Name: visualization of chondrocyte intercalation and directional proliferation via zebrabow clonal cell analysis in the embryonic meckel&#8217;s cartilage
Uploaded: 2015-10-21T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃ¢â‚¬â„¢s Cartilage at JoVE.

Forfatterne takker Alex Schier for velvillig deler Zebrabow-M transgen linje, Geoffrey Burns for pDEST vektor og Renee Ethier-Daigle for godt vare på fisken anlegget og linjer. FINANSIERING: Vi er takknemlige for generøs finansiering støtte fra NIDCR RO3DE024490 og Shriners Hospitals for Children (ECL) og postdoktortreningsstipend fra Shriners Hospitals for Children (LR og YK).

Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) godkjent alle prosedyrer i henhold til protokoll nummer # 2010N000106. Dette er i samsvar med Foreningen for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) retningslinjer. 1. Reagenser og materialer Forberedelse <ol><li> Forbered 1 liter 50X E3 embryo medium (se tabell 1), og fremstille en liter 1X E3 embryo medium (se tabell <...

<ol>
	<li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+requirements+for+wnt9a+and+irf6+in+extension+and+integration+mechanisms+during+zebrafish+palate+morphogenesis.">Distinct requirements for wnt9a and irf6 in extension and integration mechanisms during zebrafish palate morphogenesis.</a> Development. 140, 76-81 (2013).</li><li>Dougherty, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+fate+map+of+first+pharyngeal+arch+structures+in+the+sox10:+kaede+zebrafish+transgenic+model.">Embryonic fate map of first pharyngeal arch structures in the sox10: kaede zebrafish transgenic model.</a> The Journal of craniofacial surgery. 23, 1333-1337 (2012).</li><li>Eberhart, J. K., Swartz, M. E., Crump, J. G., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+Hedgehog+signaling+from+neural+to+oral+epithelium+organizes+anterior+craniofacial+development.">Early Hedgehog signaling from neural to oral epithelium organizes anterior craniofacial development.</a> Development. 133, 1069-1077 (2006).</li><li>Dixon, M. J., Marazita, M. L., Beaty, T. H., Murray, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleft+lip+and+palate:+understanding+genetic+and+environmental+influences.">Cleft lip and palate: understanding genetic and environmental influences.</a> Nature reviews Genetics. 12, 167-178 (2011).</li><li>Gfrerer, L., Dougherty, M., Liao, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+craniofacial+development+in+the+sox10:+kaede+transgenic+zebrafish+line+using+time-lapse+confocal+microscopy.">Visualization of craniofacial development in the sox10: kaede transgenic zebrafish line using time-lapse confocal microscopy.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , e50525 (2013).</li><li>McCollum, C. W., Ducharme, N. A., Bondesson, M., Gustafsson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+toxicity+screening+in+zebrafish.+Birth+defects+research.">Developmental toxicity screening in zebrafish. Birth defects research.</a> Part C, Embryo today : reviews. 93, 67-114 (2011).</li><li>Mossey, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dental+education+and+CPD:+are+you+being+served.">Dental education and CPD: are you being served.</a> British dental journal. Suppl, 3-4 (2002).</li><li>Pan, Y. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrabow:+multispectral+cell+labeling+for+cell+tracing+and+lineage+analysis+in+zebrafish.">Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish.</a> Development. 140, 2835-2846 (2013).</li><li>Vieira, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Journal of dental research. 87, 119-125 (2008).</li><li>Le Pabic, P., Ng, C., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat-Dachsous+Signaling+Coordinates+Cartilage+Differentiation+and+Polarity+during+Craniofacial+Development.">Fat-Dachsous Signaling Coordinates Cartilage Differentiation and Polarity during Craniofacial Development.</a> PLoS genetics. 10, e1004726 (2014).</li><li>Ricks, J. E., Ryder, V. M., Bridgewater, L. C., Schaalje, B., Seegmiller, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+mandibular+development+precedes+the+time+of+palate+closure+in+mice+homozygous+for+disproportionate+micromelia:+an+oral+clefting+model+supporting+the+Pierre-Robin+sequence.">Altered mandibular development precedes the time of palate closure in mice homozygous for disproportionate micromelia: an oral clefting model supporting the Pierre-Robin sequence.</a> Teratology. 65, 116-120 (2002).</li><li>Javidan, Y., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cartilage+and+bone.">Development of cartilage and bone.</a> Methods in cell biology. 76, 415-436 (2004).</li><li>McCarthy, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pdgfra+protects+against+ethanol-induced+craniofacial+defects+in+a+zebrafish+model+of+FASD.">Pdgfra protects against ethanol-induced craniofacial defects in a zebrafish model of FASD.</a> Development. 140, 3254-3265 (2013).</li></ol>

Alcian blått og photoconvertible transgene linjer som beskrevet ovenfor utfyller hverandre for å definere innviklet prosess av brusk og bein utvikling. Imidlertid har levende cellemigrasjon og organisasjon under organ lenge vært en teori og indirekte demonstrert men aldri visualisert. Zebrabow-M transgen linje kombinert med en brusk bestemt Cre tillater samtidig levende observasjon av alle disse forskjellige arrangementer som er involvert i bein og brusk formasjon. Denne teknikken gjør det mulig å studere nedre kje...

Kraniofaciale utvikling krever kompliserte molekylære, cellulære og vev interaksjoner å kjøre celleproliferasjon, migrasjon og differensiering 1,2, 3. Denne tett regulert og komplisert prosess er gjenstand for genetiske og miljømessige forstyrrelser, slik at kraniofaciale misdannelser er blant de vanligste medfødte misdannelser 1-9. Mens kirurgiske inngrep forbli bærebjelke i behandling for kraniofaciale anomalier, forstå utviklingen basis er avgjørende for å skape fremtidige terapier. Derfor studerer morphogenesis og mekanismene i konvergens og forlengelse og celle integrasjon gir ny innsikt i dannelsen av det kraniofaciale skjelettet 1. Kranie neural crest migrere og fylle den første svelg bue, deretter danne sammenkoblede underkjevens prosesser som strekker seg for å danne Meckels brusk, som et forvarsel om kjeven. Morphogenesis of Meckels brusk krever kondrocytt organisasjon via retnings spredning, celle polarisering og differensiering 1,10. Men intricacy av kondrocytt organisasjon i vekst og utvidelse av Meckels brusk er fortsatt uklart. Forstå dynamisk celle atferd er avgjørende for å forstå medfødte misdannelser som påvirker mandibular størrelse, for eksempel hypoplastisk kjeven fenotyper 11. Sebrafisk embryo tilbyr mange utviklings og genetiske fordeler for detaljert studie av Meckels brusk morphogenesis. Deres genetiske tractability, åpenhet, ex vivo og rask utvikling er kraftige fordeler utlån det godt for observasjon av celle bevegelse og organisering av levende avbildning 6. Bruke avstamning-sporing verktøy, for eksempel sox10: kaede transgen linje, har vi og andre avgrenset neural crest opprinnelsen til embryonale kraniofaciale skjelettet 1,5. USIng sox10: ERT2-Cre med Ubi: Zebrabow-M transgen linje, er det nå mulig å utforske detaljer om cellulære bevegelser under kraniofaciale utvikling. Den Zebrabow-M, er en transgen linje konstruert med ubiquitin promoter driver uttrykk for forskjellige fluorophores, hver flankert av Lox nettsider 8. Den Zebrabow-M standard fluorophore er Red, uttrykker RFP. Etter induksjon av Cre uttrykk, Zebrabow-M konstruere recombines og celler uttrykker en kombinasjon av ulike fluoroforer (RFP, CFP og YFP) skaper multispektrale uttrykk i embryoet. Alle dattercellene som deler fra de merkede cellene etter rekombinasjon arrangementet blir så clonally merket, slik at cellepopulasjoner som stammer fra ulike sidestilte stamfedre er clonally merket. Ved denne celle kloning merking, kan cellene proliferasjon og migrering med klonal oppløsning følges (figur 1 og 2).

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Pronase</td>
			<td>Roche Life Sciences</td>
			<td>10165921001</td>
			<td>Prepare 500 &#956;L stock aliquots at 50mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methylcellulose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M0262</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PTU (N-Phenylthiourea)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P7619</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tricaine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>E10521</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-HydoxyTamoxifen</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T176</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 x 60 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-548-5P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>18 x 18 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25 x 25 coverslips</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-540C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR5&#39;-TOPO TA Cloning Kit</td>
			<td>Life technologies&#160;</td>
			<td>K591-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR/D-TOPO Cloning Kit&#160;</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>K2400-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pENTR3&#39;-pA</td>
			<td>Tol2Kit</td>
			<td>302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pDEST</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Gift from Geoffrey Burns labs</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipments</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bright field microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscope&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image processing software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

visualization of chondrocyte intercalation and directional proliferation via zebrabow clonal cell analysis in the embryonic meckel&#8217;s cartilage

Utvikling av virveldyr kraniofaciale strukturer krever nøyaktig koordinering av celle migrasjon, spredning, heft og differensiering. Mønstring av Meckels brusk, en første svelget bue derivat, innebærer migrasjon av kranie neural crest (CNC) celler og progressive partisjonering, spredning og organisering av differensierte chondrocytes. Flere studier har beskrevet CNC migrasjon under underkjeven morphogenesis, men detaljene om hvordan kondrocyttene oppnå organisasjon i vekst og utvidelse av Meckels brusk er fortsatt uklart. Den sox10 begrenset og kjemisk indusert Cre rekombinase-mediert rekombinasjon genererer permutasjoner av ulike fluorescerende proteiner (RFP, YFP og CFP), og dermed skape en multi-spektral merking av stamceller og deres avkom, som gjenspeiler forskjellige klonale populasjoner. Ved hjelp av konfokal time-lapse fotografering, er det mulig å observere chondrocytes behavieller under utviklingen av sebrafisk Meckels brusk. Multispektrale celle merking gjør det mulig for forskere å demonstrere forlengelse av Meckels chondrocytter. I forlengelse av Meckels brusk, som et forvarsel om kjeven, chondrocytes intercalate å gjennomføre utvidelsen som de stakk i en organisert encellede lagdelte rad. Unnlatelse av dette organisert interkalerende prosess for å megle celle forlengelse gir mobil mekanistisk forklaring for hypoplastisk kjeven at vi observerer i underkjevens misdannelser.

Tradisjonell brusk visualisering av hele mount Alcian blå flekker har vært uvurderlig i å observere utviklingen Meckels brusk og vanligvis brukes til å visualisere slutt cellular organisasjon 12 (figur 1A). For ytterligere å analysere utviklings chondrocytes overtid, avstamning sporing ved hjelp sox10: Kaede transgene linjer har gitt oss mulighet til å studere cellemigrasjon, konvergens og forlengelse i levende embryoer 2,12 (Figur 1b). Men fortsatt ...

Watch this Scientific Journal Video about Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃ¢â‚¬â„¢s Cartilage at JoVE.

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic MeckelÃƒÂ¢Ã¢â€šÂ¬Ã¢â€žÂ¢s Cartilage

Cell organisering av kraniofaciale bein har lenge vært en teori, men aldri direkte visualisert. Multispektral celle merking og in vivo levende bildebehandling tillater visualisering av dynamisk celle atferd i sebrafisk underkjeven. Her, til vi detalj protokollen manipulere Zebrabow transgen fisk og direkte observere celle innskyting og morfologiske endringer av chondrocytes i Meckels brusk.

Visualisering av chondrocyttransplantasjon innskyting og Directional spredning via Zebrabow Klonal Cell Analysis i Embryonic Meckels Brusk

Development of the vertebrate craniofacial structures requires precise coordination of cell migration, proliferation, adhesion and differentiation. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Visualization of Chondrocyte Intercalation and Directional Proliferation via Zebrabow Clonal Cell Analysis in the Embryonic Meckel&#8217;s Cartilage

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse av Sebrafisk Larver Skeletal Muscle Integrity med Evans blå Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Analyse av koronarkar i Slettet embryonale Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

A 5-mC Dot Blot Assay Quantifying the DNA Methylation Level of Chondrocyte Dedifferentiation In Vitro

En 5-mC prikkblot-analyse Kvantifisering av DNA-metyleringsnivået av kondrocyt-diffusjon<em&gt; I Vitro</em

The dedifferentiation of hyaline chondrocytes into fibroblastic chondrocytes often accompanies monolayer expansion of chondrocytes in vitro. The global ...

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Visualisering og kvantitativ analyse av embryonisk angiogenese i<em&gt; Xenopus tropicalis</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Bioengineering of Humanized Bone Marrow Microenvironments in Mouse and Their Visualization by Live Imaging

Bioengineering av humaniserte benmarg mikromiljøer i mus og deres visualisering av levende bildebehandling

Human hematopoietic stem cells (HSCs) reside in the bone marrow (BM) niche, an intricate, multifactorial network of components producing cytokines, growth ...

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

Klonal analyse av embryonale stamcelleforskningen blodkreft forløpere bruke enkeltcelle indeks sortering kombinert med endotelial celle nisje co kultur

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum

Visualisering av tangentiell celle migrasjon i utviklingsland Chick fiberoptisk Tectum

Time-lapse imaging is a powerful method to analyze migrating cell behavior. After fluorescent cell labeling, the movement of the labeled cells in culture ...

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

I Vitro analyser evaluere overføringen, invasjon og spredning av udødeliggjort menneskelige første trimester Trophoblast linjer

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Microinjection-basert System for i Vivo implantering av embryonale Cardiomyocytes i Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...