 병아리 광섬유 Tectum에 접선 셀 이동의 시각화

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

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마이그레이션, 침공, 불멸 하 게 인간의 첫 번째 임신 Trophoblast 셀 라인의 확산을 평가를 생체 외 분석 실험에서

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

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Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...